CN104114195A - 消毒方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及消毒可植入生物材料的方法。具体地，本发明涉及用于消毒交联的胶原基生物材料的方法，包括使所述交联的胶原基生物材料接触包括3％和6％v/v之间的氧化丙烯的消毒溶液和在30℃和55℃之间温育所述生物材料大于48小时；条件是消毒溶液不包含醇。

Description

消毒方法

技术领域

本发明涉及消毒可植入生物材料的方法。具体地，本发明涉及消毒含胶原可植入生物材料和其后保存的方法。

发明背景

可植入生物材料，尤其是胶原基生物材料，要求消毒并常常在使用前存储。通常，存在两大类的可植入胶原基生物材料：(1)天然组织和(2)化学交联组织。因此，根据胶原基生物材料的类型和是否已经发生交联，存在对消毒组织以及消毒后存储组织的手段的需要。

化学交联的胶原基生物材料，诸如心血管补片、心瓣膜、基质和动脉，常常在交联后被消毒并存储在消毒溶液中，直到移植。在过去三十至四十年间，已经测试和实施了若干化学交联的胶原基生物材料的消毒方法，包括γ辐射、UV辐射和各种化学剂。尽管这些消毒方法大部分能有效预防污染，但不良作用，诸如结构损坏(肽键切割)和组织退化(抗拉强度降低)，已经使得一些这样的方法在工业应用中较不受欢迎。

例如，与戊二醛交联的胶原基生物材料在暴露于醇基消毒溶液时会变得化学不稳定，这是由于醇与组织中存在的残留和未结合戊二醛的相互作用。醇与醛反应时形成不稳定的半乙酰基。这些不稳定的半乙酰基能够与醇反应，形成乙酰基，乙酰基可分离，形成醛和醇。

因此，目前，大部分胶原基生物材料制造商更喜欢使用戊二醛-甲醛组合用于化学交联和非醛剂用于消毒。一种这样的非醛剂是环氧乙烷(ethylene oxide,oxirane)气体，其已被用于消毒机械心瓣膜许多年。环氧乙烷气体也已被用于消毒各种医疗装置、一次性物品和机械心瓣膜。

一旦胶原基生物材料已经被消毒，其通常在植入前被保存一段时间。中长期存储胶原基生物材料要求在生理学上稳定的溶液中充分保护免于污染。尽管大部分商售胶原基生物材料仍存储于醛基溶液中，但不良作用，诸如钙化和纤维化也是众所周知的。

自1970年代以来，氧化丙烯已被用作消毒剂(见例如，Hart&Brown,1974,ApplMicrobiol,Dec.p.1069-1070；Brown&Ng,1975,Appl Microbiol,Sept.p483-484)。在每种情况下，包括5％氧化丙烯加70％异丙醇或0.5％洗必泰或2％溴化十六烷基三甲铵的溶液能有效破坏细菌孢子悬浮物。然而，虽然已经记录了氧化丙烯的使用，但这通常是在醇(乙醇或异丙醇)的存在下应用的。因此，醇作为添加剂用于氧化丙烯消毒醛交联组织(含残留的醛)会导致醛水平升高，这又提高这些组织的钙化可能和最终的生物假体失败。

因此，需要的是有效的消毒方法，该方法不仅消毒化学交联的胶原基生物材料，而且还为消毒的生物材料提供便利的存储介质。

发明内容

本发明者已经发明了方法，该方法克服或至少缓解了与通常使用的用于交联的胶原基生物材料的消毒和/或存储方法有关的问题。

因此，在第一方面，本发明提供消毒交联的胶原基生物材料的方法，包括使所述交联的胶原基生物材料接触包括3％和6％v/v之间的氧化丙烯的消毒溶液和在30℃和55℃之间温育所述生物材料大于48小时；条件是消毒溶液不包含醇。

在一些实施方式中，温育温度在30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃和55℃之间。在其它实施方式中，温育温度在30℃和31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃或55℃之间。换言之，在范围30℃和55℃之间的所有温度组合均被考虑。在一些实施方式中，温育温度优选在35℃和50℃之间，更优选在40℃和48℃之间。在一些实施方式中，温育温度是大约45℃。

