JP2013517854A - 人間又は動物の器官を再構成するための縫合可能な組織移植片構造 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)生体に適合する、コラーゲンを含む少なくとも一つの第一の皮膜と、生体に適合する、コラーゲンを含む少なくとも一つの第二の皮膜とで構成される皮膜結合体であって、第一の皮膜と第二の皮膜の平坦な側面が互いに接しており、第一の皮膜が馬又は牛を起源とし、第二の皮膜が動物又は人を起源とし、第二の皮膜の起源が第一の皮膜と異なる、一つの皮膜結合体と、
(b)この皮膜結合体の片方又は両方の外側の平坦な側面上の粘膜組織細胞の一つ以上の層と、
から構成される組織移植片構造を規定する。
(a)生体に適合する、コラーゲンを含む少なくとも一つの第一の皮膜と、生体に適合する、コラーゲンを含む少なくとも一つの第二の皮膜とで構成される皮膜結合体であって、第一の皮膜と第二の皮膜の平坦な側面が互いに接しており、第一の皮膜が馬又は牛を起源とし、第二の皮膜が動物又は人を起源とし、第二の皮膜の起源が第一の皮膜と異なる皮膜結合体を製造する工程と、
(b)この皮膜結合体の片方又は両方の外側の平坦な側面上に粘膜組織細胞の一つ以上の層を成長させる工程と、
を有する。
(a1)二つの第一の皮膜を準備して、これらの第一の皮膜をふやけた状態に移行させる部分工程、
(a2)第二の皮膜を準備して、この第二の皮膜を乾燥凍結させる部分工程、
(a3)二つの第一の皮膜の間に第二の皮膜を配置する部分工程、
(a4)第一の皮膜と第二の皮膜から成る結合体を製造する部分工程。
a)泌尿器再構成時における自己由来の口の粘膜細胞の使用
尿道狭窄及び尿管狭窄は、その器官が狭まることであり、炎症、瘢痕組織、留置カテーテル、器具の取付、外傷、手術によって起こる。そのような場合、瘢痕組織が正常な尿道又は尿管の上皮組織に置き換わってしまう。切開する尿道整形手術と尿管整形手術は、尿道狭窄及び尿管狭窄の標準的な治療法と見做されている。口の粘膜移植片は、泌尿器の最も有望な代用物として認められている。しかし、口の部位に関するドナー部位罹病率は主要な関心事である。
スチーブンス・ジョンソン症候群及び眼の瘢痕による類天疱瘡などの症状によって起こる眼表面の重大な病気は、症状が著しく目に見える破滅的な状態となる可能性が有る。そのような場合、角膜の縁の上皮幹細胞が壊れ、そのことは、角膜表面への周囲の結膜の侵襲、新生血管形成、慢性の炎症、繊維組織の成長、並びに基質瘢痕化を引き起こす。そのような患者では、従来の角膜移植は酷い結果となる。培養した角膜上皮幹細胞の移植などのそれに代わる方法が提示された。その手法では、片目の角膜を損傷した患者は、健康な対側性の眼から取得した角膜上皮幹細胞を培養した移植片を移植された。しかし、その眼の健康は、主要な関心事である。両目を損傷した患者では、死んだドナー又は生きているドナーの眼の角膜上皮幹細胞を培養した移植片が必要である。幾つかの成功例にも関わらず、免疫による拒絶反応と、同種移植後の免疫抑制治療の結果としての病原菌の感染及び誘発とが起こっている。再生医療という意味において、自己由来の細胞源から生成して培養した粘膜上皮幹細胞膜の移植は、自己由来の角膜上皮幹細胞を使用できない両目を損傷した場合の発展可能な代替策である。口の粘膜細胞は、細胞源として注目されており、動物と人に採用する試験的研究において、肯定的な成果を得た。この方法は、移植に対する拒絶反応のリスクと長期間のステロイド投与又は免疫抑制の必要性とを低減する(非特許文献10と11参照)。角膜又は口の上皮細胞を培養するための現在の有利な方法は、機械的に不安定な材料、大抵は羊膜の皮膜を使用する必要が有る(上記の非特許文献10と11参照)。羊膜の皮膜を使用する場合にも、帝王切開した女性の同種の胎盤が必要であり、そして、そのような材料は乏しい。この問題は、同じく死体の材料を必要とするEVPOMEなどのその他の提案されている口の粘膜細胞構造の場合でも起こっている(非特許文献12参照)。
