BR112014011089B1 - método para esterilizar e estocar um biomaterial, e, recipiente - Google Patents

Abstract

método para esterilizar e estocar um biomaterial, e, recipiente a presente invenção se refere a um processo para esterilizar biomateriais implantáveis. em particular, a invenção se refere a um processo para esterilizar um biomaterial baseado em colágeno reticulado compreendendo contatar o dito biomaterial baseado em colágeno reticulado com uma solução de esterilização compreendendo entre 3% e 6% v/v de óxido de propileno e incubar o dito biomaterial entre 30°c e 55°c por mais de 48 horas;contanto que a solução de esterilização não inclua álcool

Description

MÉTODO PARA ESTERILIZAR E ESTOCAR UM BIOMATERIAL, E, RECIPIENTE

CAMPO

[001] A presente invenção se refere a um processo para esterilizar biomateriais implantáveis. Em particular, a invenção se refere a um processo para esterilizar biomateriais implantáveis contendo colágeno, e posterior armazenagem.

ANTECEDENTES

[002] Biomateriais implantáveis, especialmente biomateriais baseados em colágeno, requerem esterilização e mais frequentemente armazenamento antes do uso. Geralmente existem duas grandes classes de biomateriais implantáveis baseados em colágeno: (1) tecido natural e (2) tecido quimicamente reticulado. Assim, dependendo do tipo de biomaterial baseado em colágeno e se ocorreu a reticulação ou não, existe a necessidade de um meio de esterilizar o tecido bem como de armazenar o tecido uma vez que ele tenha sido esterilizado.

[003] Biomateriais baseados em colágeno reticulados quimicamente tais como adesivos cardiovasculares, válvulas cardíacas, matrizes e artérias são geralmente esterilizados após a reticulação e armazenados em uma solução estéril até a implantação. Vários métodos de esterilização para biomateriais baseados em colágeno reticulados quimicamente foram testados e implementados durante as ultimas três ou quatro décadas incluindo irradiação gama, irradiação UV e uma variedade de agentes químicos. Embora a maior parte desses métodos de esterilização seja eficiente na prevenção da contaminação, efeitos adversos como dano estrutural (divisão de ligações de peptídeos) e degeneração de tecido (redução da resistência à tração) tornaram muitos desses métodos menos atraentes para aplicação industrial.

[004] Por exemplo, biomateriais baseados em colágeno reticulados com glutaraldeído podem se tornar quimicamente instáveis quando expostos a soluções de esterilização baseadas em álcool devido à interação do álcool com o glutaraldeído residual e não ligado, presente no tecido. Hemiacetais instáveis são formados quando um álcool reage com um aldeído. Esses hemiacetais instáveis tem a capacidade de reagir com álcool para formar uma acetila, que pode se dissociar para formar um aldeído e um álcool.

[005] Assim, atualmente, a maioria dos fabricantes de biomateriais baseados em colágeno preferem o uso de combinações glutaraldeído-formaldeído para reticulação química e agentes não-aldeído para esterilização. Um desses agentes não-aldeído é o gás de óxido de etileno (oxirano), que tem sido usado para esterilizar válvulas cardíacas mecânicas por muitos anos. O gás de óxido de etileno também tem sido usado para esterilizar uma variedade de equipamentos médicos, itens descartáveis e válvulas cardíacas mecânicas.

[006] Uma vez que o biomaterial baseado em colágeno tenha sido esterilizado ele é geralmente armazenado por um período de tempo antes da implantação. O armazenamento de biomateriais baseados em colágeno a médio-longo prazo requer proteção adequada contra contaminação em uma solução fisiologicamente estável. Embora a maior parte dos biomateriais baseados em colágeno comercialmente disponível ainda seja armazenada em soluções baseadas em aldeído, efeitos adversos como calcificação e fibrose são bastante conhecidos.

[007] Desde a década de 1970 o óxido de propileno tem sido usado como um agente esterilizante (ver, por exemplo, Hart & Brown, 1974, Appl Microbiol, Dec. p.1069-1070; Brown & Ng, 1975, Appl Microbiol, Sept. p483484). Em cada caso uma solução compreendendo 5% de óxido de propileno mais 70% de álcool isopropílico ou 0,5% de clorexidina ou 2% de cetrimida foi eficaz na destruição de uma suspensão de esporos bacterianos. Entretanto, ao mesmo tempo em que o uso de óxido de propileno tenha sido registrado isso é usualmente aplicado na presença de álcool (etanol ou isopropanol). Dessa forma, o uso de um álcool como um aditivo para a esterilização de óxido de propileno com tecidos reticulados com aldeído (contendo aldeídos residuais) poderia resultar em níveis elevados de aldeído, o que por outro lado aumenta o potencial de calcificação desses tecidos e por fim a falha da prótese biológica.

[008] Consequentemente, é necessário um processo de esterilização eficiente que não apenas esterilize biomateriais baseados em colágeno reticulados quimicamente, mas também forneça um meio de armazenamento conveniente para o biomaterial esterilizado.

SUMÁRIO

[009] Os inventores desenvolveram um processo que supera ou pelo menos alivia os problemas associados aos métodos tipicamente usados para esterilização e/ou armazenamento de biomateriais baseados em colágeno reticulados.

[010] Dessa forma, em um primeiro aspecto a presente invenção fornece um método para esterilizar um biomaterial baseado em colágeno reticulado compreendendo contatar o dito biomaterial baseado em colágeno reticulado com uma solução de esterilização compreendendo entre 3% e 6% v/v de óxido de propileno e incubar o dito biomaterial entre 30°C e 55°C por mais de 48 horas; contanto que a solução de esterilização não inclua álcool.

[011] Em algumas representações a temperatura de incubação está entre 30°C, 31 °C, 32°C, 33°C, 34°C, 35°C, 36°C, 37°C, 38°C, 39°C, 40°C, 41 °C, 42°C, 43°C, 44°C, 45°C, 46°C, 47°C, 48°C, 49°C, 50°C, 51 °C, 52°C, 53°C, 54°C e 55°C. Em outras representações a temperatura de incubação está entre 30°C e 31 °C, 32°C, 33°C, 34°C, 35°C, 36°C, 37°C, 38°C, 39°C, 40°C, 41 °C, 42°C, 43°C, 44°C, 45°C, 46°C, 47°C, 48°C, 49°C, 50°C, 51 °C, 52°C, 53°C, 54°C ou 55°C. Em outras palavras, todas as combinações de temperatura entre o limite de 30°C e 55°C são consideradas. Em algumas representações a temperatura de incubação está preferencialmente entre 35°C e 50°C, mais preferivelmente entre 40°C e 48°C. Em algumas representações a temperatura de incubação é de aproximadamente 45°C.

[012] Uma vez que o tempo de incubação tenha decorrido, i.e., tenha decorrido mais de 48 horas, é possível permitir que a temperatura seja reduzida para temperatura ambiente. Na verdade, o biomaterial baseado em colágeno reticulado sintetizado pode permanecer em temperatura ambiente por algum tempo após as 48 horas iniciais nesse momento. Uma vez que o biomaterial baseado em colágeno reticulado sintetizado tenha sido incubado no óxido de propileno por pelo menos 4 dias, o óxido de propileno terá sido convertido para propileno glicol e o biomaterial baseado em colágeno estará pronto para o uso.

[013] Em algumas representações, a solução de esterilização compreende entre 3,8% e 4,5% v/v de óxido de propileno. Em outras representações, a solução de esterilização compreende aproximadamente 4% v/v de óxido de propileno. Em algumas representações a solução de esterilização consiste essencialmente de entre 3% e 6% v/v de óxido de propileno, mais preferivelmente a solução de esterilização consiste de entre 3% e 6% v/v de óxido de propileno. Em algumas representações a solução de esterilização consiste essencialmente de entre 3,8% e 4,5% v/v de óxido de propileno, mais preferivelmente a solução de esterilização consiste de entre 3,8% e 4,5% v/v de óxido de propileno. Em algumas representações a solução de esterilização consiste essencialmente de aproximadamente 4% v/v de óxido de propileno, mais preferivelmente a solução de esterilização consiste de aproximadamente 4% v/v de óxido de propileno.

[014] Será observado que álcool, especialmente etanol e/ou isopropanol não é usado na solução de esterilização da presente invenção.

[015] É uma exigência que a etapa de esterilização seja realizada por mais de 48 horas (2 dias); entretanto, como a solução de esterilização também pode ser usada como um meio de armazenamento a etapa de esterilização pode ser realizada por 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais dias.

[016] O biomaterial baseado em colágeno reticulado pode ser qualquer material que compreenda, consista essencialmente de ou consista de colágeno. Em algumas representações, o biomaterial baseado em colágeno é isolado diretamente de um animal. O biomaterial pode ser isolado de qualquer animal, seja ele da mesma espécie de um receptor ou de um animal de uma espécie diferente do receptor. Preferivelmente, o animal é de uma das classes mamíferas i.e. Artiodactyla, Lagomorpha, Rodentia, Perissodactyla, Carnivora e Marsupialia. Mais preferivelmente, o animal é selecionado do grupo consistindo de um ovino, um bovino, um caprino, um equino, um suíno, um marsupial e um humano.

