JPH03148293A - コラーゲン型物質の架橋方法およびその生成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、蛋白質型物質を架橋して安定化させる方法に
関するものである。本発明は特に、コラーゲン型物質に
、光化学反応の触媒の存在下に光化学的酸化反応を行っ
て該物質を架橋し安定化させる方法に関する。本発明は
また、その結果得られる架橋生成物自体にも関する。

従来の技術 現在、蛋白質の架橋反応のために使用されている薬剤お
よび方法は一般に、蛋白質のマトリックス中に架橋剤を
入れて、蛋白質中のリジンやヒドロキシルリジンのε−
アミノ基または他の基に架橋反応を行うためのものであ
る。前記公知方法に通常使用されている薬剤の例にはホ
ルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒドがあげられる
。他の公知方法の例には、フタロイルジクロライドまた
はアジポイルジクロライドを使用して蛋白質中にフタロ
イル基またはアジポイル基を入れることからなる方法が
あげられ、さらにまた、メルカプタンを導入し、これを
酸化反応によってジスルフィド結合に変換させることか
らなる方法もあげられる。

前記のごとき架橋方法の多くは、蛋白質の内部または周
縁部に薬剤を導入することを包含するものである。たと
えばチェングおよびニムニの論文（ｒ　Ｃｏｎｎｅｃ、
　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｒｅｓ、　」第１０巻第２０１頁（１
９８２年）、および同誌第１３巻第１０９真（１９８４
年）〕には、架橋剤であるグリタルアルデヒドに関する
データが開示されており、そしてこのデータによれば、
該架橋剤を使用してコラーゲンフィブリル等を処理した
場合には、該フィブリルの周囲に重合体型の被膜が生じ
、コラーゲンのマトリックスが一層固くなることが記載
されている。

これとは反対に、本発明に係る架橋方法によれば、架橋
すべき物質中への架橋剤の導入は行われず、また、被処
理物質への架橋剤による被覆形成も行われない。本発明
方法では、酸化架橋反応用の触媒または助触媒としての
活性を有しそして反応後の架橋生成物から除去できるよ
うな光酸化反応性染料が使用される。

種々の光酸化反応における光酸化反応用触媒の使用方法
は種々の文献に記載されており、たとえば、レイの論文
（ｒ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　」第１
１巻第４９０頁（１９６７年）〕、ウウェストヘラの論
文（ｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ第４巻第１０頁（１９６
５年）〕、レイおよびコシュランド、ジュニアの論文〔
「Ｊ。

Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　　ＣｈｅＩｌｌ、」第１８巻第
４０９頁（１９６７年）〕、およびフツーの論文［’　
５ｃｉｅｎｃｅ］第１６２巻第３８５７頁（１９６８年
）〕に記載されている。

しかしながらこれらの文献は蛋白質型物質の架橋方法に
おける該触媒の使用に関するものではない。

たとえば前記のレイおよびコシュランド、ジュニアの論
文には、メチレンブルーおよび光線を用いてホスホグル
コムターゼ酵素の光化学的酸化反応を行い、これによっ
てアミノ酸を選択的に破壊し、そしてこの実験によって
、該酵素の活性化のための必須成分である蛋白質のアミ
ノ酸残基を同定することが記載されている。また、前記
のウェストヘッドの論文には、イーストエノラーゼのヒ
スチジン残基を、ローズベンガル染料を用いて光化学的
に酸化することによってイーストエノラーゼを不活性化
することが記載されている。

光線照射による染料の励起現象はまた、蛋白質への該染
料の結合のために利用され、しかしてこの場合は共有結
合が生じる〔ブランド等、ｒ　Ｂｉｏｃｈｅ−ｍｉｓｔ
ｒｙ」第１３巻第４７５８頁（１９７４年）〕。

この技術を利用して蛋白質の光化学的ラベリング方法が
開発されたが、これを、“染料で増感された光化学的ラ
ベリング方法゛と称する〔ブランド等、ｒＡｎａｌ、　
Ｂｉｏｃｈｅｍ、」第９３巻第６０１頁（１９８０年）
〕。

該方法は蛋白質型の膜成分の分子配列の研究の際に有利
に利用でき〔同誌〕、さらにまた、蛋白質の構造（配座
）の研究のために利用できる〔ヘメンドルフ等、ｒＢｉ
ｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａｊ第６６７
巻第１５頁（１９８１年）〕。しかしながら該方法は、
蛋白質のマトリックス中の分子間架橋結合および／また
は分子内架橋結合の形成のために有用な方法ではない。

米国特許第３，１５２．９７６号明細書には、熱安定性
を有しかつ不可逆的に架橋されたコラーゲン型重合体を
、染料を触媒として製造する方法が開示されている。該
米国特許明細書には、該方法によって製造された生成物
の特徴は、従来のタンニング法によって得られた生成物
に若干の物理化学的性質が似ていることであると記載さ
れている。しかしながら、該方法によって得られた生成
物が、従来のタンニング法によって得られた生成物と同
様な性質を有するものであるという該米国特許の発明者
の主張は、該明細書中の実験データによって支持された
ものではない。従来のタンニング法によって得られた生
成物は有用な生物学的物質であって、血管補修用の“人
工血管°゛、心臓の弁、心臓用バッチ材、注入可能コラ
ーゲン、および、靭帯や朧の代替物等として使用できる
。さらに、前記米国特許明細書には、当該生成物は酵素
によって減収され易く、この傾向は非架橋コラーゲンの
場合より一層著しい旨が記載されている。該性質は明ら
かに、該生成物を心臓の弁として使用する場合に、都合
の悪い性質である（該米国特許明細書中の実施例■の記
載からみて、このような心臓の弁は、穏和な蛋白質分解
酵素であるパパインによって数時間以内に、あるいは極
端な場合には数秒以内に分解されてしまうであろう）。

該米国特許の発明は、外科手術の際に体内で使用でき、
しかも其後に体内から除去する必要のない繊維材（たと
えば縫合糸）やスポンジのごとき有形物品の製造を第１
番目の目的として完成されたものであると考えられる。

さらに、前記の米国特許第３．１５２．９７６号明細書
に記載の実験結果は、当該方法の詳細な吟味によって理
解できる。該明細書には、該方法に使用される出発物質
を、コラーゲン型物質を酸の水溶液中に分散させて調製
する旨が開示されている。周知のごとく、酸は、コラー
ゲンのフィブリルを構成する蛋白質を変成（ｄｅｎａｔ
ｕｒｉｎｇ）させる性質を有する。コラーゲンフィブリ
ルを構成する蛋白質は三次元的構造を有し、これによっ
てフィブリルはコラーゲンの独得な性質を保っている。