当温育阶段过去后，即，已经过去大于48小时，允许使温度降至室温。事实上，在初始48小时后，与在此时一样，消毒的交联的胶原基生物材料可保持在室温一定的时间。当消毒的交联的胶原基生物材料在氧化丙烯中已被温育至少4天后，氧化丙烯将已经转化成丙二醇和胶原基生物材料将即可使用。

在一些实施方式中，消毒溶液包含3.8％和4.5％v/v之间的氧化丙烯。在其它实施方式中，消毒溶液包含大约4％v/v的氧化丙烯。在一些实施方式中，消毒溶液主要由3％和6％v/v之间的氧化丙烯组成，更优选消毒溶液由3％和6％v/v之间的氧化丙烯组成。在一些实施方式中，消毒溶液主要由3.8％和4.5％v/v之间的氧化丙烯组成，更优选消毒溶液由3.8％和4.5％v/v之间的氧化丙烯组成。在一些实施方式中，消毒溶液主要由约4％v/v的氧化丙烯组成，更优选消毒溶液由约4％v/v的氧化丙烯组成。

应该理解，醇，尤其是乙醇和/或异丙醇不用于本发明的消毒溶液。

要求消毒步骤进行大于48小时(2天)；然而，因为消毒溶液也可被用作存储介质，所以消毒步骤可进行2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多天。

交联的胶原基生物材料可以是任何材料，包含胶原、主要由胶原组成或由胶原组成。在一些实施方式中，胶原基生物材料直接分离自动物。生物材料可分离自任何动物，无论是来自与接受者相同的物种或来自与接受者不同物种的动物。优选地，动物来自哺乳动物目之一，即，偶蹄目(Artiodactyla)、兔形目(Lagomorpha)、啮齿目(Rodentia)、奇蹄目(Perissodactyla)、食肉目(Carnivora)和有袋目(Marsupialia)。更优选地，动物选自绵羊、牛、山羊、马、猪、有袋类动物和人。

生物材料可以是任意类型的细胞组织。优选地，细胞组织选自心血管组织、心组织、心瓣膜、主动脉根、主动脉壁、主动脉小叶、心包组织、结缔组织、硬膜、皮组织、血管组织、软骨、心包膜、韧带、腱、血管、脐组织、骨组织、筋膜、和粘膜下层组织和皮肤。

在一些实施方式中，生物材料是和/或包含不连续的，即，分离的胶原，而不是天然产生的含胶原组织。不连续的胶原可以其分离状态使用或形成本领域中已知的任意医疗装置或制品。

在一些实施方式中，生物材料是培养的组织、含获自动物的细胞外基质的假器官、重构组织(例如胶原基质)或类似物。

还应该理解，生物材料可进一步包含由合成聚合物、生物聚合物或两者——包括通常在天然组织基质中发现的那些在内——形成的合成类似物。合适的合成聚合物包括，例如聚酰胺和聚砜。生物聚合物可以是天然产生的或通过例如发酵和类似方法体外产生。

在第二方面，本发明提供用于消毒胶原基生物材料的方法，包括：

(a)提供胶原基生物材料并用冰冷的0.9％v/v盐水溶液进行洗涤，并且，将所述生物材料放入冰冷的0.9％v/v盐水/苯基-甲基-磺酰基-氟化物(PMSF)中；

(b)使所述胶原基生物材料与0.625％v/v的戊二醛溶液和磷酸二氢钾，pH7.4接触，并将其在大约1-5℃温育至少5天，以产生交联的胶原基生物材料；

(c)在大约10℃，在无菌0.9％v/v氯化钠中漂洗所述交联的胶原基生物材料，然后使交联的胶原基生物材料与包括3.8％和4.5％v/v之间的氧化丙烯的消毒溶液接触，和在30℃和55℃之间温育所述组织大于48小时；条件是消毒溶液不包含醇。