[017] O biomaterial pode ser qualquer tipo de tecido celular. Preferivelmente, o tecido celular é selecionado do grupo consistindo de tecido cardiovascular, tecido cardíaco, válvula cardíaca, raízes aórticas, parede aórtica, folhetos aórticos, tecido de pericárdio, tecido conectivo, dura mater, tecido dérmico, um tecido vascular, cartilagem, pericárdio, ligamento, tendão, vasos sanguíneos, tecido umbilical, tecido ósseo, fasciae e tecido submucosa e pele.

[018] Em algumas representações, o biomaterial é e/ou compreende um separado i.e. colágeno isolado, ao invés de um tecido contendo colágeno naturalmente ocorrente. O colágeno separado pode ser usado no seu estado isolado ou formado em qualquer aparelho ou artigo médico conhecido na arte.

[019] Em algumas representações, o biomaterial é um tecido cultivado, uma prótese contendo matriz extracelular obtida de um animal, um tecido reconstituído (ex. matriz de colágeno), ou outros.

[020] Também será observado que o biomaterial pode ainda compreender análogos sintéticos formados de polímeros sintéticos, polímeros biológicos, ou ambos, incluindo aqueles geralmente encontrados em matrizes de tecidos naturais. Polímeros sintéticos adequados incluem, por exemplo, poliamidas e polisulfonas. Polímeros biológicos podem ser naturalmente ocorrentes ou produzidos ou in vitro por, por exemplo, fermentação e outros.

[021] Em um segundo aspecto, a presente invenção fornece um método para esterilizar um biomaterial baseado em colágeno compreendendo: (a) fornecer um biomaterial baseado em colágeno e lavar o mesmo com 0,9% v/v de solução salina gelada e colocar o dito biomaterial em 0,9% v/v de solução salina gelada/Fenil-metil-sulfonil-fluoreto (PMSF); (b) contatar o dito biomaterial baseado em colágeno com 0,625% v/v de solução de glutaraldeído e fostato di-hidrogenado de potássio pH 7,4 e incubar o mesmo a aproximadamente 1-5°C por pelo menos 5 dias para produzir um biomaterial baseado em colágeno reticulado; (c) enxaguar o dito biomaterial baseado em colágeno reticulado em cloreto de sódio estéril a 0,9% v/v a aproximadamente 10°C e então contatar o biomaterial baseado em colágeno reticulado com uma solução de esterilização compreendendo entre 3,8% e 4,5% v/v de óxido de propileno e incubar o dito tecido entre 30°C e 55°C por mais de 48 horas; contanto que a solução de esterilização não inclua álcool.

[022] Em um terceiro aspecto a presente invenção fornece um método para armazenar um biomaterial baseado em colágeno reticulado e esterilizado compreendendo contatar um biomaterial baseado em colágeno reticulado com uma solução compreendendo entre 3% e 6% v/v de óxido de propileno e incubar o dito biomaterial entre 30°C e 55°C por mais de 48 horas e então permitir que o biomaterial permaneça em contato com o dito óxido de propileno até que o mesmo se converta em propileno glicol; contanto que a solução não inclua álcool.

[024] Em um quarto aspecto, a presente invenção fornece um biomaterial baseado em colágeno reticulado e esterilizado produzido por um método de acordo com o primeiro, segundo ou terceiro aspectos.

[025] Será observado que uma vez que o biomaterial baseado em colágeno reticulado e esterilizado tenha sido obtido pelos métodos da presente invenção este pode ser incluído com dispositivos biológicos implantáveis. Dessa forma, em um quinto aspecto, a presente invenção fornece um dispositivo biológico implantável de acordo com o quarto aspecto.

[026] Em um outro aspecto da presente invenção o biomaterial baseado em colágeno reticulado da presente invenção está contido em um kit para reparar um ferimento em um tecido. Assim, em um sexto aspecto a presente invenção fornece um kit para reparar um ferimento em um tecido compreendendo: (a) um recipiente estéril tendo um biomaterial baseado em colágeno reticulado e esterilizado de acordo com o quarto aspecto ou um dispositivo de acordo com o quinto aspecto; e (b) instruções para uso em um paciente com ferimento.

[027] Em um sétimo aspecto, a presente invenção fornece um recipiente compreendendo biomaterial baseado em colágeno reticulado e esterilizado e uma solução de 3% a 6% v/v propileno glicol, no qual o dito propileno glicol resultou da conversão in situ de uma solução de 3% a 6% v/v de óxido de propileno enquanto na presença do biomaterial.

[028] O material baseado em colágeno da presente invenção pode ser reticulado por qualquer método conhecido de reticulação de colágeno incluindo, mas não limitado aos métodos divulgados em Eyre et al., 1984, Annu. Rev. Biochem. 537, 717-748; Eyre, 1982, In: Symposium on Heritable Disorders of Connective Tissue (Akeson et al. eds) pp. 43-58, Mosby, St. Louis, Missouri; Davison & Brennan, 1983, Connect. Tissue Res. 11, 135-151; Robins, 1982, Methods Biochem. Analysis, 28, 330-379; Reiser, 1991, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 196, 17-29; todos os quais estão aqui incorporados em sua totalidade a título de referência. Entretanto, um método preferido de reticulação do biomaterial baseado em colágeno da presente invenção compreende: (a) expor um biomaterial baseado em colágeno a uma solução contendo álcool por pelo menos 24 horas; (b) expor o dito biomaterial na etapa (a) a um agente de reticulação; e (c) expor o dito biomaterial na etapa (b) a uma solução ácida; no qual as etapas (b) e (c) são sequenciais à etapa (a).

[029] A solução contendo álcool usada na etapa (a) é preferivelmente um líquido baseado em água, i.e., é uma solução aquosa com mais do que aproximadamente 50% v/v de álcool, e preferivelmente entre de 60% a 80% de álcool por volume. Uma solução contendo álcool tamponada ou não tamponada pode ser usada; no entanto, é preferível que seja usada uma solução contendo álcool não tamponada já que se descobriu que soluções contendo álcool tamponadas afetam adversamente os procedimentos subsequentes de reticulação produzindo um biomaterial amarelado.

[030] O método preferido de reticulação pode usar qualquer álcool conhecido na solução contendo álcool. Preferivelmente, o álcool é um álcool baixo C1-C6 em uma solução não tamponada. Mais preferivelmente ainda, o álcool é selecionado do grupo consistindo de metanol, etanol, ciclohexanol, isopropanol, propanol, butanol, pentanol, isobutanol, sec-butanol e t-butanol.

[031] Em algumas representações, a solução contendo álcool compreende uma mistura de dois ou mais álcoois contanto que o volume combinado do álcool seja maior que 50% v/v. Por exemplo, uma mistura de aproximadamente 70% v/v de etanol e aproximadamente 10% v/v de isobutanol é eficaz.

[032] O biomaterial na etapa (a) pode ser exposto à solução contendo álcool por qualquer período de tempo contanto que seja suficiente para tornar o biomaterial resistente à calcificação patogênica in vivo. Preferivelmente, o biomaterial permanece em contato com a solução contendo álcool por tempo suficiente para permitir que o álcool se difunda e permeie para o biomaterial. Mais preferivelmente, o biomaterial é exposto à solução contendo álcool por pelo menos 24 horas, mais preferivelmente ainda pelo menos 36 horas e mais preferivelmente ainda, pelo menos 48 horas.

[033] O biomaterial, após a exposição à solução contendo álcool, é removido e exposto a um ou mais agentes de reticulação. Qualquer forma de agente de reticulação conhecida ou combinação das mesmas pode ser usada contanto que seja capaz de reticular colágeno. Dessa forma, será observado que agentes de reticulação incluem, mas não estão limitados a, divinil sulfona (DVS), polietileno glicol divinil sulfona (VS-PEG-VS), hidroxietil metacrilato divinil sulfona (HEMA-DIS-HEMA), formaldeído, glutaraldeído, aldeídos, isocianatos, alquil e aril haletos, imidoésteres, maleimides N-substituídos, compostos de acilação, carbodiimida, hidroxicloreto, N-hidroxisuccinimida, luz (ex., luz azul e luz UV), pH, temperatura, e combinações dos mesmos. Preferivelmente, o agente de reticulação é um agente de reticulação químico selecionado do grupo consistindo de carbodiimida, poliepoxi éteres, divinil sulfona (DVS), polialdeído e difenilfosforil azida (DPPA).

[034] Em algumas representações, o polialdeído é um bi-, tri-, ou di-aldeído. Glutaraldeído é especialmente preferido.

[035] Em algumas representações, a etapa (b) de reticulação é seguida pela etapa (c), com ou sem uma etapa de lavagem interveniente. A solução ácida usada na etapa (c) contem qualquer ácido capaz de inativar e/ou modificar as metades do agente de reticulação fixas e/ou não fixas presentes no biomaterial após a etapa (b) para remover ou reduzir locais de ligação de cálcio disponíveis. Alternativamente, ou em adição a, a solução ácida usada na etapa (C) contem qualquer ácido capaz de posteriormente reticular os grupos carboxila ativados com os grupos amina ativados no colágeno para formar ligações de amida. Preferivelmente, o ácido na solução ácida compreende um ácido aminocarboxílico. Preferivelmente, o ácido aminocarboxílico é um ácido tendo pelo menos um grupo amino e pelo menos um substitutivo de ácido carboxílico. Mais preferivelmente, o ácido aminocarboxílico é selecionado do grupo consistindo de L-arginina, L-lisina, L-histidina, L-glutamato ou L-aspartato.