酸との反応によって該構造は変化し、該蛋白質はもはや
、該性質の維持のために必要な態様で相互作用をなすこ
とが不可能になる。また、該明細書中に記載された実験
結果は、Ｐ、Ｈ，フォノ、ヒブレの学説によっても説明
できる〔「ストラクチュラル、アンド、スタビリゼーシ
ョン、オプ、ザ　コラーゲン。

モレキュール、イン、ソリューション」（「トリーデイ
ズ、オン、コラーゲン」、第１巻、「ケξストリ、オブ
、コラーゲンＪ　、Ｇ、Ｎ、ラマチャンドラン編、アカ
デ主ツタ出版社（ロンドン）発行、１９６７年、第２５
３頁−第３３８頁、特に第２６２頁）〕。ヒプレの論文
には、酸や中性塩を用いる処理によって抽出されたコラ
ーゲン分子はかなり異なり、すなわち、これは共有結合
で架橋されており、寸法、形態、相互作用、繊維形成率
が異なると記載されている。予備実験のデータに基いて
著者は、前記の結果は他の研究者によって報告され、差
異は認められなかったと述べているが、其後の実験の結
果、差異があることが判明した。

従来の技術からみれば意外なことであるが、光化学的反
応触媒および充分な量の酸素の存在下かつｐＨおよび温
度条件の制御下に、蛋白質に光化学的酸化反応を行うこ
とによって、従来のタンニング法の場合と同様にマトリ
ックスを硬化することなくコラーゲンを架橋しかつ安定
化させることができることが、今や発見された。

発明の目的 本発明の目的は、蛋白質型物質を架橋し、非特異性架橋
結合を結成させる効果的な方法を提供することである。

本発明における別の目的は、安定な架橋生成物を提供す
ることである。

本発明のさらに別の目的は、人工膜、心臓の弁または囲
心嚢のパッチ材等として使用できる生体用材料として有
利に利用できる物理、化学的性質を有するコラーゲン型
生底物、およびその製法を提供することである。

本発明のさらに別の目的は、哺乳動物の体内に移植され
たときに、抗原性を示さない生成物、およびその製法を
提供することである。

本発明のさらに別の目的は、哺乳動物の体内の移植され
たときに石灰化しない生成物、およびその製法を提供す
ることである。

本発明のさらに別の目的は、哺乳動物の体内に移植され
たときに細胞毒とならず、かつ当該生成物上に内皮細胞
が生長できるような生成物、およびその製法を提供する
ことである。

本発明のさらに別の目的および効果は、本明細書中の説
明、実施例および特許請求の範囲の記載から、当業者に
明らかになるであろう。

発明の構成 本発明方法は次の段階がらなり、すなわち、（ｉ）架橋
すべき物質を、緩衝剤を含有しかつ高い浸透圧モル濃度
を有する水性液に浸漬し：（ｉｉ）前記物質の酸化によ
って分子間架橋結合および分子内架橋結合を生成させる
のに充分な量の光化学的酸化反応用触媒を含有する水性
液中で前記物質を保持（ｉｎｃｕｂａｔｉｎｇ）する操
作を行い；（ｉｉ）前記工程（ｉ）に記載の物質および
触媒に光線を照射し、該光線は、触媒によって選択的に
吸収される範囲の波長の光を含む光線であることを特徴
とするものである。光線照射は所定の温度およびｐＨ条
件のもとで、かつ所定の酸素濃度において行われる。こ
れらの条件は、前記物質が架橋されるように設定される
。本発明はまた、前記方法によって製造された生成物、
すなわち架橋された蛋白質型土ｒｆｔ、物にも関する。

本発明方法によれば、病気または損傷した体内の組織の
交換および／または補修（外科学的処置）の際に有利に
使用できる架橋されかつ安定化された蛋白質型生成物が
製造できる。本発明の生成物は、その使用時に、従来の
生成物よりも一層すぐたれ適性をあられす。なぜならば
本生酸物は、処理前の該物質の機械的性質をそのまま保
っており、換言すれば、これはしなやかさおよびブレイ
ンド（ρ１ａｉｎｔ）性を保っている。本生酸物は非イ
ムノジェニック（ｎｏｎ　−ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ　ｉｃ
）性である。

本発明の生成物は安定であるから、外科的処置の際に有
利に使用できる。さらに、本発明に係る架橋生成物は、
生体内に移植したときに減成し難く、かつ石灰化し難い
。かように、本発明の架橋生成物は従来の生体用材料よ
りもはるかにすぐれている。従来の生体用材料は通常の
蛋白質分解作用および石灰化作用に弱く、充分な耐性を
有していなかった。

発明の詳細な説明 コラーゲンのごとき蛋白質と、生体内の組織のごとき蛋
白質含有物質との両者を包含して意味する用語である。

一般に、本発明方法において出発物質として使用される
蛋白質型物質は、所望生戒物の用途を考慮して選択され
、そしてこの理由のために、本発明方法はコラーゲン状
物質の架橋のために特に有用な方法であると思われる。

たとえば、本発明方法の生成物から心臓の弁を製作する
ことが所望される場合には、好ましい出発物質はコラー
ゲン含量の高い物質であり、その例には囲心嚢（たとえ
ば牛の囲心嚢）があげられる。人工血管として使用され
る架橋生成物を製造する場合には、出発物質として、ラ
ットまたは他の比較的小形の動物の大動脈弓へあるいは
豚、羊または牛の頚動脈を使用するのが有利である。注
射できるコラーゲンを製造する場合には、細かく破砕さ
れそして復原された（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ）牛
皮コラーゲンを使用するのが好ましい。このような出発
物質を供与動物から採取した直後に、冷い緩衝剤含有塩
水に浸漬して貯蔵し、この貯蔵を、本発明方法の操作の
開始前まで行い、あるいは、細粉の場合には、これを溶
解または懸濁させる。しかして、チロシン、トリプトフ
ァンおよび／またはヒスチジンを含有するコラーゲン型
物質が、本発明方法によって架橋操作を行うのに適した
物質である。

光化学的酸化反応を行うべき前記蛋白質型物質を其後に
水性媒質中に浸漬し、または分散し、または懸濁させ、
そして本発明方法の操作を行う。

前記の浸漬、分散または懸濁は、前記物質に対するそれ
以前の処理操作の考慮下に適宜実施できる。

蛋白質型物質の浸漬（ここに「浸漬」は、該蛋白質型物
質の懸濁および／または溶解を包含する用語である）の
ために適した媒質の例には、中性またはアルカリ性側の
ｐＨを有する水性または有機性の緩衝液があげられる。