在第三方面，本发明提供存储消毒的、交联的胶原基生物材料的方法，包括使交联的胶原基生物材料与包括3％和6％v/v之间的氧化丙烯的溶液接触，和在30℃和55℃之间温育所述生物材料大于48小时，然后使所述生物材料保持接触所述氧化丙烯，直到它们转化成丙二醇；条件是溶液不包含醇。

在第四方面，本发明提供由根据第一、第二或第三方面的方法产生的消毒的、交联的胶原基生物材料。

应该理解，当通过本发明方法已经获得消毒的、交联的胶原基生物材料后，其可被可植入生物装置包括。因此，在第五方面，本发明提供可植入生物装置，其包括根据第四方面的消毒的、交联的胶原基生物材料。

在本发明的进一步的方面，本发明交联的胶原基生物材料包含在试剂盒中，用于修复组织损伤。因此，在第六方面，本发明提供试剂盒，用于修复组织损伤，试剂盒包括：

(a)无菌容器，其包含根据第四方面的消毒的、交联的胶原基生物材料或根据第五方面的装置；和

(b)在受伤对象上使用的说明书。

在第七方面，本发明提供容器，其包括消毒的、交联的胶原基生物材料和3％至6％v/v的丙二醇溶液，其中所述丙二醇产生自3％至6％v/v的氧化丙烯溶液在生物材料存在时的原位转化。

本发明胶原基生物材料可通过本领域中已知的任意交联胶原的方法而被交联，所述交联胶原的方法包括、但不限于Eyre等,1984,Annu.Rev.Biochem.537,717-748；Eyre,1982,In:Symposium on Heritable Disorders of Connective Tissue(Akeson等eds)pp.43-58,Mosby,St.Louis,Missouri；Davison&Brennan,1983,Connect.Tissue Res.11,135-151；Robins,1982,Methods Biochem.Analysis,28,330-379；Reiser,1991,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.196,17-29中描述的方法，其均通过引用以其整体并入本文。然而，交联本发明胶原基生物材料的优选方法包括：

(a)使胶原基生物材料暴露于含醇溶液至少24小时；

(b)使步骤(a)中所述生物材料暴露于交联剂；和

(c)使步骤(b)中所述生物材料暴露于酸性溶液；

其中步骤(b)和(c)与步骤(a)是连续的。

步骤(a)中使用的含醇溶液优选是水基液体，即，具有大于按体积计约50％v/v醇和优选60％至80％之间醇的水溶液。可以使用缓冲或非缓冲含醇溶液；然而，优选使用非缓冲含醇溶液，因为已经发现，缓冲含醇溶液不利地影响随后的交联程序，产生黄色生物材料。

优选交联方法可在含醇溶液中使用本领域中已知的任何醇。优选地，在不含缓冲剂的溶液中，醇是C₁-C₆低级醇。甚至更优选地，醇选自甲醇、乙醇、环己醇、异丙醇、丙醇、丁醇、戊醇、异丁醇、仲-丁醇和叔-丁醇。

在一些实施方式中，含醇溶液包含两种或更多种醇的混合物，条件是醇的组合的体积大于50％v/v。例如，约70％v/v乙醇和约10％v/v异丁醇的混合物是有效的。

步骤(a)中的生物材料可被暴露于含醇溶液任意长的时间，只要其足以使生物材料抵抗体内致病钙化。优选地，生物材料保持接触含醇溶液足够长的时间，以使醇能够扩散和渗透到生物材料中。更优选地，生物材料被暴露于含醇溶液至少24小时，甚至更优选至少36小时和最优选地，至少48小时。

暴露于含醇溶液之后，生物材料被移除和暴露于一种或更多种交联剂。本领域中已知的任意形式的交联剂或其组合均可被使用，只要其能够交联胶原。因此，应该理解，交联剂包括但不限于二乙烯基砜(DVS)、聚乙二醇二乙烯基砜(VS-PEG-VS)、羟乙基甲基丙烯酸酯二乙烯基砜(HEMA-DIS-HEMA)、甲醛、戊二醛、醛、异氰酸酯、烷基和芳基卤化物、亚氨酸酯、N-取代的马来酰亚胺、乙酰化化合物、碳二亚胺、羟基氯化物、N-羟基琥珀酰亚胺、光(例如，蓝光和UV光)、pH、温度和其组合。优选地，交联剂是化学交联剂，选自碳二亚胺、聚环氧醚、二乙烯基砜(DVS)、聚醛和二苯基磷酰基叠氮化物(DPPA)。