[036] A etapa de enxaguar o biomaterial é conduzida usando uma solução salina de 0,9% v/v livre de fosfato.

[037] Embora possa ser observado pelos especialistas que a temperatura na qual cada uma das etapas no método preferido de reticulação é realizada não é crucial, pode-se perceber que preferivelmente a temperatura está entre 2°C e 40°C, mais preferivelmente, entre 4°C e 30°C e mais preferivelmente, entre 5°C e 25°C.

[038] Em uma representação, o álcool, solução ácida e solução de enxague são todos não-tamponados.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[039] A Figura 1 mostra o efeito de 2% de óxido de propileno em temperaturas variadas entre 15°C e 45°C em esporos B. subtilis durante um período de tempo.

[040] A Figura 2 mostra o efeito de 4% de óxido de propileno em temperaturas variadas entre 15°C e 45°C em esporos B. subtilis durante um período de tempo.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS REPRESENTAÇÕES PREFERIDAS

[041] Antes de descrever a presente invenção em detalhes, deve-se observar que esta invenção não está limitada a métodos de produção particularmente exemplificados, que podem, naturalmente, variar. Também deve-se notar que a terminologia usada aqui tem o objetivo de descrever apenas representações particulares da invenção, e não tem a intenção de ser limitadora, a qual será limitada apenas pelas reivindicações anexas.

[042] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente aqui citados, seja supra ou infra, estão aqui incorporados a título de referência em sua totalidade. Entretanto, publicações mencionadas aqui são citadas com o objetivo de divulgar os protocolos e reagentes que são registrados nas publicações e que podem ser usados em conexão com a invenção. Nada aqui contido deve ser interpretado como uma admissão de que a invenção não tem o direito de antecipar tal divulgação em virtude de invenção anterior.

[043] Além disso, a prática da presente invenção emprega, salvo quando indicado de outra forma, técnicas imunológicas convencionais, química e farmacologia conhecidas no estado da arte. Essas técnicas são bastante conhecidas dos profissionais da área, e explicadas de modo completo na literatura. Ver, ex., Coligan, Dunn, Ploegh, Speicher and Wingfield “Current protocols in Protein Science” (1999) Volume I e II (John Wiley & Sons Inc.); e Bailey, J.E. and Ollis, D.F., Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill Book Company, NY, 1986; Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986).

[044] Deve-se observar que como são usadas aqui e nas reivindicações anexas, as formas singulares “um” e “uma”, e “o” e “a” incluem a referência em plural a não ser que o contexto prescreva claramente de outra forma. Assim, por exemplo, uma referência a “um agente de reticulação” inclui uma pluralidade desses agentes, e uma referência a “um álcool” é uma referência a um ou mais álcoois, e assim por diante. Salvo definição em contrário, todos os termos técnicos e científicos aqui usados tem o mesmo significado que o comumente usado por qualquer perito comum na arte a que essa invenção pertence. Embora quaisquer materiais e métodos similares ou equivalentes àqueles aqui descritos possam ser usados para praticar ou testar a presente invenção, os materiais e métodos preferidos são agora descritos.

[045] Em um dos aspectos mais amplos, a presente invenção se refere a um método para esterilizar um biomaterial baseado em colágeno.

[046] Como é usado aqui, o termo “biomaterial” se refere a qualquer material contendo colágeno que potencialmente tenha um uso biológico. O colágeno pode ser qualquer tipo de colágeno de qualquer fonte e pode estar presente sozinho ou em combinação com outros materiais. Dessa forma, o colágeno pode representar apenas 1 % v/v do peso total do biomaterial ou até 100%.

[047] O termo “colágeno” como é usado aqui se refere à família extracelular de proteínas fibrosas que são caracterizadas pela sua estrutura rígida, helicoidal de fita tripla. Três cadeias de polipeptídeos de colágeno (“a-cadeias”) são enroladas uma em volta da outra para formar essa molécula helicoidal. O termo também pretende abranger os vários tipos de colágeno.

[048] A parte principal da porção helicoidal do colágeno varia pouco entre as espécies mamíferas. Na verdade um número de tipos de colágeno tem altos graus de homologias de sequências de nucleotídeos e aminoácidos. Por exemplo, a homologia da sequência de nucleotídeo para o colágeno alfa I tipo II é de pelo menos 88% em comparação com humanos, equinos e murinos. Humanos e equinos tem 93% de homologia de sequência no nível de nucleotídeo, enquanto que camundongo e equino tem 89% de homologia de sequência. A homologia de sequência de nucleotídeo para humano e camundongo é de 88% (ver, NCBI números de acesso U62528 (Equino), NM033150 (Humano) e NM031163 (camundongo) http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Outros tipos de colágeno tem níveis similares de homologia de aminoácidos. Por exemplo, a homologia de sequência de nucleotídeo entre o colágeno suíno alfa I tipo I e o colágeno ovino alfa I tipo I é de 90% (ver, NCBI números de acesso AF29287 (Ovino) e AF201723 (Suíno) http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

[049] Dado o nível de linhagem e biologia comum para muitos dos animais acima, o alto grau de homologia de sequência de aminoácido e nucleotídeo para colágeno através de uma quantidade de espécies como gado, ovelhas, camundongos e porcos, uma pessoa especializada pode perceber que os métodos para produzir o biomaterial como aqui divulgado são aplicáveis para materiais colagenosos isolados de todos os animais mamíferos.

[050] Dessa forma, em algumas representações, o biomaterial é isolado ou coletado de um animal de um dos grupos de mamíferos, i.e., Artiodactyla, Lagomorpha, Rodentia, Perissodactyla, Carnivora and Marsupialia. O animal é preferivelmente um ovino, um bovino, um caprino, um equino, um suíno, um marsupial ou um humano. Ao mesmo tempo em que o biomaterial é preferivelmente isolado da mesma espécie animal que o receptor, é previsto que o biomaterial pode ser isolado de uma espécie diferente do receptor.

[051] Alternativamente, em algumas representações, o biomaterial compreende um tecido cultivado, um tecido reconstituído, ou semelhantes.

[052] O biomaterial pode ser qualquer tipo de tecido celular. Por exemplo, o tecido celular pode ser tecido cardiovascular, tecido do assoalho pélvico, tecido cardíaco, válvula cardíaca, raízes aórticas, parede aórtica, folhetos aórticos, tecido do pericárdio, tecido conectivo, a matriz de órgãos macios ou sólidos, tecido dérmico, um tecido vascular, dura mater, cartilagem, pericárdio, ligamento, vasos sanguíneos de tendões, tecido umbilical, tecido ósseo, fasciae, e tecido submucosa ou pele, já que todos esses compreendem algum colágeno.

[053] Também se pode observar que o biomaterial pode ainda compreender análogos sintéticos formados de polímeros sintéticos, polímeros biológicos purificados, ou ambos, incluindo aqueles geralmente encontrados em matrizes de tecido natural. Polímeros sintéticos apropriados incluem, por exemplo, poliamidas e polisulfonas. Polímeros biológicos podem ser naturalmente ocorrentes ou produzidos in vitro por, por exemplo, fermentação e outros.

[054] Polímeros biológicos purificados podem ser formados apropriadamente em um substrato por técnicas como tecelagem, tricô, fundição, moldagem, extrusão, alinhamento celular, e alinhamento magnético. Polímeros biológicos adequados incluem, sem limitação, colágeno, elastina, seda, queratina, gelatina, poliaminoácidos, polissacarídeos (ex., celulose e amido), e copolímeros de qualquer um desses. Por exemplo, polímeros de colágeno e elastina podem ser formados em um material implantável sintético por qualquer uma dentre uma variedade de técnicas, tais como tecelagem e moldagem. Análogos de tecido sintético imitam uma matriz de tecido natural. Alternativamente, substratos sintéticos podem ser usados para formar um análogo de tecido, seja sozinho ou juntamente com substratos naturalmente ocorrentes. Exemplos não limitadores incluem polipropileno, ácido poliático, poliéster, nylon, silicone e semelhantes.

[055] Uma vez que o biomaterial tenha sido adquirido ele é reticulado. A reticulação pode utilizar qualquer um dos procedimentos conhecidos incluindo, mas não limitado a, aqueles descritos em Eyre et al., 1984, Annu. Rev. Biochem. 537, 717-748; Eyre, 1982, In: Symposium on Heritable Disorders of Connective Tissue (Akeson et al. eds) pp. 43-58, Mosby, St. Louis, Missouri; Davison &Brennan, 1983, Connect. Tissue Res. 11, 135-151; Robins, 1982, Methods Biochem. Analysis 28, 330-379; Reiser, 1991, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 196, 17-29.