ｐＨは６．５以上であることが好ましい。なぜならば酸
性側のｐＨでは変性するからである。特に好ましい媒質
は、ｐＨ約６．８−８．６の緩衝剤含有水性液である。

該媒質の具体例として、次のものがあげられる。

１、水または低イオン強度の緩衝液； ２、燐酸塩系緩衝剤を含有する塩水； ３、高イオン強度の緩衝液（μ＝１．７５−３．０）；
４、カリウムまたはナトリウムの燐酸塩もしくは塩化カ
リウムまたは塩化ナトリウムを含有する有機緩衝液、た
とえばグツドの緩衝液（たとえばリサーチ、オーガニッ
クス社製の“’ＢＥＳ’“’ＨＥＰＥＳ”または°“Ｔ
ＥＳ”）。

前記媒質はまた光化学反応触媒を含有し得る。

該触媒は、該媒質中に可溶なものであることが好ましい
。

本発明の特に好ましい具体例では、２種の媒質の溶液が
使用される。この場合には、コラーゲン型物質に光線照
射の前に予備処理（ｐｒｅｃｏｎｄ　ｉ　ｔ　ｔｏｎ　
ｉｎｇ）を行う。該物質の予備処理は、該物質を第１媒
質溶液中に浸漬することを包含する。次いで該物質を第
２媒質溶液中に入れ、光線照射を行う。このような操作
を行うことによって該物質は具合よく架橋され、たとえ
ば該物質の機械的性質が良くなり、かつ、蛋白質減成反
応が起りにくくなる。予備処理の効果は第１媒質溶液の
浸透圧モル濃度に左右されて種々変わる。第１媒質溶液
として、浸透圧モル濃度の〜高い溶液を使用するのが好
ましい。

特に好ましいものはナトリウム、カリウムまたは有機系
の緩衝液であり、その例には塩化ナトリウム、燐酸ナト
リウム、塩化カリウム、燐酸カリウムおよびグツドの緩
衝液があげられ、そのｐＨは約６、８−８．６である。

その浸透圧モル濃度は或種の溶質の添加によって増大で
き、該溶質の例には４Ｍ−サクロース、および他の可溶
性の高分子量炭水化物があげられる。この添加によって
、浸透圧モル濃度を約３９３　８００ｍｏｓｍに高める
ことができる。

浸透圧モル濃度の増大のために添加された溶質が光線照
射工程のときにも存在する場合には、該溶質が生成物の
架橋度に悪影響を与えることがあり得る。したがって、
第１媒質中で浸漬した後に、コラーゲン型物質を第１媒
質から分離し、第２媒質中に浸漬して光線照射を行うの
が好ましい。好ましい第２媒質はｐＨ約６．８−８．６
の水性緩衝液であって、その中に光化学反応用触媒を溶
解する。

好適な第２媒質は、ｐ）ｌ約７．４−　Ｂ、　Ｏ浸透圧
モル濃度約１５０−４ｌ５０−４Ｏ０特に好ましくは３
００±１０ｍｏｓｍ）の燐酸ナトリウムまたは燐酸カリ
ウム系緩衝液である。

架橋されるべき前記物質が、１片の生体組織、鍵または
囲心嚢のごときものである場合には、該試料を第１媒質
中に浸漬し、そして光化学的酸化反応の実施前に、触媒
を配合した第２媒質中に浸漬する。浸漬は充分な時間に
わたって行い、これによって、光線照射の実施前に前記
の物質（たとえば生体組＄ａ）、触媒（染料）および媒
質が平衡に達するようにする、媒質の濃度と、架橋すべ
き物質の濃度との比が約１０：ｌないし３０：１である
ときに、容易に平衡に到達し得る。該濃度比は一般に臨
界条件ではなく、所望に応じて高いまたは低い値に調節
できる。平衡に達するまでの所要時間は、媒！溶液の温
度、第１媒質の浸透圧モル濃度、前記物質（たとえば組
織または他の蛋白質型試料）の厚みのごとき条件に左右
されて種々変わるであろう。たとえば数分間から数日間
までの範囲内の時間が前記の“充分な時間パになり得る
が、一般に、大抵のコラ−ゲル型物質と媒質とを平衡に
到達させるために、数分間ないし数時間の範囲の時間で
充分であろう。

本発明方法に使用される触媒の適性は、一般に、該触媒
が励起状態（Ｔ）になるときの感度に左右されて種々変
わるであろう。励起状態になったときに、触媒は光増感
剤として作用する。其後に、基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ
）が電子の移動によって増感剤のＴ状態を下降させる。

これに関する研究によって、基質は最初にトリブレット
状態の触媒と反応し、この電子またはＨ原子移動反応に
よって第二反応性基が生ずることが見出されている。こ
れについては、スパイクおよびストレートの論文〔「＾
ｎｎ。

Ｒｅｖ、　Ｐｈｙｓ、　Ｃｈｅｗ、　Ｊ第１８巻第４０
９頁（１９６７年）〕を参照されたい。

本発明に使用される触媒は光化学的酸化反応用触媒（す
なわち光触媒）である。該触媒は励起時に電子または水
素原子を移動させ、これによって、酸素の存在下に基質
を酸化する。触媒の種類によって種々の結果が得られる
が、適当な触媒の例には、オスター等の論文（ｒ　Ｊ、
　Ａａ＋、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　Ｊ第８１巻第５０
９５頁−第５０９６頁（１９５９年）〕に記載の触媒が
あげられる。特に好ましい触媒として、メチレンブルー
、メチレングリーン、ローズベンガル、リボフラビン、
プロフラビン、フルオレセイン、エオシン、ピリドキサ
ルー５−ホスフェートがあげられる。

媒質中の触媒の濃度は種々の操作条件に左右されて種々
変わるが、−ｉに触媒の濃度は、架橋すべき物質の中に
確実に具合よく浸透し、該物質（すなわち蛋白質）の光
化学的酸化反応を促進できるような濃度であるべきであ
る。触媒の濃度はたとえば約０．０００１−０．２５％
（重量／容量）であり、好ましい濃度は約０．０１−０
．１％である。

蛋白質型生成物の架橋度および安定度を最高値に上げる
ために、次のごとく操作を行うべきであり、すなわち、
（１）光化学的酸化反応用触媒（たとえば染料）の濃度
を確実に所望値に保つために、触媒の使用前に触媒を反
応媒質中に完全に溶解させるべきである；（２）被処理
試料（たとえば組織または懸濁液）をその周囲の媒質と
平衡に保つべきである；（３）触媒溶液を濾過して種々
の寸法の粒子（薬剤の粒子を包含する）を除去すべきで
ある。