在一些实施方式中，聚醛是双-、三-或二-醛。戊二醛是特别优选的。

在一些实施方式中，交联步骤(b)之后是步骤(c)——具有或不具有介入的洗涤步骤。步骤(c)中使用的酸性溶液包含能够失活和/或改性步骤(b)后生物材料中存在的固定和/或未固定交联剂部分以去除或减少可用的钙结合点的任何酸。可选地，或者另外，步骤(c)中使用的酸性溶液含有能够进一步交联胶原上活化的羧基与活化的胺基团以形成酰胺键的任何酸。优选地，酸性溶液中的酸包含氨基羧酸。优选地，氨基羧酸是具有至少一个氨基基团和至少一个羧酸取代基的酸。更优选地，氨基羧酸选自L-精氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸、L-谷氨酸盐或L-天冬氨酸盐。

利用0.9％v/v盐水的不含磷酸盐的溶液进行漂洗生物材料的步骤。

虽然本领域的技术人员将会理解，优选交联方法中各步骤实施的温度不是关键的，但应该理解，优选地，温度在2℃和40℃之间，更优选在4℃和30℃之间和最优选地，在5℃和25℃之间。

在一个实施方式中，醇、酸性溶液和漂洗溶液均是不含缓冲剂的。

附图说明

图1显示2％氧化丙烯在15℃和45℃之间的不同温度随着时间对枯草芽孢杆菌(B.subtilis)孢子的作用。

图2显示4％氧化丙烯在15℃和45℃之间的不同温度随着时间对枯草芽孢杆菌孢子的作用。

具体实施方式

在详细描述本发明之前，应该理解，本发明不限于具体示例的生产方法，当然，该方法可以变化。还应该理解，本文使用的术语仅为了描述本发明具体实施方式的目的，而不意图限制只能由所附权利要求书进行限定的内容。

本文引用的所有出版物、专利和专利申请——无论是在上文中还是在下文中——均通过引用以其整体被并入本文。然而，引用本文提及的出版物是为了描述和公开出版物中报道的并且可以结合本发明应用的方案和试剂的目的。本文中的任何内容都不能被理解为承认本发明由于之前的发明而没有资格早于这样的公开内容。

而且，本发明的实践应用——除非另有说明——本领域的技能之内的常规免疫技术、化学和药理学。这样的技术是熟练的工人熟知的，并且在文献中被充分说明。见，例如，Coligan,Dunn,Ploegh,Speicher and Wingfield“Current protocols inProtein Science”(1999)Volume I and II(John Wiley&Sons Inc.)；和Bailey,J.E.andOllis,D.F.,Biochemical Engineering Fundamentals,McGraw-Hill Book Company,NY,1986；Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer and Walker,eds.,Academic Press,London,1987)；Handbook Of Experimental Immunology,Volumes I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell,eds.,1986)。

必需注意，如本文和所附权利要求书所使用的，单数形式“一”(“a,”“an,”)和“该”(“所述”，“the”)包括复数指代，除非上下文另外明确说明。因此，例如，提及“一种交联剂”包括多种这样的剂，和提及“一种醇”是指一种或更多种醇等等。除非另外限定，本文使用的所有技术和科学术语均具有本发明所述领域的普通技术人员通常所理解的含义。尽管类似于或等同于本文描述的材料和方法的任何材料和方法均可用于实践或测试本发明，但现在描述优选材料和方法。

在一个最宽的方面，本发明涉及用于消毒胶原基生物材料的方法。

如本文所使用的，术语“生物材料”是指任意含胶原材料，其潜在地具有生物学用途。胶原可以是来自任意源的任意类型的胶原，并且可以单独存在或结合其它材料而存在。因此，胶原可表示为少至生物材料总重量的1％w/w或多至100％。