[056] Um método preferido de reticulação é divulgado no pedido de patente internacional WO2006/066327 , aqui incorporado em sua totalidade a título de referência. Em resumo, uma etapa inicial no método preferido de reticulação do biomaterial baseado em colágeno da presente invenção compreende contatar o biomaterial com uma solução contendo álcool. Como é usado aqui, o termo “contatado”, ou “contatando” se refere à etapa ativa de imergir o biomaterial baseado em colágeno em uma solução ou agente como descrito aqui, ou como descrito infra, subsequentemente contatando o biomaterial com um agente de reticulação, uma solução ácida ou outra matéria por um período de tempo suficiente para promover um resultado desejado. Métodos para contatar o biomaterial com, por exemplo, a solução contendo álcool, são bastante conhecidos. Por exemplo, de modo geral, o biomaterial pode ser contatado por pulverização, mergulho ou imersão do biomaterial em uma solução ou agente.

[057] O termo “álcool” como é usado aqui se refere a qualquer álcool conhecido na arte que seja capaz de remover ou reduzir a quantidade de triglicerídeos e pelo menos parcialmente esterificar os grupos carboxila encontrados no colágeno. Preferivelmente, o álcool é um álcool solúvel em água. Mais preferivelmente, o álcool é um álcool baixo C1-C6 em uma solução não tamponada. Mais preferivelmente ainda, o álcool é selecionado do grupo consistindo de metanol, etanol, ciclohexanol, isopropanol, propanol, butanol, pentanol, isobutanol, sec-butanol e t-butanol.

[058] Sem querer se fixar em qualquer teoria ou hipótese em particular os inventores consideram que a solução contendo álcool auxilia na libertação da hélice tripla de colágeno e dessa forma expor locais hidrofóbicos (ver, Karube & Nishida, 1979, Biochim Biophys Acta., 23;581(1): 106-13). Eles também consideram que os grupos carboxila e amina encontrados no colágeno são esterificados na presença da solução contendo álcool de modo que eles se tornam disponíveis para reticulação em etapas posteriores. Como tal, uma solução alcoólica preferida compreende pelo menos 50% v/v, mais preferivelmente pelo menos aproximadamente 70% v/v e mais preferivelmente pelo menos aproximadamente 80% v/v de álcool para solução aquosa não tamponada. Em uma representação, a solução alcoólica é de 70% de etanol v/v em 0,9% de solução salina (contendo 0,5mM PMSF).

[059] Em algumas representações a solução contendo álcool, bem como outras soluções e reagentes usados aqui são “não tamponados” já que é levantada a hipótese de que agentes de reticulação contendo aldeído reagem com o tampão durante a fixação causando despolimerização do aldeído.

[060] A etapa de contatar o biomaterial com a solução contendo álcool pode ser realizada por qualquer período de tempo contanto que seja suficiente para tornar o biomaterial resistente à calcificação patogênica in vivo e que a maior parte (i.e., uma alta porcentagem) dos grupos carboxila e amina encontrados no colágeno seja esterificada. Preferivelmente, o biomaterial permanece em contato com a solução contendo álcool por tempo suficiente para permitir que o álcool difunda e permeie no biomaterial. Mais preferivelmente, o biomaterial é exposto à solução contendo álcool por pelo menos 24 horas, mais preferivelmente ainda pelo menos 36 horas e mais preferivelmente, pelo menos 48 horas.

[061] Uma vez que o biomaterial baseado em colágeno tenha sido exposto ao álcool ele é removido. Em algumas representações, o biomaterial é enxaguado após a exposição ao álcool em uma solução de enxague compreendendo uma solução salina a 0,9% v/v livre de fosfato. Entretanto, qualquer solução não tamponada fisiologicamente aceitável pode ser usada como uma solução de enxague. O objetivo da solução de enxague é principalmente o de remover o excesso de álcool e como tal não é critica.

[062] Após o biomaterial baseado em colágeno ter sido exposto ao álcool por mais de 24 horas ele é então contatado com um ou mais agentes de reticulação, especialmente agentes de reticulação bifuncionais. O termo “bifuncional” como é usado aqui se refere aos dois grupos de aldeído funcionais, presentes em ambas as extremidades da cadeia de cinco carbonos. A reticulação pode ser realizada através de qualquer técnica conhecida na arte, com qualquer forma de agente de reticulação contanto que seja capaz de reticular o colágeno. Agentes de reticulação incluem, mas não estão limitados a, compostos de acilação, cloreto de adipila, aldeídos, halogenetos de alquila e arilo, bisimidates, carbodiimidas, divinil sulfona (DVS), formaldeído, glutaraldeído, glioxal, di-isocianato de hexametileno, hidroxicloreto, hidroxietilmetacrilato divinil sulfona (HEMA-DIS-HEMA), imidoésteres, isocianatos, luz (ex., luz azul e luz UV), N-hidroxissuccinimida, maleimidas N-substituídas, pH, polialdeído, difenilfosforilazida (DPPA), compostos de poliepoxi compreendendo a espinha dorsal de 17-25 carbonos e 4-5 grupos epóxi, éteres de poliepoxi, polietileno glicol divinil sulfona (VS-PEG-VS), poliglicerol éter poliglicidílico e temperatura e combinações dos mesmos.

[063] Em algumas representações, o agente de reticulação é um agente de reticulação químico como a carbodiimida, éteres de poliepoxi, divinil sulfona (DVS), genipina, glutaraldeído, formaldeído e difenilfosforilazida (DPPA).

[064] Também foi demonstrado que compostos de poliepoxi compreendendo a espinha dorsal de 17-25 carbonos e 4-5 grupos epóxi apresentam uma alta eficiência para a reticulação do colágeno (ver, por exemplo, o pedido de patente US No. 20040059430 (S/N 10/618,447). Também foi mostrado que a toxicidade dos compostos de poliepoxi é mais baixa do que a do glutaraldeído, e a antigenicidade ou indução resposta-imune dos tecidos diminui em proporção ao tempo de reação, no caso de reagir com moléculas de polipeptídeo helical como o colágeno. Naturalmente, apresenta uma biocompatibilidade relativamente boa (ver, por exemplo, Lohre et al., (1992), Artif. Organs, 16:630-633; Uematsu et al., (1998), Artif. Organs, 22:909913). Consequentemente, os compostos de poliepoxi como descritos são um agente de reticulação preferido.

[065] Em algumas representações, o agente de reticulação compreende aproximadamente 1% de glutaraldeído e o tempo de exposição de pelo menos aproximadamente 24 horas. Pode-se observar que o tempo para a exposição do biomaterial ao agente de reticulação depende do agente usado, a concentração e a temperatura. Tipicamente, o tempo de exposição fica entre 24 horas a 28 dias. A determinação da quantidade precisa do tempo de exposição do biomaterial ao agente de reticulação está dentro do escopo de um especialista no assunto.

[066] Mais uma vez, sem se fixar em qualquer teoria ou hipótese em particular, os inventores consideram que ao expor o biomaterial baseado em colágeno que já tenha sido exposto ao álcool a um agente de reticulação, os grupos carboxila e grupos amina esterificados no colágeno presente no biomaterial sejam reticulados.

[067] Ainda que seja observado pelos profissionais da área que a temperatura na qual cada uma das etapas do método preferido de reticulação é realizado não seja crucial, pode-se perceber que preferivelmente, a temperatura é entre 2°C e 40°C, mais preferivelmente entre 4°C e 30°C e mais preferivelmente ainda entre 5°C e 25°C.

[068] Novamente, após a etapa de reticulação, o biomaterial baseado em colágeno é preferivelmente enxaguado em solução de enxague como aquela usada após a etapa de exposição ao álcool (a). Entretanto, deve-se observar mais uma vez que a etapa de enxague é meramente uma preferência.

[069] Após a etapa de reticulação, ou se utilizada, a etapa de enxague após a etapa de reticulação, o biomaterial baseado em colágeno pode então ser esterilizado para uso pelos métodos aqui descritos. Alternativamente, o biomaterial baseado em colágeno é contatado com uma solução ácida contendo qualquer ácido capaz de inativar e/ou modificar as metades do agente de reticulação fixadas e/ou não fixadas presentes no biomaterial após a etapa (b) para remover ou reduzir locais de ligação de cálcio disponíveis. Alternativamente, ou em adição a, a solução ácida usada na etapa (c) contem qualquer ácido capaz de também reticular os grupos carboxila ativados com os grupos amina ativados no colágeno para formar ligações de amida.

[070] Preferivelmente, a solução ácida compreende pelo menos um ácido aminocarboxílico. O termo “ácido aminocarboxílico” como é usado aqui é qualquer ácido tendo pelo menos um grupo amino e pelo menos um substitutivo de ácido carboxílico. Exemplos representativos de ácidos aminocarboxílicos que são úteis na presente invenção incluem, mas não estão limitados a, L-glutamato, L-aspartato, L-lisina, L-arginina, L-histidina. O objetivo da solução ácida é duplo: primeiramente, o ácido aminocarboxílico auxilia na inativação e/ou modificação das metades do agente de reticulação fixadas e/ou não fixadas, dessa forma reduzindo ou aliviando quaisquer efeitos biológicos adversos. Em segundo lugar, o ácido aminocarboxílico ainda reticula os grupos carboxila ativados com os grupos amina ativados no colágeno para formar ligações de amida.