本発明方法は酸化反応工程を主工程として含むから、該
反応を完全に実施するために、酸化反応の実施時に酸素
を適切に供給しなければならない。

媒質中に充分な量の酸素を溶かすために、換言すれば、
酸素供給率の低下を避けるために、酸素濃度（媒質の周
囲の雰囲気中の酸素濃度で示す）は約２０％であること
が好ましいけれども、酸素濃度は０％より高く、かつ２
５％以下の範囲内の濃度であってよい。光線照射工程に
おける蛋白質型物質の維持温度に応じて、必要な酸素は
次の方法で供給でき、すなわち当該反応工程の実施中に
溶液、懸濁液または試料に、攪拌または他の混合操作を
行うことによって酸素を供給できる。光線照射の実施中
は媒質上の雰囲気中の酸素濃度を約５−２０％に保つの
が好ましい。該濃度（これは温度に左右されて種々変わ
る）はまた次の方法によって維持でき、すなわち、蛋白
質型物質への光線照射の実施中に、媒質中に空気を泡立
たせる操作を行うことができる。あるいは、２０％以上
の濃度が所望される場合には、媒質中に酸素含有混合物
を泡立たせる操作を行うことができる。

他の接触反応または動的反応の場合と同様に、前記反応
の実施時の温度が直接に反応速度に影響を与え、また、
媒質中の利用可能酸素の量にも影響を与える。ｐＨ約６
．８−７．４、浸透圧モル濃度３００±２０ｍｏｓｍの
種々の媒質を用いて実験を行った結果、媒質の温度を４
℃から５０℃に上げた場合には酸素濃度が約１１１−１
２ｐｐから約５　ｐｐｍに大体直線的関係で低下するこ
とが見出された。

本発明に係る染料触媒を用いる光化学的酸化反応は発熱
反応である。したがって、光線照射実施中は温度を大体
一定に保つことが好ましく、これによって、蛋白質型物
質の変性を防止でき、さらにまた、温度上昇に伴う媒質
からの酸素の離脱も回避できる。再循環浴を用い、ジャ
ケット付の反応器中の温度を所定値に保ち、反応室を、
制御された環境中に置く（たとえば冷蔵庫または冷却装
置の中に置く）のが一般に好ましく、これによって、操
作が所望通りに実施できる。既述のごとく、光化学的酸
化反応は一２℃ないし＋４０℃の温度において実施する
のが効果的である。好ましい温度は約０−２５℃である
。蛋白質型物質を構成する蛋白質の変性を避けるために
、反応温度は蛋白質の変性温度より下の温度であること
が好ましい。

さらにまた、反応温度は反応媒質の凝固点より上の温度
であることが好ましい。

前記の温度、ｐｉおよび酸素濃度条件の組合わせおよび
／またはその相互関係が光化学的酸化による架橋反応に
臨界的な影響を与えるものであることは、従来は全く知
られていなかったと思われる。

したがって、本発明方法の架橋工程では、蛋白質の熱変
性を避けるために温度を充分に低くし、さらにまた、コ
ラーゲンまたは他の蛋白質型物質の酸変性を避けるため
にｐＨを充分に高くするのが好ましい。さらにまた、媒
質中に浸漬した蛋白質型物質への光線照射のときに、媒
質中の酸素濃度を所望値に充分保ち得る程度に温度を低
く維持すべきである。

前記の溶液または懸濁液、すなわち試料を調製した場合
には、光線照射は第２媒質中で行う。光線照射は、温度
、光源との距離、照射エネルギー光線の波長、酸素濃度
、照射時間等を測定でき、および／または維持できるよ
うな制御可能な装置の中で行うのが好ましい。光化学的
酸化反応は、白熱灯の白色光または蛍光すなわち可視光
線、または触媒によって吸収される可視範囲の光を含む
光線を用いて実施できる。本発明では、家庭用電球、蛍
光電球および照明用電球のごとき光源を用いるのが有利
である。

蛋白質型物質の架橋反応のために使用される光線の強度
および照射時間は、種々の条件に左右されて種々変わる
であろう。これらの条件の例には、（１）蛋白質型物質
の種類および量；（２）生体組織である試料の厚み；（
３）蛋白質型物質と照射用光源との距離；（４）使用さ
れる触媒：（５）触媒の濃度；（６）光源の種類および
光線の強度があげられる。たとえば、照射時間は数秒程
度の短時間から約１６０時間程度の長時間までの範囲内
で種々変えることができる。光線の強度について述べれ
ば、・１またはそれ以上の光源が使用でき、強度は好ま
しくは約１５０ワツト以下であり、試料の表面から光源
までの距離は好ましくは約２．５　１２ｃｍである。蛍
光または低強度光を使用する場合には、照射時間を一層
長くすることが必要である。これらの条件は種々変える
ことができる。個々の場合における蛋白質型物質に対す
る光線の照射条件は、本明細書中の説明および実施例の
参照下に容易に決定でき、過度に大規模な予備実験を行
う必要はない。本発明の好ましい具体例では、光線の強
度および照射時間は、「ルーメン時」を単位として示す
のが便利である。通常の蛍光灯を光源として使用する場
合には、大抵の種類の蛋白質物質の架橋のために約１０
０−２０，０００ルーメン時の照射を行うのがよい。

本発明方法に従って触媒の存在下に蛋白質型物質の光化
学的酸化反応を行うことによって、該物質が架橋できる
が、これに関する若干の実験の結果を示す。光線照射後
の試料に、ドデシル硫酸ナトリウム中で（たとえば０．
１％）ポリアクリルアミドゲルの存在下で電気泳動実験
を行った結果、低分子量物質の量が減少しそして同時に
高分子量物質の外観を呈し、これによって、架橋結合の
存在が確認された。架橋された蛋白質型物質の加水分解
生成物にアミノ酸分析を行った。この分析では、メチオ
ニン、チロシンおよびヒスチジンの減少が認められた（
これらはすべて光化学的接触酸化反応によって破壊され
た）。しかしこの減少は必らずしも架橋結合の存在の証
拠とはいえない。

たとえば１．コラーゲンをＫＩ／Ｉ！溶液で処理した場
合には、チロシンおよびヒスチジンがその誘導体に変換
され、したがってこれらのアミノ酸は、架橋結合がない
場合でもアミノ酸プロフィルから実質的に消失する。こ
れは、ゲルの電気泳動パターンにおける変化部の欠如に
よって確認できる。

さらにまた、架橋結合の生成は、実施例中に記載の溶解
度および消化率測定試験によって確認できる。たとえば
、架橋されたコラーゲンは一般に不溶であり、したがっ
て溶解度測定試験によって架橋度を直接に知ることがで
きる。消化率測定試験では、蛋白質型物質を蛋白質分解
酵素（たとえばパパイン、トリプシン、ペプシンまたは
バタテリア質のコラ−ゲナーゼ）に混合して培養し、次
いで媒質（すなわち、生成物および酵素の培養のときに
使用された媒質）を分析して、架橋生成物から生じた可
溶性の：ｌｌｉ或生成物（分解生成物）の量を調べる。