無細胞の基質が動物をモデルとする食道整形手術で使用された。しかし、それは、完全に上皮を形成するには至らなかった。従って、改善された再構成のためには、細胞の構成要素が必要である。動物のモデルでは、無細胞の小腸粘膜下組織上に口の粘膜上皮細胞を使用することが、約5cmの短い食道欠陥を再構成する場合に多くの有望な成果を示した。しかし、小腸粘膜下組織の乾燥凍結させた形状のために、皮膜の長い区画上で細胞を複数の層に培養することは常に可能であるとは限らない(非特許文献13参照)。それ以外に報告されている、コラーゲンから成る食道整形手術用皮膜も、人に使用するには機械的に不安定過ぎる(非特許文献14参照)。ポリL乳酸(PLLA)、乳酸グリコール酸共重合体(75:25)(PLGA75)、乳酸グリコール酸共重合体(50:50)(PLGA50)及びポリカプロラクトン/ポリL乳酸(50:50)(PCL/PLLA)などの別の食道整形手術用合成材料は、食道に関する組織化技術には適していないことが分かった(非特許文献15参照)。
口のケラチノサイトは、複数の独特の特徴を持っており、表皮(皮膚)のケラチノサイトと比べて利点を提供する可能性が有る。口のケラチノサイトは、表皮のケラチノサイトよりも増殖速度が速く、最終的な分化速度が遅い。そのために、体外増幅を用いた比較的小さいドナー部位が、非常に大きな傷口を覆うのに十分な細胞量を提供することができる。更に、口のケラチノサイトは、移植部位との速い統合を促進するVEGFやIL8などの血管新生促進因子を分泌する。従って、口の粘膜細胞は、皮膚再構成に適した候補であることが分かった(非特許文献16参照)。この再構成の欠点は、前述した通り、死人の材料を使用することである。
二つの第一の皮膜と一つの第二の皮膜を備えた皮膜結合体を製造し、これらの二つの第一の皮膜の間に第二の皮膜を配置した。
1.1:馬の皮膜/豚の小腸粘膜下組織/馬の皮膜
1.2:牛の皮膜/豚の小腸粘膜下組織/牛の皮膜
本発明による粘膜移植片として使用される組織移植片構造を製造するために、実施例1により製造した皮膜結合体(皮膜結合体1.1又は皮膜結合体1.2)に粘膜ケラチノサイトを植付けた。そのために、直径2〜4mmの生検サンプルを40人の患者の頬の粘膜から採取した。更に、それらの患者の静脈完全血サンプルから、30mlの自己由来の血清を抽出した。これらの主要培養物は、通常の通り(非特許文献17参照)添加剤と自己由来の血清を含む(ドイツ国エッゲンシュタインのギブコ社の)ダルベッコ改良型イーグル培地と必須栄養素F12内で三週間周知の手法(非特許文献18参照)で培養した。次に、口の粘膜細胞の複数の層を有する粘膜移植片を構成するために、実施例1で得た皮膜結合体上で継代培養した。
2.1:粘膜組織細胞から成る一つ以上の層/馬の皮膜/豚の小腸粘膜下組織/馬の皮膜/粘膜組織細胞から成る一つ以上の層
2.2:粘膜組織細胞から成る一つ以上の層/牛の皮膜/豚の小腸粘膜下組織/牛の皮膜/粘膜組織細胞から成る一つ以上の層
実施例2と同じ手法で、実施例1で得られた皮膜結合体の両側の平坦な側面に異なる培養細胞を植付けた。この場合、各皮膜結合体の一方の外側の平坦な側面にケラチノサイトを培養する一方、皮膜結合体の他方の平坦な側面上では、口の組織の線維芽細胞と粘膜組織の内皮細胞の混合物を培養した(細胞のソース:口の粘膜組織の生検;口の線維芽と内皮細胞の混合比率1:3)。皮膜結合体の一方の平坦な側面へのケラチノサイトの植付けに続いて、30分後に、この混合物の母集団を皮膜結合体の他方の平坦な側面上に展開した。その他の点は、実施例2の細胞を培養する方法の工程と同じであった。