[071] A concentração do ácido aminocarboxílico dependerá do ácido usado e outros parâmetros como a massa total do biomaterial usado e outros. Em adição, um índice de peso úmido mínimo de ácido aminocarboxílico em relação ao biomaterial seria de aproximadamente 1:4. O aspecto mais importante da solução ácida é o pH. O pH deve ser abaixo de pH7, preferivelmente abaixo de pH6, mais preferivelmente abaixo de pH5 e mais preferivelmente ainda abaixo de pH4,6.

[072] Em uma representação, a solução ácida é de 8mg de ácido carboxílico por mililitro de água deionizada, que é livre de fosfato e aproximadamente pH4.

[073] O biomaterial baseado em colágeno reticulado é exposto ao ácido aminocarboxílico por pelo menos 6 horas, mais preferivelmente pelo menos 24 horas, mais preferivelmente ainda mais de 48 horas. Apesar da temperatura de incubação não ser crucial, ela é preferivelmente entre 5°C e 55°C, mais preferivelmente entre 10°C e 45°C, e mais preferivelmente ainda de aproximadamente 45°C.

[074] Em algumas representações, a etapa (c) do método de reticulação divulgado é substituída por ou suplementada por um método para inibir a formação de metaloproteinase nas moléculas de elastina presentes no biomaterial. Especificamente, em tecidos como o tecido aórtico, está presente uma porcentagem mais alta de elastina do que em outro tecido. Essas moléculas de elastina podem fornecer locais para a formação de metaloproteinase como esses locais precisam ser reduzidos, removidos ou inativados.

[075] O biomaterial baseado em colágeno reticulado, antes ou depois da etapa de expor o biomaterial à solução ácida e/ou solução não tamponada contendo um cátion multivalente, é mais uma vez preferivelmente enxaguada em solução de enxague. O biomaterial baseado em colágeno reticulado é então esterilizado.

[076] A etapa de esterilizar o biomaterial compreende contatar o biomaterial baseado em colágeno reticulado com uma solução de esterilização compreendendo entre 3% e 6% v/v de óxido de propileno e incubar o dito biomaterial entre 30°C e 55°C por mais de 48 horas; contanto que a solução de esterilização não contenha álcool.

[077] Pode-se observar que álcool, especialmente etanol e/ou isopropanol não é usado na solução de esterilização da presente invenção.

[078] Tem sido bem estabelecido que em temperaturas elevadas, por ex. acima de 55°C, o colágeno sofre degradação intracelular. Na verdade, foi demonstrado que o colágeno em fibroblastos da pele humana começa a sofrer maior degradação em temperaturas acima de 41°C (Palotie, 1983, Coll Relat Res. Mar; 3(2): 105-13). Assim sendo, na esterilização do biomaterial baseado em colágeno reticulado da presente invenção a temperatura de incubação é um fator crucial. A temperatura preferivelmente não é maior do que 55°C já que isso aumenta a chance do colágeno começar a degradar. Entretanto, como é descrito no Exemplo 9 e em outros locais, é importante que a temperatura de incubação não seja menor do que 30°C já que as temperaturas abaixo de 30°C reduziram o potencial de esterilização.

[079] Os profissionais da área poderão observar que concentrações de óxido de propileno abaixo de 3% não proporcionam esterilização suficiente como definido aqui. Concentrações de óxido de propileno acima de 6% são tóxicas e tem um efeito adverso na integridade do biomaterial. Em algumas representações, a solução de esterilização compreende entre 3,8% e 4,5% de óxido de propileno. Em outras representações, a solução de esterilização consiste essencialmente de entre 3% e 6% de óxido de propileno, mais preferivelmente a solução de esterilização consiste de entre 3% e 6% de óxido de propileno. Em algumas representações, a solução de esterilização consiste essencialmente de entre 3,8% e 4,5% de óxido de propileno, mais preferivelmente a solução de esterilização consiste de entre 3,8% e 4,5% de óxido de propileno. Em algumas representações, a solução de esterilização consiste essencialmente de aproximadamente 4% de óxido de propileno, mais preferivelmente a solução de esterilização consiste de aproximadamente 4% de óxido de propileno.

[080] O termo “aproximadamente” como é usado aqui se refere a um desvio no valor seguinte ao termo de 10% para mais ou para menos. Por exemplo, a referência a aproximadamente 4% de óxido de propileno inclui limites entre 3,6% e 4,4% i.e., 10% acima ou abaixo do valor de 4%. Isso inclui 3,7%, 3,8%, 3,9%, 4,0%, 4,1%, 4,2%, 4,3% e 4,4% de óxido de propileno.

[081] É uma exigência que a etapa de esterilização seja realizada por mais de 48 horas, no entanto, como é descrito aqui o óxido de propileno também pode ser usado domo um meio de armazenamento e como tal a etapa de esterilização pode ser realizada por pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 dias ou mais.

[082] Um importante benefício dos métodos aqui descritos é que a solução de esterilização usada aqui, i.e., entre 3% e 6% v/v de óxido de propileno não apenas irá esterilizar o tecido contendo colágeno sem afetar as fibrilas de colágeno, mas como o óxido de propileno se converte após aproximadamente 4 dias estando em contato com o biomaterial em propileno glicol (que não é tóxico), o biomaterial baseado em colágeno reticulado e esterilizado pode permanecer na solução de esterilização por bem mais das 48 horas iniciais. Na verdade, é previsto que o biomaterial baseado em colágeno reticulado será esterilizado e armazenado e então enviado no mesmo recipiente para o consumidor final sem a necessidade de qualquer outro manuseio.

[083] O termo “esterilização” como é usado aqui significa que o biomaterial baseado em colágeno reticulado satisfaz as exigências sob o ISO 14160. O ISO 14160 abrange a esterilização de produtos de assistência médica e pertence aos agentes líquidos de esterilização química para uso único de dispositivos médicos usando tecidos animais e seus derivados. Em resumo, o ISO 14160 exige que os tecidos sejam inoculados com esporos de B. subtilis e então tratados para remover a contaminação. As exigências para os testes para o ISO 14160 estão descritos no Exemplo 6 supra.

[084] Em algumas representações, a solução de esterilização não é tamponada. Em outras representações a solução compreende água deionizada.

[085] O biomaterial baseado em colágeno reticulado, após o tratamento com os métodos aqui divulgados, tem um alto nível de resistência à calcificação, i.e., é um “biomaterial resistente à calcificação”. O termo “calcificação” como é usado aqui se refere a um dos principais problemas patológicos associados a biomateriais produzidos tradicionalmente compreendendo proteínas do tecido conectivo (i.e., colágeno e elastina). Foi anteriormente demonstrado que esses materiais podem se tornar calcificados após a implantação no interior do corpo. Essa calcificação pode resultar em rigidez indesejável ou degradação do biomaterial. Sabe-se que dois (2) tipos de calcificação: intrínseca e extrínseca podem ocorrer em biomaterial colagenoso fixado, embora o(s) exato(s) mecanismo(s) através do(s) qual(is) isso ocorre sejam desconhecidos. A calcificação intrínseca é caracterizada pela precipitação de íons de cálcio e fosfato no interior do tecido bioprostético fixado, incluindo a matriz de colágeno e células remanescentes. A calcificação extrínseca é caracterizada pela precipitação de íons de cálcio e fosfato no interior do trombo aderente, incluindo células aderentes (ex., plaquetas) ao biomaterial e o desenvolvimento de placas de superfície contendo cálcio e fosfato no biomaterial.

[086] Consequentemente, a frase “alto nível de resistência à calcificação” ou “resistente à calcificação” quando aplicada ao biomaterial da presente invenção significa que o biomaterial, após a implantação in vivo por pelo menos 200 dias, apresenta menos de 50pg, preferivelmente menos de 20pg, e mais preferivelmente ainda menos de 10pg de cálcio per mg de tecido seco após a sua remoção.

[087] Preferivelmente, o biomaterial da presente invenção é também resistente à degradação enzimática. O termo “resistente à degradação enzimática” como é usado aqui se refere à capacidade do biomaterial da presente invenção de suportar a degradação enzimática em um nível comparável ao tecido fixado tradicional.

[088] Uma vez formado, o biomaterial baseado em colágeno reticulado e esterilizado da presente invenção pode ser então usado para tratar um número de doenças e/ou distúrbios.

[089] De modo geral, os termos “tratando”, “tratamento” e outros semelhantes são usados aqui para significar afetar um indivíduo ou animal, seus tecidos ou células para obter um efeito farmacológico e/ou fisiológico. O efeito é especialmente terapêutico em termos de uma cura parcial ou completa de uma doença e/ou distúrbio. “Tratando” como é usado aqui abrange qualquer tratamento de uma doença e/ou distúrbio em um vertebrado, um mamífero, particularmente um humano, e inclui: (a) inibir a doença e/ou distúrbio, i.e., impedindo o seu desenvolvimento; ou (b) aliviar ou melhorar os sintomas da doença e/ou distúrbio, i.e., causar a regressão dos sintomas da degradação enzimática/doença e/ou distúrbio.