該試験は一般に次のごとく行われ、すなわち、架橋生成
物（未消化物）および酵素に遠心操作を行ってペレット
化し、その上澄液を分析して減収生成物の量を調べるの
である。後者の試験方法は、光化学的酸化反応によるヒ
スチジン（アミノ酸の１種）の分解という点からみて特
に有用である。上澄液の分析によりヒスチジン含量を測
定し、このヒスチジン含量と、光化学的酸化反応によっ
て分解しないヒドロキシプロリンのごときアミノ酸の量
（上澄液中の量）とを比較する。

この比較は、架橋度の評価のための特に高感度の試験方
法である。前記の比較の結果は、ヒスチジンとヒドロキ
シプロリンとの比（ｈｉｓ／ｈｙｐ比）で表わすのが有
利であり、ｈｉｓ／ｈｙｐ比が高いことは、架橋効率が
高いことを意味する。

本発明方法は回分法、間欠法または連続法で実施できる
。光線照射後に、架橋された生成物に種々の処理を行っ
て生成物中の触媒、他の薬剤および不純物を除去するの
が有利であり、そして其後に該生成物を既述の用途〔た
とえば人工血管、心臓の弁の小片（ｌｅａｆｌｅｔ）等
〕に使用できる。なお、生成物の洗浄について述べれば
、たとえば、新鮮な緩衝液の中で何回も洗浄し、次いで
、水分の少なくとも一部をエタノール等で除去するのが
好ましい。洗浄の回数および洗浄液の所要量（容量単位
）は、蛋白質型物質である試料（たとえば生体ｍ織また
は懸濁試料）の量、および使用された触媒の濃度等に左
右されて種々変わるであろう。

実施例 本発明をさらに詳細に説明するために、次に実施例を示
す、しかしながら、本発明は決して実施例記載の範囲内
のみに限定されるものではないことが理解されるべきで
ある。

例１ １８℃において架橋されたコラーゲンフィブリル復元さ
れた純粋な牛皮の可溶性コラーゲンフィブリル（０，２
５ｇ）を混和し、次いで、メチレングリーンを０．０１
％（重量／容量）を含むｐＨ７，４の０．０２　Ｍ−燐
酸ナトリウム緩衝液０．（１６５１中に懸濁させた。１
８℃に保たれたジャケット付の水浴において、前記コラ
ーゲンフィブリルに光線照射を行った。温度の測定のた
めに、反応器に温度計を取付けた。１５０ワツトの照明
用電球２個を、懸濁液の表面から約６ｃｍ（２，４イン
チ）の距離の位置に取付けた。反応器の温度が上昇し始
めたが、これは多分、（１）発熱反応が開始されたこと
、および／または、（２）媒質中の触媒が光線のエネル
ギーを吸収し、懸濁液の温度が上昇したことを意味する
。

４時間にわたって光線を照射し反応を続けた。

温度は最初に最高４５℃に上昇したが、其後に下がり、
次いで反応期間巾約１８゛Ｃに保った。反応器を開放状
態にして大気と接触させながら反応混合物を烈しく攪拌
することによって、反応媒質中の酸素濃度を所望値に保
ち、すなわち、媒質中に充分な量の酸素が確実に存在す
るようにした。

上記の方法は、蛋白質型物質を架橋するための効果的な
方法であると認められた。コラーゲン生成物を６５℃に
加熱しない場合（該加熱は、自然に架橋した天然コラー
ゲンの変性および可溶化をもたらすであろう）、あるい
は１５℃においてペプシンで消化しない場合（該消化は
天然コラーゲンの可溶化をもたらす）には、これは実質
的に分解しない。さらに、このコラーゲン生成物の変性
は認められなかった。

例２ ０℃において架橋された純粋なコラーゲンフィブリル 例１の場合と同様な方法に従って次の操作を行った。復
元された純粋な牛皮のコラーゲンフィブリルを約０．２
５　ｇ含有する数個の試料を混和した。

メチレングリーン０．０１％（重Ｉ／容量）を含有する
ｐＨ１，４の０．０２　Ｍ−燐酸ナトリウム緩衝液０、
（１６５　ｆ中に該試料を懸濁させた。該懸濁液に光線
を照射する操作を、０℃の温度に保たれたジャケット付
の水浴中で行った。各懸濁液の表面から約６ｃｍ（２，
４インチ）離れた位置に設置された２個の照明用電球（
１５ワツト）を点灯し、反応を６時間以下の時間にわた
って行った。周囲の雰囲気中の酸素濃度を約２０％に保
ち、反応器を該雰囲気中に開口して保ち、かつ攪拌する
ことによって（例１参照）、反応器内の酸素濃度が充分
に所望値に維持できるようにした。

光線照射工程において、試料の光化学的酸化反応を歳時
間の後に停止し、ペプシンを用いて消化を行うことによ
って、架橋生成物の架橋度および安定度を調べた。どの
試料にも、著しい可溶化は全く認められなかった。１０
０℃における希酢酸処理、または１８℃におけるペプシ
ン５％の存在下の消化実験（酵素：基質）においても、
架橋コラーゲン生成物の減成は全く認められなかった。

例３ 復元された可溶性のコラーゲンフィブリルの架橋２才の
牛の皮から可溶性コラーゲンを抽出し、精製した。復元
された純粋な可溶性のコラーゲンフィブリルに光線照射
を例２記載の条件下に行った。触媒の使用量は０．０１
％または０．１％であり、照射時間は６時間、１６時間
、２４時間または４８時間であった。

前記の復元されたフィブリル試料を架橋した後に、室温
下に該試料０．４■を０．５Ｍ−酢酸０．２５ｍ１およ
びＯ，１Ｍ−）リスボレート緩衝液（ｐＨ８，６）０．
２５０ｍ１に溶解した。該緩衝液は４Ｍ尿素および５Ｄ
Ｓ（０，２％）を含むものであった。対照フィブリル試
料（非架橋試料）は、後者の２種の溶液に・０℃におい
て容易に溶解し、さらにまた、室温においては速やかに
溶解した。前記のコラーゲンの懸濁物は、６５℃に加熱
したときには不溶性を示した。これらの懸濁物の一部に
ＰＡＧＥ分析を行った。復元された可溶性のコラーゲン
フィブリル（非架橋物）の溶液は通常の電気泳動のパタ
ーンを示した。一方、前記の加熱された架橋フィブリル
の上澄液に電気泳動実験をゲル上で行った場合には、そ
の電気泳動パターンは極端に不鮮明で、肉眼でかろうじ
て認識できる程度のものであった。