2.1:ケラチノサイトから成る一つ以上の層/馬の皮膜/豚の小腸粘膜下組織/馬の皮膜/口の線維芽と内皮細胞の混合物から成る一つ以上の層
2.2:ケラチノサイトから成る一つ以上の層/牛の皮膜/豚の小腸粘膜下組織/牛の皮膜/口の線維芽と内皮細胞の混合物から成る一つ以上の層
比較のために、実施例2と実施例3に記載した培養細胞を比較用皮膜上に展開した。比較用皮膜として、i)豚の小腸粘膜下組織、ii)馬の皮膜(商品名「ティッシュフォイル」)及びiii )牛の皮膜(商品名「マトリダーム」)を使用した。これらの比較用皮膜は、皮膜結合体を製造しなかったこと以外、実施例1で使用した第一又は第二の皮膜と同じである。細胞の培養条件は、実施例2と同じとした。未処理の馬の皮膜(ティッシュフォイル)又は牛の皮膜(マトリダーム)上の細胞の成長が、実施例2で記載した本発明による皮膜結合体上での培養プロセスと同様であったことを確認する一方、皮膜として小腸粘膜下組織を使用した場合、細胞の生存率が約70%で、繁殖能力が10%を下回り、より小さい皮膜カバー率(約50%)を観測したことを確認した。
i)粘膜組織細胞から成る一つ以上の層/豚の小腸粘膜下組織/粘膜組織細胞から成る一つ以上の層
ii)粘膜組織細胞から成る一つ以上の層/馬の皮膜/粘膜組織細胞から成る一つ以上の層
iii )粘膜組織細胞から成る一つ以上の層/牛の皮膜/粘膜組織細胞から成る一つ以上の層
細胞の植付けから48時間後に、実施例2と比較実施例1で製造した組織移植片構造の安定性と抗張力を調査した。実施例2で製造された本発明による組織移植片構造が、裂けることがないと同時に、優れた縫合可能性、抗張力、糸引張強度、撚目形成強度を示すことを確認した。比較実施例1により製造した小腸粘膜下組織による比較構成は、同様の機械的な安定性を示した。同様に比較実施例1により製造した馬の皮膜(ティッシュフォイル)と牛の皮膜(マトリダーム)による比較構成は、低い機械的な安定性と、糸引張処理又は撚目形成時に引っ張ると容易に裂けることが分かった。
図4に図示された皮膜結合体1は、図1に図示された皮膜結合体と比べて、一つの第一の皮膜2だけを有する。従って、第二の皮膜の一方の平坦な側面だけが覆われている。図5に図示された皮膜結合体1は、図1に図示された皮膜結合体と比べて、複数の層から成る第二の皮膜13を有する。それらの点を除いて、これらの構成とこれらの皮膜結合体の製造方法は、実施例1と同じである。
2 第一の皮膜
3 第二の皮膜
4 粘膜組織細胞から成る層
5 組織移植片構造
6 ケラチノサイトから成る層
7 口の線維芽と内皮細胞の混合物から成る層
13 複数の層から成る第二の皮膜
15 組織移植片構造
Claims (14)
- 人間又は動物の器官を再構成するための組織移植片構造において、
(a)生体に適合する、コラーゲンを含む少なくとも一つの第一の皮膜(2)と、生体に適合する、コラーゲンを含む少なくとも一つの第二の皮膜(3)とで構成される皮膜結合体(1)であって、第一の皮膜(2)と第二の皮膜(3)の平坦な側面が互いに接しており、第一の皮膜(2)が馬又は牛を起源とし、第二の皮膜(3)が動物又は人を起源とし、第二の皮膜(3)の起源が第一の皮膜(2)と異なる、一つの皮膜結合体と、
(b)この皮膜結合体(1)の片方又は両方の外側の平坦な側面上の粘膜組織細胞の一つ以上の層(4,5,6)と、