[090] Os termos “doença” e/ou “distúrbio” são usados aqui de maneira intercambiável e se referem a condições anormais afetando animais, incluindo humanos, que podem ser tratadas usando o biomaterial da presente invenção.

Assim sendo, o tratamento de um ferimento, lesão, degeneração de tecido, uma infecção microbial, uma queimadura, uma ulcera, uma doença dermatológica, está incluído na presente invenção. Além disso, a substituição de válvulas cardíacas, raízes aórticas, folhetos aórticos, tecido do pericárdio, tecido conectivo, dura mater, tecido dérmico, um tecido vascular, cartilagem, pericárdio, ligamentos, vasos sanguíneos de tendão, tecido umbilical, tecido ósseo, fasciae, e tecido submucosa também são abrangidos.

[091] O material resistente à calcificação da presente invenção também pode ser aplicado a qualquer uma de uma ampla variedade de superfícies de contato de dispositivos médicos. Superfícies de contato incluem, mas não estão limitadas a, superfícies que devem contatar sangue, células ou outros fluidos corporais ou tecidos de um animal, incluindo especificamente um humano. Superfícies de contato adequadas incluem uma ou mais superfícies de dispositivos médicos que devem contatar sangue ou outros tecidos. Os dispositivos médicos incluem bobinas de aneurisma, vasos sanguíneos artificiais, corações artificiais, válvulas artificiais, rins artificiais, tendões e ligamentos artificiais, bolsa de sangue, oxigenadores de sangue, substitutivos ósseos e cardiovasculares, próteses ósseas, ceras de ossos, enxertos cardiovasculares, dispositivos de substituição de cartilagem, cateteres, lentes de contato, recipientes para cultura e regeneração de célula e tecido, partículas de embolização, sistemas de filtragem, enxertos, canais de guia, cateteres permanentes, instrumentos laboratoriais, microesferas, guias de crescimento de nervo, implantes oftálmicos, implantes ortopédicos, condutores de marca-passo, sondas, próteses, desvios, “stents”, apoios para peptídeos, instrumentos cirúrgicos, suturas, seringas, substitutivos do trato urinário, coberturas de ferimentos, curativos de ferimentos, dispositivos de cura de ferimentos e outros dispositivos médicos conhecidos.

[092] Outros exemplos de dispositivos médicos que se beneficiariam da aplicação da presente invenção ficarão claros para os profissionais da área cirúrgica e de procedimentos médicos e são consequentemente contemplados pela invenção imediata. A superfície de contato pode incluir uma malha, bobina, fio balão inflável ou qualquer outra estrutura que seja capaz de ser implantada em um local alvo, incluindo locais intravasculares, locais intraluminais, locais no interior do tecido sólido, e outros. O dispositivo implantável pode ser designado para implante temporário ou permanente. Esses dispositivos podem ser liberados por, ou incorporados em cateteres intravasculares e outros cateteres médicos.

[093] O processo de revestir as superfícies de tais dispositivos pode ser realizado através da técnica de revestimento de plasma, como está descrito no pedido internacional No. WO96/24392.

[094] “Compreendendo” significa incluindo, mas não limitado ao que quer que venha após a palavra “compreendendo”. Assim, o uso do termo “compreendendo” indica que os elementos listados são requeridos ou obrigatórios, mas que outros elementos são opcionais e podem estar ou não presentes. “Consistindo de” significa incluindo, e limitado a, o que quer que venha após a frase “consistindo de”. Assim, a frase “consistindo de” indica que os elementos listados são requeridos ou obrigatórios, e que nenhum outro elemento pode estar presente. “Consistindo essencialmente de” significa incluindo quaisquer elementos listados após a frase, e limitado a outros elementos que não interfiram com ou contribuam para a atividade ou ação especificada na divulgação dos elementos listados. Assim, a frase “consistindo essencialmente de” indica que os elementos listados são requeridos ou obrigatórios, mas que outros elementos são opcionais e podem estar ou não presentes dependendo de se eles afetam ou não a atividade ou ação dos elementos listados.

[095] A invenção será agora descrita a título de referência apenas aos seguintes exemplos não limitadores. Deve-se compreender, no entanto, que os exemplos seguintes são apenas ilustrativos, e não devem ser considerados de forma alguma como uma restrição à generalidade da invenção descrita abaixo. Exemplo 1 - Processamento e Armazenamento Básico do Biomaterial Coleta de biomaterial derivado de colágeno [096] Corações suínos de porcos adultos foram coletados em um abatedouro local e transportados para o laboratório em recipientes com gelo entre 2 a 4 horas após a morte. Os corações foram lavados duas vezes em solução salina gelada a 0,9% v/v e cuidadosamente limpos de gordura aderente e tecido conectivo solto. As raízes aórticas com as válvulas aórticas foram dissecadas dos corações e colocadas em solução salina a 0,9% v/v gelada/fenil-metil-sulfonil/fluoreto (PMSF) e as raízes aórticas valvuladas lavadas por 20 minutos na solução salina a 0,9% v/v contendo PMSF. Os folhetos das válvulas foram removidos do orifício da válvula aórtica e armazenados em solução salina gelada a 0,9% v/v.

Reticulação (Fixação) do Biomaterial [097] Uma solução de 0,625 v/v de glutaraldeído contendo 9,07g/l de tampão de fosfato di-hidrogenado de potássio em água estéril deionizada foi preparada. O pH da solução de glutaraldeído foi ajustado para 7,4 com hidróxido de sódio. Os folhetos da válvula aórtica foram reticulados na solução de glutaraldeído a 1-5/C por um período mínimo de 5 dias para reticular proteínas presentes no colágeno dos tecidos.

Enxaguando o biomaterial reticulado [098] Os folhetos da válvula aórtica foram removidos da solução de glutaraldeído e enxaguados em uma solução estéril de cloreto de sódio a 0,9% v/v por aproximadamente 15 minutos. Durante o período de enxague, a temperatura da solução de enxague foi mantida a aproximadamente 10°C.

Esterilização final e armazenamento do biomaterial [099] Os folhetos da válvula aórtica suína foram imersos em uma solução de glutaraldeído a 2,0% v/v contendo 29,02 g/l de tampão de fosfato di- hidrogenado de potássio em água estéril deionizada. O pH da solução de aldeído foi ajustado para 7,4 com hidróxido de sódio. O processo de esterilização foi realizado a aproximadamente 25°C por 5 dias. Os tecidos esterilizados foram divididos em quatro grupos e armazenados em: (i) 0,625% v/v de glutaraldeído, (ii) 5,0% v/v de glutaraldeído, (iii) 10% v/v de glutaraldeído; e (iv) 2% v/v de óxido de propileno até utilização posterior.

Exemplo 2 - Efeito da Solução de Armazenamento no Perfil de Calcificação do Biomaterial [100] Estudos experimentais em pequenos e grandes modelos de animais foram conduzidos para avaliar a eficácia do processo de esterilização-armazenagem acima descrito em mitigar a calcificação de biomateriais contendo colágeno tratados.

[101] No primeiro estudo animal, folhetos de válvula aórtica suína esterilizados e armazenados de acordo com os métodos descritos no Exemplo 1 foram usados para avaliação em um pequeno modelo animal.

[102] Folhetos de válvula aórtica suína esterilizados e armazenados de todos os quatro grupos foram enxaguados em solução salina a 0,9% v/v por 5 minutos. Os tecidos enxaguados foram implantados cirurgicamente em bolsos subcutâneos (uma amostra para cada grupo por rato), criados na área da parede abdominal central de ratos machos Wistrar em crescimento (com seis semanas de idade). Esses tecidos foram removidos após 60 dias, o tecido hospedeiro removido e as amostras secas em um incubador Biotherm™1 (Marcus Medical, JHB, RSA) a 90°C por 48 horas. As amostras secas foram pesadas, e o conteúdo de cálcio extraído em 5,0ml 6 N de ácido clorídrico ultrapuro (Merck, JHB, RSA) a 75°C por 24 horas. O conteúdo de cálcio extraído foi então medido usando um espectrofotômetro de absorção atômica (Varian AA1275) e expressado como pg de cálcio por MG de tecido (peso seco). Esses dados foram resumidos na Tabela 1. Os resultados (pg de cálcio por mg de tecido seco) estão resumidos na Tabela 1.

Tabela 1 Sol. de Armazenamento Meio ± erro padrão Glutaraldeído (0.625 %) 70.146g Ca/mg Tecido ± 7.037 Glutaraldeído(5.0 %) 88.439g Ca/mg Tecido ± 4.470 Glutaraldeído(10.0 %) 66.870g Ca/mg Tecido ± 13.235 Ox. Propileno(2.0%) 25.311g Ca/mg Tecido ± 5.292 Exemplo 3 - Efeito da Solução de Esterilização & Armazenamento no Perfil de Calcificação do Biomaterial Coleta de um biomaterial derivado de colágeno [103] No segundo estudo animal, folhetos de válvula aórtica suína foram coletados e isolados de acordo com o método descrito no Exemplo 1. Folhetos de válvula aórtica suína isolados foram divididos em três grupos. O Grupo 1 recebeu um tratamento típico de reticulação (controle); o Grupo II recebeu um método proprietário de reticulação (ver WO2006/066327 aqui incorporado a título de referência); e o Grupo III recebeu o mesmo tratamento de reticulação do Grupo II, mas este foi seguido pela incubação do biomaterial reticulado com uma solução de esterilização compreendendo aproximadamente 4% v/v de óxido de propileno e a incubação do biomaterial entre 30°C e 55°C por mais de 48 horas.