前記の架橋反応の効果を調べるために、ペプシンおよび
コラゲナーゼで処理する実験を行った。

ペプシンによる消化に起因する可溶化はごく僅かであっ
た。コラゲナーゼ処理の後には若干の沈澱が残存した。

各処理の際に得られた上澄液および残留物を集め、その
一部に加水分解操作を行った。

上澄液の一部は除去してＰＡＧＥ分析を行った。

ペプシンを用いた消化実験で得られた残留物は６５℃に
おいて、既述のトリスボレート緩衝液に不溶であった。

例４ 牛の囲心嚢組織試料の架橋 例１に記載の反応器と同様な水冷ジャケット付の改良反
応器を用いて、牛の囲心嚢から採取した複数の試料（面
積２Ｃ−）に、光線照射を同時に行った。照射は、試料
から７−１７−１０約２．８−４インチ）離れた位置に
取付けた２個の照明用電球（１５０ワツト）を用いて行
った。照射を２．５−２２時間行った後に、個々の試料
を反応器から除去した。

第１番目の実験では、メチレングリーンを０．１％（重
量／容量）含有する燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，４
）　　（μｍ０．１６４　）と、４．０Ｍ−塩化ナトリ
ウムからなる架橋反応媒質を使用した。前記の組織試料
を前記溶液と平衡に保ち、媒質と共に装置内に入れ、磁
気攪拌機を用いて連続的に攪拌した０次いで、媒質の温
度を約０℃に保ちながら反応器に光線照射を行った。所
定の時間の後に組織試料を媒質から除去し、μｍ０．１
６４の燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，４）中に浸漬す
ることによって触媒（染料）を除去した。該浸漬は、試
料が触媒を実質的に含まなくなるまで行った。

組織試料の架橋反応における触媒単独の効果、光線照射
単独の効果、および触媒／光線照射併用の効果を調べる
ために次の実験を行った。触媒を含まない対照試料には
前記の反応を行い、かつ、触媒を含む対照試料には前記
反応を、光線を照射せずに行った。１２日間洗浄した。

洗浄液は１日当り３回変えた。該液は０．１　Ｍ　　Ｎ
ＨａＨＣＯｓ　　（ｐＨ７，９）、０．００１Ｍ　−Ｃ
ａＣｌ１．溶液であった。その結果得られた蛋白質含有
生成物の架橋度および安定度を、対照試料との比較によ
って調べた。この試験は、４℃において３％酢酸中の１
％ペプシン溶液を用いて各試料にペプシン消化を行うこ
とからなるものであった。試料と前記酵素との反応時間
は種々変えた。試験の結果を第１図に示す。

メチレンブルーの存在下に光線照射を２．５−２２時間
行った組織試料では、一般に蛋白質の溶解度の著しい低
下（対照試料基準）が認められた。

さらに、対照組織試料にペプシン消化を６時間行った場
合には、ヒドロキシプロリン（ｈｙｐ）が約３０ｎＭ（
組織試料１■当り）生じたが、一方、メチレングリーン
の存在下に光線照射を２２時間行った後の前記組織試料
に前記のペプシン消化実験を行った場合には、ヒドロキ
シプロリン（ｈｙｐ）の生成量は約１０ｎＭ（組織試料
１■当り）にすぎなかった。この実験の結果から明らか
なように、本発明方法によってコラーゲンが非常に有利
に架橋でき、かつ安定化できる。

例５ 組織試料の安定性／触媒（容Ｉ）の関係中の囲心嚢試料
を３．０Ｍ−ＫＣｌ、μｍ０．１６７、燐酸カリウム緩
衝液に浸漬し、次いで囲心嚢試料の一部（例４の場合よ
り少数の試料）を、例４の場合と同じ緩衝液（メチレン
グリーン０．１％を含むもの）の中に入れ、例４の場合
と同じ反応条件下に反応させた。光線照射時間は２２時
間以下であった。″この実験では、純粋なバクテリア賞
コラゲナーゼを用いる消化操作（０，１５Ｍ−ＴＥＳＩ
Ｉ衝液（ｐＨ７，５）、中の１％コラゲナーゼ溶液（０
，００１Ｍ　　ＣａＣｊ！ｚ液中）を用いて３７℃にお
いて６時間行う）を行い、その結果に基いて架橋度およ
び安定度を評価した。対照試料ではｈ）’ｆ）が２（１
６ｎＭ（組織試料１■当り）生じ、一方、光線を２２時
間照射した試料ではｈｙｐは３６ｎＭ（，１１織試料１
■当り）生じた。この実験の結果を第２図に示した。本
発明に従って処理された組織試料はコラゲナーゼによる
消化の度合が低く、組織試料が充分に安定であることが
確認された。

例６ ２才の牛の直皮に、１％酢酸を用いて抽出操作を行って
可溶性コラーゲンを得た。該コラーゲンを、酢酸溶液か
ら塩で沈澱させることによって精製し、次いで低イオン
強度の透析を２回行い、其後に１％酢酸に溶解し、０．
０２　Ｍ＝燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，４）を用い
て透析を行ってフィブリルに復元した。復元したコラー
ゲンを少量づつに分け、アルミニウム箔で覆ったフラス
コ中の、メチレングリーン０．１％を含む０．０２　Ｍ
−燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，４）の中に浸漬した
。フラスコを水浴中で４℃に保ち、その中に空気を入れ
て泡立たせ、所定の数のフラスコから約３ｃｍの距離の
位置に１５０ワ・ントの照射用電球を２個取付けて２４
時間照射し、フラスコ上のアルミニウム箔を、所定の照
射時間に応じて適宜除去した。

光線を照射したフィブリル試料および無照射のフィブリ
ル試料に透析操作を、０．０２　Ｍ−燐酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ７，４）を用いて行った前記染料を除去し、
次いで遠心分離操作を行い、３％酢酸中に入れた。無照
射のフィブリル試料は酢酸に溶解し、光線照射を行った
フィブリル試料は、６５゛Ｃに加熱した場合でさえ不溶
であった。この試験によって、光線照射を行った試料は
効果的に架橋されていることが確認された。照射したフ
ィブリル試料から得られた上澄液に加水分解操作を行っ
てｈｙｐ含量を測定する実験を行った。ｈｙｐは検出さ
れなかった。この結果からも、該コラーゲンの架橋結合
の存在が確認された。