如本文所使用的，术语“胶原”是指细胞外纤维蛋白家族，其特征在于其硬的、三链螺旋结构。三条胶原多肽链(“α-链”)彼此缠绕，以形成该螺旋分子。该术语还意图包括各种类型的胶原。

胶原螺旋状部分的主要部分在哺乳动物物种之间几乎没有变化。事实上，一些胶原类型具有高度的核苷酸和氨基酸序列同源性。例如，在比较人、马和鼠科动物时，胶原αI型II的核苷酸序列同源性为至少88％。人和马在核苷酸水平具有93％序列同源性，而小鼠和马具有89％序列同源性。人和小鼠的核苷酸序列同源性是88％(见，NCBI登录号U62528(马)、NM033150(人)和NM031163(小鼠)http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。其它类型的胶原具有类似水平的氨基酸同源性。例如，猪胶原αI型I和绵羊胶原αI型I之间的核苷酸序列同源性是90％(见，NCBI登录号AF29287(绵羊)和AF201723(猪)http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。

考虑到许多上述动物的共同祖先和生物学的水平、一些物种诸如牛、羊、小鼠和猪之间胶原的高度氨基酸和核苷酸序列同源性，本领域的技术人员会理解，本文所公开的生产生物材料的方法可适用于分离自所有哺乳动物的胶原材料。

因此，在一些实施方式中，生物材料分离或收获自哺乳动物目之一的动物，即，偶蹄目、兔形目、啮齿目、奇蹄目、食肉目和有袋目。动物优选是绵羊、牛、山羊、马、猪、有袋类动物或人。尽管生物材料优选分离自与接受者相同的动物物种，但考虑生物材料可分离自与接受者不同的物种。

可选地，在一些实施方式中，生物材料包含培养的组织、重构的组织或类似物。

生物材料可以是任意类型的细胞组织。例如，细胞组织可以是心血管组织、骨盆底组织、心组织、心瓣膜、主动脉根、主动脉壁、主动脉小叶、心包组织、结缔组织、软或实体器官的基质、皮组织、血管组织、硬膜、软骨、心包膜、韧带、腱血管、脐组织、骨组织、筋膜、和粘膜下层组织或皮肤，因为所有这些均包含一些胶原。

还应该理解，生物材料可进一步包含由合成聚合物、纯化的生物聚合物或两者——包括通常在天然组织基质中发现的那些在内——形成的合成类似物。合适的合成聚合物包括，例如聚酰胺和聚砜。生物聚合物可以是天然产生的或通过，例如发酵和类似方法体外产生。

通过技术，诸如编织、接合、浇铸、模塑、挤出、细胞排列和磁排列，纯化的生物聚合物可适当地形成底物。合适的生物聚合物包括但不限于胶原、弹性蛋白、丝、角蛋白、明胶、聚氨基酸、多糖(例如纤维素和淀粉)以及任意这些的共聚物。例如，胶原和弹性蛋白聚合物可通过任意各种技术，诸如编织和模塑，而形成合成可植入材料。合成组织类似物模仿天然组织基质。可选地，合成底物可用于形成组织类似物——单独的或与天然产生的底物一起。非限制性实例包括聚丙烯、聚乳酸、聚酯、尼龙、硅氧烷等。

生物材料在获得后即被交联。交联可利用任意熟知的程序，包括但不限于以下文献中描述的那些：Eyre等,1984,Annu.Rev.Biochem.537,717-748；Eyre,1982,In:Symposium on Heritable Disorders of Connective Tissue(Akeson等eds)pp.43-58,Mosby,St.Louis,Missouri；Davison&Brennan,1983,Connect.Tissue Res.11,135-151；Robins,1982,Methods Biochem.Analysis28,330-379；Reiser,1991,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.196,17-29。

优选交联方法公开在申请人的国际专利申请WO2006/066327中，其通过引用以其整体被并入本文。简言之，交联本发明胶原基生物材料的优选方法中的初始步骤包括使生物材料接触含醇溶液。如本文所使用的，术语“接触的”或“接触”是指将胶原基生物材料浸入本文所述溶液或剂中的活化步骤，或者如下文所述，随后使生物材料与交联剂、酸性溶液或其它物质接触足够的时间段以产生期望的结果。使生物材料接触，例如含醇溶液的方法在本领域中是众所周知的。例如，一般地，生物材料可通过将生物材料喷雾、浸渍或浸入溶液或剂而被接触。