Reticulação (Fixação) dos folhetos da válvula aórtica [104] No Grupo I, os folhetos da válvula aórtica suína foram reticulados em uma solução de glutaraldeído a 0,625% contendo 9,07g/l de tampão de fosfato di-hidrogenado de potássio em água estéril deionizada que foi preparada. O pH da solução de glutaraldeído foi ajustada para 7,4 com hidróxido de sódio. Os folhetos da válvula aórtica foram reticulados na solução de glutaraldeído a 1-5°C por um período mínimo de 5 dias para reticular as proteínas presentes no colágeno dos tecidos.

[105] Nos Grupos II e II, uma solução contendo álcool solúvel em água de 60-80% v/v por volume de álcool etanol foi preparada. Os folhetos da válvula aórtica suína foram imersos na solução de álcool após armazenamento durante a noite a 4°C. As raízes aórticas valvuladas foram imersas na mesma solução de álcool imediatamente após a lavagem final em solução salina gelada a 0,9% v/v (contendo 0,5mM de PMSF). Os folhetos da válvula aórtica suína foram mantidos na solução de álcool a aproximadamente 5°C por um mínimo de 24 horas.

[106] Os folhetos da válvula aórtica suína foram removidos da solução de álcool e enxaguados por aproximadamente 10 minutos com solução salina a 0,9% v/v. Durante o período de enxague, a temperatura da solução de enxague foi mantida a aproximadamente 10°C.

[107] Os folhetos da válvula aórtica foram imersos em uma solução de glutaraldeído a 0,625% v/v contendo 9,07g/l de tampão de fosfato di-hidrogenado de potássio em água estéril deionizada. O pH da solução de glutaraldeído foi ajustado com hidróxido de sódio. O pericárdio e as raízes aórticas valvuladas foram fixados na solução de glutaraldeído a 1-5°C por um período mínimo de 24 horas para reticular proteínas presentes no colágeno dos tecidos.

[108] Os folhetos da válvula suína foram removidos da solução de glutaraldeído e enxaguados em uma solução estéril de cloreto de sódio a 0,9% v/v por aproximadamente 15 minutos. Durante o período de enxague, a temperatura da solução de enxague foi mantida a aproximadamente 10°C.

[109] Os folhetos da válvula aórtica suína foram então imersos em uma solução não tamponada contendo 8mg de ácido dicarboxílico por 1ml de volume de água deionizada. O pH da solução foi ajustado para um pH de 4,5 com um volume de ácido clorídrico. O pericárdio e as raízes aórticas valvuladas foram imersos na solução a uma temperatura de aproximadamente 45°C por aproximadamente 48 horas.

Esterilização final e armazenamento do biomaterial [110] Os folhetos da válvula aórtica suína foram então esterilizados e armazenados em: (i) imersão do tecido em uma solução de 0,25% v/v de glutaraldeído contendo 9,07g/l de tampão de fosfato di-hidrogenado de potássio em água estéril deionizada. O pH da solução de aldeído foi ajustado para 7,4 com hidróxido de sódio. O processo de esterilização foi realizado em uma temperatura de 45°C por aproximadamente 120 minutos (Tratamento A); ou (ii) os folhetos da válvula aórtica suína foram esterilizados em uma solução aquosa compreendendo 4% v/v de óxido de propileno por peso combinado com 20% v/v de álcool etílico a 37°C por aproximadamente 24 horas e armazenados em uma solução de 4% v/v de óxido de propileno (Tratamento B - presente invenção).

[111] Folhetos de válvula aórtica suína esterilizados e armazenados de todos os três grupos foram enxaguados em solução salina a 0,9% v/v por 5 minutos. Os tecidos enxaguados foram implantados cirurgicamente em bolsos subcutâneos (uma amostra de cada grupo por rato), criados na área da parede abdominal central de ratos machos Wistar em crescimento (6 semanas de idade). Esses tecidos foram removidos após 60 dias, o tecido hospedeiro removido e as amostras secas em um incubador BiothermTM (Selby Scientific, Perth, WA) a 90°C por 48 horas. As amostras secas foram pesadas, e o conteúdo de cálcio extraído em 5,0ml 6 N de ácido clorídrico ultrapuro (Merck, Sydney, Australia) a 75°C por 24 horas. O conteúdo de cálcio extraído foi então medido usando um espectrofotômetro (Varian AA1275) e expressado como pg de cálcio por mg de tecido (peso seco). Os resultados (pg de cálcio por mg de tecido seco) estão resumidos na Tabela 2.

Tabela 2 Sol. de Armazenamento Meio ± erro padrão Glutaraldeído (0.625 %) 174.525g Ca/mg Tecido ± 6.884 Tratmento A 0.25% 3.300g Ca/mg Tecido ± 0.289 Glutaraldeído Tratmento B 4% Ox. 1.325g Ca/mg Tecido ± 0.317 Propileno Exemplo 4 - Efeito do Tratmento B no Perfil de Calcificação do Pericárdio Bovino [112] Em um terceiro estudo animal, o potencial de calcificação do pericárdio bovino preparado, reticulado e armazenado de acordo com os tecidos no Exemplo 3 (0.625% de glutaraldeído, Tratamento A + 0.2% glutaraldeído e Tratamento B 4% v/v de óxido de propileno) foi comparado com o potencial de calcificação do pericárdio bovino comercial (pericárdio Hancock) armazenado em uma solução de 0.2% de glutaraldeído.

[113] Amostras representativas de cada grupo foram reduzidas a 1 x 1cm de tamanho e enxaguadas em solução salina a 0,9% v/v por 5 minutos. Essas amostras foram implantadas cirurgicamente em bolsos subcutâneos, criados na área da parede dorsal central de ratos machos Wistar em crescimento (6 semanas de idade). Esses tecidos foram removidos após 60 dias, o tecido hospedeiro removido e o conteúdo de cálcio determinado por espectrofotometria de absorção atômica. Os resultados (pg de cálcio por mg de tecido seco) estão resumidos na Tabela 3.

Tabela 3 Sol. de Armazenamento Meio ± erro padrão Glutaraldeído (0.625 %) 136.025 pg Ca/mg ± 11.385 Tecido ADAPT + 0.25% 4.100 pg Ca/mg Tecido ± 0.204 Glutaraldeído ADAPT + 4% v/v Ox. 1.100 pg Ca/mg Tecido ± 0.147 propileno Pericárdio Hancock 6.375 pg Ca/mg Tecido ± 1.993 (em 0.2% Glutaraldeído) Exemplo 5 Efeito do Tratamento B no Perfil de Calcificação do Tecido da Válvula Aórtica Suína (Folhetos da Válvula & Parede Aórtica) em um Modelo Animal Grande [114] No quarto estudo animal, o potencial de calcificação do tecido da válvula aórtica suína (folhetos da válvula e parede aórtica) preparado, reticulado em 0,625% de glutaraldeído tamponado e armazenado em (i) 0,625% de glutaraldeído, (ii) tratado com Tratamento A (0,625% de glutaraldeído) e (iii) tratado com Tratamento B (4% de óxido de propileno).

[115] Exemplos representativos de cada grupo foram reduzidos a um tamanho de formato oval de aproximadamente 1,2 x 1 cm e enxaguados em solução salina a 0,9% por 5 minutos. Essas amostras foram implantadas cirurgicamente na veia jugular de ovinos jovens (peso corporal de 22-25 kg). Esses tecidos foram removidos após 150 dias, o tecido hospedeiro removido e o conteúdo de cálcio determinado por espectrofotometria de absorção atômica. Os resultados (pg de cálcio por mg de tecido seco) estão resumidos na Tabela 4-A (Folhetos da válvula) e Tabela 4-B (Parede aórtica).