光線照射を行ったフィブリル試料および無照射の試料の
一部に透析操作を７日間行った。この操作では燐酸ナト
リウム緩衝液を毎日３回、同種の新たな液と取換えた。

該操作は、触媒を実質的に含まなくなるまで行った。触
媒を吸収させるために、Ｈ３型のダウエックス５Ｏ−Ｘ
８樹脂（２０−５０メツシユ）（少量すなわち数グラム
）を透析液に添加した。光線照射を行ったフィブリル試
料および無照射のフィブリル試料の各々に、其後に加水
分解操作を６Ｎ−塩酸の存在下に真空中で１１０℃にお
いて２４時間行った。加水分解の生成物を乾燥し、そし
て１回当り約５０■の試料を用いて分子ふるいクロマト
グラフィ操作をコラム上で行った。該コラムは、“ＢＩ
Ｏ−ＧＥＬ　　Ｐ２−４００メツシユコラム”　（１，
６Ｘ１００）であり、これは予じめ、０．１　Ｍ−酢酸
と平衡化させておいた。キャリブレーションは、Ｎａ’
ＢＬで還元されたコラーゲンフィブリルの酸加水分解生
成物５ｍｇを用いて行った。コラムに試料を少量づつ入
れ、ニンヒドリンによってアミノ酸を発色させ、放射能
をシンチレーションカウンタで計測することによって、
コラムの状態を調べた。コラーゲンの天然架橋結合を示
す試料のフラクション〔フラクション３３−４８；その
容量は「ボイド容量Ｊ　（ｖｏｉｄｖｏｌｔ＋ｍｅ）と
称される〕を集め、親油性化し、アミノ酸分析を行った
。

光線照射を行ったフィブリル試料および無照射のフィブ
リル試料のクロマトグラフィによるアミノ酸分析の結果
を相互に比較した。光線照射を行ったフィブリル試料の
加水分解生成物の場合には、フェニルアラニンとヒドロ
キシリジンとの間に６本の明瞭な新規ピークが認められ
た。一方、無照射のフィブリル試料のクロマトグラフィ
のデータでは、当該区域は、ヒスチジン（ｈｉｓ）を除
いて一般に空白区域である。したがって、分子量の高い
これらの物質の存在は、染料（触媒）の存在下の光化学
的酸化反応により、“架橋されたアミノ酸”が生じたこ
とを示す証拠であると考えられる。さらに、当該区域に
ｈｉｓが存在しないことは、ｈｉｓは光化学的酸化反応
により破壊されたことを示唆するものであると思われる
。

例７ 架橋反応に与える高浸透圧の影響 透明なプラスチック材料で四角形の照明室（ｉｌｌｕ＋
＋＋１ｎａｔｉｏｎ　ｃｅｌｌ）を作り、同種の材料か
らなるジャケットを外側に取付け、さらにまた、内室と
連通ずる管を取付け、媒質および染料（触媒）が循環で
きるようにした。細長いプラスチック片からなる枠体を
作り、これに複数の孔を相互に離隔して設けて、これに
組織試料が縫合できるようにした。該枠体は、照明室の
内室中に入る程度の寸法を有するものであった。前記の
枠体に１片の牛の囲心嚢を縫付けた後に、枠体を内室の
中に挿入した。２．８Ｍ−塩化カリウム、燐酸カリウム
緩衝液（ｐＨ７，４；μ＝０．１６４）（サクロースを
５０％含有する）からなる媒質を、照明室の内室を通過
、循環させた。組織試料を高浸透圧の媒質に浸漬した後
に、試料を例５の場合と同様に、メチレングリーンを含
有する媒質中で“培養”し、約４、５　ｃｍの距離をへ
だでた位置に取り付けた２個の１５０ワツトの照明用電
球を用いて光線照射を２４−４８時間行った。この操作
中は温度を一２℃ないし＋６に保った。

光線照射後に、各組織試料の一部に、例４および例５の
場合と同様にペプシンまたはバクテリア賞コラゲナーゼ
を用いて消化試験を行った。酵素コラム中の組織試料の
ｈ　ｔｐ／■比は下表の通りであり、この結果から、組
織試料の架橋結合の存在が確認された。

盟韮豊皿ユ豊Ｌ　　　ペプシン　２土デ土二亙０（対照
＃１）　　　　　２６　　　　３１４（対照＃２）　　
　　　３１　　　　３１４２４（試料＃１）　　　　　
　　０　　　　４１０（試料＃２）　　　　　　０　　
　　２９０４８　　　　　　　　　　　０　　　　３０
３別の組織試料は、次の方法によってさらに安定化させ
た〔該安定化は、触覚的性質、たとえば組織の構造およ
びサツプルネス（ｓｕｐｐｌｅｎｅｓｓ）を実質的に変
化させることなく行った〕。すなわち、ＮａＢＨｎ溶液
に１時間浸漬して新規形成イ逅ニウム結合を減少させる
ことによって、さらに安定化された。この場合の各試料
のｈｙｐ／■比を次表に示す。

１．．１１１ｍ、　　　ペプシン　エ２旦立シー二藍０
（対照＃１）　　　　　　２６　　　　３１４（対照＃
２）　　　　　　　７　　　　２０８２４（試料＃１）
　　　　　　　０　　　　１８０（試料＃２）　　　　
　　　Ｏｌ　７０４８　　　　　　　　　　　０　　　
　１７０比較実験として、グルタルアルデヒドを用いて
タンニング操作を行うことによって調製された囲心嚢の
断片（ｐａｔｃｈ）の市販品に、ペプシンによる消化操
作を２５℃および４℃において行った場合には、組織試
料におけるｈｙｐ／ｍｇ比の値がそれぞれ２０および１
６　（ｎＭ）であった。コラゲナーゼを用いて３７℃に
おいて消化した場合には、ｈｙｐ／■（組織）の比の値
は３２および３５　（ｎＭ）であった。

た。

例８ ラットのコラーゲンの架橋 ＢＡＰＮ種のラットのＩ型の可溶性コラーゲンを０、５
　Ｍ−ＨＡｃ中に入れ、これを６個の試料（４−２）に
分け、各試料をＮａＣｊ！　３０■と共に透析用のバッ
グに入れた。ただし試料５および試料６には該塩を添加
しなかった。試料に透析操作を、例７に記載の高浸透性
の緩衝液を用いて行った〔ただし試料５および試料６の
透析操作は、ｐｌ（７，４の燐酸塩緩衝剤を加えた塩水
（ＰＢＳ）を用いて行った〕。さらにまた、０．２％メ
チレンブルー２ｔａｉｌを前記緩衝液に加えた。試料２
および試料３は、ＰＢＳ中にメチレンブルーを０．１％
含有する緩衝液に移した。試料４は、メチレンブルーを
０．０１％含有するＰＢＳに移した。試料５および試料
６はＰＢＳ中に残留した。試料２に光線照射を、液面か
ら約フインチ離れた位置に取付けた１５０ワツトの照明
用白色電球を用いて８時間行った。