如本文所使用的，术语“醇”是指本领域中已知的任何醇，其能够去除或减少甘油三酯的量和至少部分酯化在胶原上发现的羧基。优选地，醇是水溶性醇。更优选地，醇是不含缓冲剂的溶液中的C₁-C₆低级醇。甚至更优选地，醇选自甲醇、乙醇、环己醇、异丙醇、丙醇、丁醇、戊醇、异丁醇、仲-丁醇和叔-丁醇。

不希望受任何具体理论或假说的束缚，本发明者考虑，含醇溶液有助于松开胶原三螺旋，从而暴露疏水位点(见，Karube&Nishida,1979,Biochim Biophys Acta.,23；581(1):106-13)。他们还考虑，胶原中发现的羧基和胺基团在含醇溶液存在下被酯化，以便它们变得可在后面的步骤中用于交联。因此，优选醇溶液是这样的醇溶液：其在不含缓冲剂的含水溶液中包括至少约50％v/v，更优选至少约70％v/v和最优选至少约80％v/v醇。在一个实施方式中，醇溶液是70％乙醇v/v在0.9％盐水(含0.5mM PMSF)中。

在一些实施方式中，本文使用的含醇溶液以及其它溶液和试剂是“不含缓冲剂的”，因为假设含有醛的交联剂在固定期间与缓冲剂起反应，导致醛解聚。

使生物材料接触含醇溶液的步骤可进行任意长的时间，只要该时间足以使生物材料抵抗体内致病钙化，并且大部分(即，高百分比)在胶原中发现的羧基和胺基团被酯化。优选地，生物材料保持接触含醇溶液足够长的时间，以使醇能够扩散和渗透到生物材料中。更优选地，生物材料被暴露于含醇溶液至少24小时、甚至更优选至少36小时和最优选地，至少48小时。

胶原基生物材料一旦已经被暴露于醇即被去除。在一些实施方式中，生物材料在暴露于醇后在漂洗溶液中被漂洗，漂洗溶液包括0.9％v/v盐水的不含磷酸盐的溶液。然而，任意非缓冲生理学上可接受的溶液均可被用作漂洗溶液。漂洗溶液的目的主要是去除过多的醇，因此不是关键的。

在胶原基生物材料已经被暴露于醇大于24小时之后，其然后接触一种或更多种交联剂，尤其是双官能交联剂。如本文所使用的，术语“双官能的”是指两个官能醛基，其存在于五碳链的两端。交联可通过本领域中已知的任意技术、用任意形式的交联剂进行，只要其能够交联胶原。交联剂包括但不限于乙酰化化合物、己二酰二氯、醛、烷基和芳基卤化物、双亚胺酸酯(bisimidate)、碳二亚胺、二乙烯基砜(DVS)、甲醛、戊二醛、乙二醛、六亚甲基二异氰酸酯、羟基氯化物、羟乙基甲基丙烯酸酯二乙烯基砜(HEMA-DIS-HEMA)、亚氨酸酯、异氰酸酯、光(例如蓝光和UV光)、N-羟基琥珀酰亚胺、N-取代的马来酰亚胺、pH、聚醛、二苯基磷酰基叠氮化物(DPPA)、聚环氧化合物——包括17-25个碳和4-5个环氧基团的骨架、聚环氧醚、聚乙二醇二乙烯基砜(VS-PEG-VS)、聚甘油缩水甘油醚和温度及其组合。