Tabela 4-A (Folhetos da Válvula) Sol. de Armazenamento Meio ± erro padrão 0.625 % Glutaraldeído 211.100g Ca/mg Tecido ± 3.134 2% Óxido de Propileno 93.167g Ca/mg Tecido ± 23.764 Tratamento B (4% óxido de 93.167g Ca/mg Tecido ± 12.442 propileno) Tabela 4-B (Parede aórtica) Sol. de Armazenamento Meio ± erro padrão 0.625 % Glutaraldeído 59.444g Ca/mg Tecido ± 12.263 2% Óxido de Propileno 28.633g Ca/mg Tecido ± 8.370 Tratamento B (4% óxido de 18.287g Ca/mg Tecido ± 7.305 propileno) Exemplo 6 - Validação: Esterilização de Válvula Cardíaca Comercial Inoculada com Esporos de Bacillus subtilis [116] Essa validação foi realizada para testar a viabilidade de se esterilizar o tecido da válvula cardíaca comercial com 4% de óxido de propileno após 48 horas a 45°C. O objetivo deste estudo de viabilidade foi o de investigar se 3,8% de óxido de propileno (como um nível pior de concentração) é capaz de esterilizar válvulas cardíacas comerciais x tecido sob as piores condições (contaminação com esporos de Bacillus subtilis) prescrito pelo regulamento da FDA. As condições do teste foram as seguintes: - As válvulas foram removidas do Glutaraldeído a 0,5% e enxaguadas em um total de 1000 ml de água destilada estéril por um total de 6 minutos. - O suporte da válvula e a válvula foram então assepticamente separados e então secados por aproximadamente 30 minutos ou até estarem visivelmente secos. - O suporte da válvula e a válvula de cada dispositivo foram então inoculados com um total de 20pl de uma suspensão de esporos de Bacillus subtilis obtidos de STERIS Corporation, USA. A suspensão continha 1,25 x 106 esporos. - As válvulas foram então deixadas a secar por aproximadamente 1 hora em temperatura ambiente. - Os dispositivos foram então remontados conforme recibo e colocados em um jarro estéril. - Para dez dispositivos, 160 mls de óxido de propileno a 3,8% recém preparado foram adicionados. - Para o dispositivo final, 160 mls de Meio de Digestão Soja-Caseína (SCDM) foram adicionados. Esse foi o controle positivo para avaliar a viabilidade da suspensão de esporo. O controle positivo foi incubado a 32°C por 48 horas. - As dez válvulas de teste foram então incubadas a 42°C por 44 horas. - Após a incubação, um teste de esterilidade foi realizado em cada válvula. - As válvulas foram separadas e cada componente transferido para uma jarra estéril vazia, na qual SCDM foi adicionado. - As jarras foram então incubadas a 32°C por 14 dias. - As jarras foram examinadas diariamente para buscar sinais de turvação.

[117] Detalhes do teste: Número de Laboratório: 7343042W Método: Método de acordo com Teste de Esterilidade, Anexo XVI, British Pharmacopoeia, 2010, e procedimento de Instalação de Teste Farmacêutico MB:PT:0110.

Tabela 5 Teste Resultados SCDM: Nenhum crescimento foi detectado após 14 dias de incubação a 32°C.

Teste de Estase: Realizado na expiração do período de teste. SCDM apresentou crescimento visível de C. albicans dentro das 48 horas.

Controle Positivo: Crescimento detectado após 24 horas. Crescimento identificado como B. subtilis.

Exemplo 7 - Efeito do Tratamento B no Perfil de Calcificação do Tecido de Válvula Cardíaca Comercial (Tecido Pericardial Bovino) em um Modelo Animal Pequeno [118] A tabela 6 mostra os resultados de um quinto estudo animal no qual o potencial de calcificação do pericárdio bovino reticulado e esterilizado em 0,625% v/v de glutaraldeído (que serviu como controle de referência -marcado A) foi comparado com tecido de válvula cardíaca comercial (pericárdio bovino, reticulado e armazenado de acordo com um protocolo proprietário comercial que é reticulação em 0,625% v/v de glutaraldeído + armazenamento em formaldeído - marcado B) e o mesmo tecido de válvula cardíaca comercial esterilizado a 45°C por 48 horas em 4% v/v de óxido de propileno e armazenado em solução de 4% v/v de óxido de propileno - marcado C.

[119] Exemplos representativos de cada grupo foram reduzidos a um tamanho de 1 x 1cm e enxaguados em solução salina a 0,9% por 5 minutos. Essas amostras foram implantadas cirurgicamente em bolsos subcutâneos, criados na área da parede dorsal central de ratos machos Wistar em crescimento (6 semanas de idade). Esses tecidos foram removidos após 8, 16, e 24 semanas, o tecido hospedeiro removido e o conteúdo de cálcio determinado por espectrofotometria de absorção atômica. Os resultados (pg de cálcio por mg de tecido seco) estão resumidos na Tabela 6.

Exemplo 8 - Efeito do Tratamento B no Perfil de Calcificação de Tecido de Válvula Cardíaca Comercial (Pericardial Bovino) Tecido em um Modelo de Calcificação Rápida In Vitro [120] Em uma outra avaliação experimental, o potencial de calcificação do tecido de válvula comercial (tecido controle) foi comparado com tecido de válvula cardíaca comercial esterilizado a 45°C por 48 horas em 4% de óxido de propileno e armazenado em 4% de solução de óxido de propileno (tecido tratado) em um modelo de calcificação rápida in vitro.

[121] Válvulas cardíacas comerciais “stented” (controle e tratadas) foram preparadas em um provador Rowan Ash Fatigue e expostas a uma solução fisiológica (com um alto conteúdo cálcio/fosfato) durante fluxo acelerado (400 ciclos de teste por minuto) até 50 milhões de ciclos.

[122] Após 50 milhões de ciclos de teste, as válvulas cardíacas foram removidas e uma amostra de tecido representada foi retirada para histologia. O tecido remanescente de cada um dos três folhetos de válvula foi removido e o conteúdo de cálcio foi determinado por espectrofotometria de absorção atômica. Os resultados (pg de cálcio por mg de tecido seco) estão resumidos na Tabela 7.

Tabela 7 Tecido de válvula Meio ± erro padrão Válvula comercial 49.71 pg Ca/mg tecido ± 2.112 Válv. comercial + 4% Óxido de 32.34 pg Ca/mg tecido ± 1.336 Propileno Exemplo 9 Efeito da Esterilização e Metodologia de Armazenamento Tecido Inoculado com Esporos de Bacillus subtilis [123] As Figuras 1 e 2 mostram o efeito de 2% v/v e 4% v/v de óxido de propileno (respectivamente) em temperaturas variadas entre 15°C e 45°C em esporos de B. subtilis durante um período de tempo. As condições do experimento usado são descritas no Exemplo 6. Essencialmente, pode-se observar que nenhuma das soluções de esterilização (2% ou 4%) teve pouco efeito de esterilização antes de 48 horas. Também se pode observar na Figura 2 que dentro de 48 horas o efeito do aumento de temperatura tem um profundo efeito na esterilização. Por exemplo, a uma temperatura de 40°C e acima houve esterilização após 24 horas e que até 48 horas houve esterilização mesmo em temperaturas de 25°C e acima. A Figura 1 mostra que de modo a se obter esterilização com 2% v/v de óxido de propileno o tecido precisa ser incubado por pelo menos 6 dias a temperaturas acima de 35°C. Mesmo a incubação por 10 dias de 15 a 20°C não tem efeito material na esterilização com 2% v/v de óxido de propileno.

[124] Dessa forma, pode-se observar nas Figuras 1 e 2 que uma esterilização ideal é obtida pela incubação do tecido com uma solução de óxido de propileno a 4% v/v e incubação do tecido a aproximadamente 45°C por mais de 48 horas.

REIVINDICAÇÕES

Claims (10)

1. Método para esterilizar e estocar um biomaterial baseado em colágeno reticulado caracterizado por compreender: (i) contatar o dito biomaterial baseado em colágeno reticulado com uma solução de esterilização compreendendo entre 3% e 6% v/v de óxido de propileno e incubar o dito biomaterial entre 30°C e 55°C por mais de 48 horas, onde a solução de esterilização não contem álcool e então; (ii) estocar o dito biomaterial na solução de esterilização ao menos até que o óxido de propileno na solução de esterilização tenha se convertido in situ para propileno glicol na presença do biomaterial.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a temperatura de incubação estar entre 35°C e 50°C.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a temperatura de incubação ser 45°C.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por a temperatura de incubação após 48 horas ser reduzida para temperatura ambiente.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por a solução de esterilização compreender entre 3,8% e 4,5% v/v de óxido de propileno.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por a solução de esterilização compreender 4% v/v de óxido de propileno.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por o biomaterial baseado em colágeno ser isolado de um animal do grupo consistindo de um ovino, um bovino, um caprino, um equino, um suíno, um marsupial e um humano.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por o biomaterial ser um tecido celular selecionado do grupo consistindo de tecido cardiovascular, tecido cardíaco, válvula cardíaca, raízes aórticas, parede aórtica, folhetos aórticos, tecido pericardial, tecido conectivo, dura mater, tecido dérmico, um tecido vascular, cartilagem, pericárdio, ligamento, tendão, vasos sanguíneos, tecido umbilical, tecido ósseo, fasciae, e tecido submucosa e pele.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8 caracterizado por o biomaterial baseado em colágeno ser reticulado pelo contato do mesmo com solução de glutaraldeído a 0,625% v/v e fosfato dihidrogenado de potássio em pH de 7,4 e incubado por um período mínimo de 24 horas a 1 a 5oC.

10. Recipiente caracterizado por compreender um biomaterial baseado em colágeno reticulado, esterilizado, e uma solução de estocagem de propileno glicol de 3% a 6% v/v, onde a solução de estocagem resultou da conversão in situ de uma solução de esterilização de óxido de propileno de 3% a 6% v/v enquanto na presença do biomaterial dentro do recipiente, onde a solução de esterilização não contem álcool.