光線照射中は温度を約８−１２℃に保った。試料３およ
び試料４には光線照射を同一条件下に２４時間行った。

試料５および試料６には光線照射を同一条件下に２時間
行った０次いで全試料に透析操作を、ＨＡｃ中に戻るよ
うに行った。この操作は、溶液から青色が消えるまで行
った。其後に、例３の場合と同様に５ＤＳ−ＰＡＧＥに
よる分析を行った。光線照射を２４時間行った試料は、
光線照射を８時間行った試料よりも架橋度が一層高かっ
た。これらの試料全部の架橋度は、試料５および試料６
の架橋度よりも一層高かった。

例　　９ 生長中のラットにおける石灰化の減少 例３に記載の条件下に一連の組織試料を作り、これを生
長中のラット（退会３週間のラット）の腹部に、皮下移
植法によって移植した。対照組織試料は、グルタルアル
デヒドで架橋した牛の囲心嚢の市販品〔「ペリカード−
ＡＪ　　（試料Ａ）及び「ペリカード−ＢＪ　　（試料
Ｂ）〕、および豚のリーフレットの市販品（ＧＬ）（試
料Ｃ）であった。

第３図に示されているように、本発明に従って処理され
た組織試料゛Ｄは、対照組織試料（市販品）に比して、
石灰化の傾向が一層低い。

例　　ｌＯ 生体内減成 例３の方法で処理された牛の囲心嚢試料をラット（月令
６個月の成熟ラット）の腹部に、皮下移植法によって移
植した。対照試料として、新鮮な囲心嚢を使用した。移
植してから３個月後に新鮮な対照試料は体内に吸収され
てしまい、一方、本発明に従って処理された囲心嚢試料
は無変化のまま残存していた。この実験においてもまた
、架橋されたコラーゲン型物質の独得な性状が充分に認
められた。

本明細書に開示された本発明を一層理解し易くするため
に、本明細書には若干の技術文献が引用されている。本
明細書には、本発明の若干の実施態様が詳細に記載され
ているけれども、当業者には明らかなように、本発明は
その目的から逸脱することなく種々の態様変化が可能で
ある。

【図面の簡単な説明】

第１図は、蛋白質の架橋結合形成および安定化に及ぼす
触媒および光線照射の影響を調べるために、実施例４に
記載の組織試料にペプシン消化実験を行った結果を示す
グラフである。 第２図は、蛋白質の架橋結合形成および安定化に及ぼす
触媒および光線照射の影響を調べるために、実施例５に
記載の組織試料にコラゲナーゼ消化実験を行ったときの
実験結果を示すグラフである。 第３図は、架橋された組織試料を生体中に移植したとき
の、その石灰化の状態を示すグラフである。第３図には
、グルタルアルデヒドで架橋された牛の囲心嚢試料Ａお
よびＢ（対照試料）、グルタルアルデヒドで架橋された
豚のリーフレット試料Ｃ（対照試料）、および、本発明
方法によって架橋された牛の囲心嚢試料りのデータがグ
ラフで示されている。

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. （１）架橋すべき蛋白質型物質である試料を、光化学的
   酸化反応の触媒を含有する水性媒質溶液中に入れて保持
   し、該触媒は、入射光線による励起時に該蛋白質型物質
   に電子を供与し得るものであり、前記媒質溶液は緩衝剤
   によってｐＨを約６．８−８．６に調節し、この試料の
   保持は、媒質溶液、蛋白質型物質および触媒の濃度が平
   衡に達するのに充分な時間にわたって行い；そして、前
   記蛋白質型物質に酸素の存在下に光線を照射し、該光線
   照射は、前記媒質溶液の前記ｐＨ値を維持しながら、か
   つ、約−２℃ないし＋４０℃の間の温度を保って前記媒
   質中の酸素の濃度を保ちながら行い、光線照射の時間は
   、前記触媒から前記蛋白質型物質への電子の移動によっ
   て該蛋白質型物質を架橋するに充分な時間であることを
   特徴とする、蛋白質型物質を架橋する方法。
2. （２）前記ｐＨを約７．４−８．０に維持する請求項１
   に記載の方法。
3. （３）光線照射実施中は、前記媒質上の大気中の酸素濃
   度を高く保ち、すなわち約０−２５％高く保つことによ
   って前記媒質中の酸素濃度を維持する請求項１に記載の
   方法。
4. （４）光線照射実施中は、前記媒質上の大気中の酸素濃
   度を約５−２０％高く保つことによって前記媒質中の酸
   素濃度を維持する請求項１に記載の方法。
5. （５）蛋白質型物質への光線照射時間が約１００−２０
   ，０００ルーメン時である請求項１に記載の方法。
6. （６）前記水性媒質溶液中における前記保持操作の実施
   前に、前記蛋白質型物質を水性緩衝液に浸漬することを
   包含する請求項１に記載の方法。
7. （７）前記緩衝液の浸透圧モル濃度が約３９３−８００
   ｍｏｓｍである請求項６に記載の方法。
8. （８）前記媒質溶液の浸透圧モル濃度が約１５０−４０
   ０ｍｏｓｍである請求項７に記載の方法。
9. （９）温度を０−２５℃に保つことを包含する請求項１
   に記載の方法。
10. （１０）コラーゲン分子を水性媒質中に浸漬し、該コラ
    ーゲン分子を光酸化反応の触媒との平衡に到達させ、 次いで該コラーゲン分子に酸素の存在下に光線を照射す
    ることによって、該光酸化反応の触媒から電子を該コラ
    ーゲン分子に移動させて該コラーゲン分子を酸化するこ
    とによって該コラーゲン分子に架橋結合を形成させ、前
    記光線照射は、前記水性媒質中に所定の酸素濃度を充分
    維持できるような温度およびｐＨ条件のもとで行うこと
    を包含する製造方法によって製造された架橋生成物。
11. （１１）前記媒質を緩衝剤によって約６．８−８．６の
    ｐＨに保つことを包含する請求項１０に記載の生成物。
12. （１２）前記触媒の濃度が約０．０００１−０．２５％
    （重量／容量）である請求項１０に記載の生成物。
13. （１３）前記コラーゲン分子の光酸化反応を約−２℃な
    いし＋４０℃の温度において行う請求項１０に記載の生
    成物。
14. （１４）前記コラーゲン分子への光線照射を約１００−
    ２０，０００ルーメン時行う請求項１０に記載の生成物
    。
15. （１５）前記水性媒質の浸透圧モル濃度が約１５０−８
    ００ｍｏｓｍである請求項１０に記載の生成物。
16. （１６）前記触媒を水性緩衝液に溶解することを包含す
    る請求項１０に記載の生成物。