から構成される組織移植片構造。 - 皮膜結合体(1)が二つの第一の皮膜(2)と一つの第二の皮膜(3)から構成され、この第二の皮膜(3)が二つの第一の皮膜(2)の間に配置されていることを特徴とする請求項1に記載の組織移植片構造。
- 第一の皮膜(2)が馬又は牛を起源とし、第二の皮膜(3)が豚を起源とすることを特徴とする請求項1又は2に記載の組織移植片構造。
- 第一の皮膜(2)が、コラーゲンの外に、フィブロネクチンも含むことを特徴とする請求項1から3までのいずれか一つに記載の組織移植片構造。
- 皮膜結合体(1)の第一と第二の皮膜(2,3)が、互いに圧縮された皮膜か、互いに架橋された皮膜か、或いは互いに圧縮され架橋された皮膜であることを特徴とする請求項1から4までのいずれか一つに記載の組織移植片構造。
- 当該の粘膜組織細胞が自己由来の粘膜組織細胞であることを特徴とする請求項1から5までのいずれか一つに記載の組織移植片構造。
- 当該の粘膜組織細胞が自己由来の口の粘膜組織細胞であることを特徴とする請求項1から6までのいずれか一つに記載の組織移植片構造。
- 組織移植片構造のための皮膜結合体において、
生体に適合する、コラーゲンを含む少なくとも一つの第一の皮膜(2)と、生体に適合する、コラーゲンを含む少なくとも一つの第二の皮膜(3)とで構成され、
第一の皮膜(2)と第二の皮膜(3)の平坦な側面が互いに接しており、
第一の皮膜(2)が馬又は牛を起源とし、第二の皮膜(3)が動物又は人を起源とし、第二の皮膜(3)の起源が第一の皮膜(2)と異なる、
皮膜結合体。 - この皮膜結合体が二つの第一の皮膜(2)と一つの第二の皮膜(3)から構成され、この第二の皮膜(3)が二つの第一の皮膜(2)の間に配置されていることを特徴とする請求項8に記載の皮膜結合体。
- 皮膜結合体(1)の第一と第二の皮膜(2,3)が、互いに圧縮された皮膜か、互いに架橋された皮膜か、或いは互いに圧縮され架橋された皮膜であることを特徴とする請求項8又は9に記載の皮膜結合体。
- 請求項1から7までのいずれか一つに記載の組織移植片構造の製造方法において、
(a)生体に適合する、コラーゲンを含む少なくとも一つの第一の皮膜(2)と、生体に適合する、コラーゲンを含む少なくとも一つの第二の皮膜(3)とで構成される皮膜結合体(1)を製造する工程であって、第一の皮膜(2)と第二の皮膜(3)の平坦な側面が互いに接しており、第一の皮膜(2)が馬又は牛を起源とし、第二の皮膜(3)が動物又は人を起源とし、第二の皮膜(3)の起源が第一の皮膜(2)と異なる工程と、
(b)この皮膜結合体(1)の片方又は両方の外側の平坦な側面上に粘膜組織細胞の一つ以上の層(4)を形成する工程と、
を有する方法。 - 当該の工程(a)が、
(a1)二つの第一の皮膜(2)を準備して、これらの第一の皮膜(2)をふやけた状態に移行させる部分工程と、
(a2)第二の皮膜(3)を準備して、この第二の皮膜(3)を乾燥凍結させる部分工程と、
(a3)二つの第一の皮膜(2)の間に第二の皮膜(3)を配置する部分工程と、
(a4)第一の皮膜(2)と第二の皮膜(3)から成る結合体(1)を製造する部分工程と、
で構成されることを特徴とする請求項11に記載の方法。 - 第一と第二の皮膜(2,3)の圧縮と架橋の一方又は両方によって皮膜結合体(1)を製造することを特徴とする請求項11又は12に記載の方法。
- 皮膜結合体(1)の片方又は両方の外側の平坦な側面上に粘膜組織細胞を展開して、そこで培養することによって、一つ以上の層(4)を形成することを特徴とする請求項11から13までのいずれか一つに記載の方法。
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