在一些实施方式中，交联剂是化学交联剂诸如碳二亚胺、聚环氧醚、二乙烯基砜(DVS)、京尼平(Genipin)、戊二醛、甲醛和二苯基磷酰基叠氮化物(DPPA)。

还证明，包括17-25个碳和4-5个环氧基团的骨架的聚环氧化合物对于交联胶原表现出高效(见，例如美国专利申请号20040059430(S/N 10/618,447)。还显示聚环氧化合物的毒性低于戊二醛的毒性，并且，如果与螺旋状多肽分子诸如胶原起反应，组织的抗原性或免疫应答诱导与反应时间成比例地下降。自然地，其显示相对好的生物相容性(见，例如，Lohre等,(1992),Artif.Organs,16:630-633；Uematsu等,(1998),Artif.Organs,22:909-913)。因此，所述聚环氧化合物是一种优选交联剂。

在一些实施方式中，交联剂包含大约1％戊二醛和暴露时间为至少约24小时。应该理解，将生物材料暴露于交联剂的时间长度取决于所使用的剂、浓度和温度。通常，暴露时间在24小时至28天之间。生物材料暴露于交联剂的精确暴露时间量的确定在本领域技术人员的范围内。

再次，不希望受任何具体理论或假说的束缚，发明者考虑，通过将已经暴露于醇的胶原基生物材料暴露于交联剂，生物材料中存在的胶原上的酯化的羧基和胺基团被交联。

虽然本领域的技术人员将会理解，优选交联方法各步骤执行的温度不是关键的，但应该理解，优选地，温度在2℃和40℃之间，更优选在4℃和30℃之间和最优选地，在5℃和25℃之间。

再次，在交联步骤之后，胶原基生物材料优选在漂洗溶液中被漂洗，所述漂洗溶液诸如在醇暴露步骤(a)后使用的漂洗溶液。然而，再次应该理解，漂洗步骤仅仅是优选。

在交联步骤之后，或者在使用的情况下，在交联步骤之后的漂洗步骤之后，胶原基生物材料可然后被消毒的，以供本文所述方法使用。可选地，胶原基生物材料接触酸性溶液，所述酸性溶液包含能够失活和/或改性步骤(b)后生物材料中存在的固定和/或未固定交联剂部分以去除或减少可用的钙结合点的任何酸。可选地，或者另外，步骤(c)中使用的酸性溶液含有能够进一步交联胶原上活化的羧基与活化的胺基团以形成酰胺键的任何酸。

优选地，酸性溶液包含至少一种氨基羧酸。如本文所使用的，术语“氨基羧酸”是具有至少一个氨基基团和至少一个羧酸取代基的任意酸。在本发明中有用的氨基羧酸的代表性实例包括但不限于L-谷氨酸盐、L-天冬氨酸盐、L-赖氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸。酸性溶液的目的是双重的：首先，氨基羧酸有助于固定和未固定交联剂部分的失活和/或改性，从而减少或减轻任意不良生物作用。其次，氨基羧酸进一步交联胶原上的活化的羧基与活化的胺基团，以形成酰胺键。

氨基羧酸的浓度将取决于使用的实际的酸和其它参数，诸如使用的生物材料的总质量等。另外，氨基羧酸与生物材料的最小湿重比可为约1:4。酸性溶液的最重要的方面是pH。pH必须低于pH7，优选低于pH6，更优选低于pH5和最优选低于约pH4.6。

在一个实施方式中，酸性溶液是每毫升去离子水8mg氨基羧酸，其是不含磷酸盐的和约pH4。

交联的胶原基生物材料被暴露于氨基羧酸至少6小时，更优选至少24小时，甚至更优选大于48小时。虽然温育温度不是关键的，但其优选在5℃和55℃之间，更优选10℃和45℃之间，最优选约45℃。

在一些实施方式中，公开的交联方法的步骤(c)由抑制金属蛋白酶在生物材料中存在的弹性蛋白分子上形成的方法替代或补充。具体地，与其它组织相比，在组织诸如主动脉组织中，存在更高百分比的弹性蛋白。这些弹性蛋白分子可提供形成金属蛋白酶的位点，因此，这些位点需要被减少、去除或失活。

在将生物材料暴露于酸性溶液和/或含有多价阳离子的不含缓冲剂的溶液的步骤之前或之后，交联的胶原基生物材料再次优选在漂洗溶液中被漂洗。交联的胶原基生物材料然后被消毒。

消毒生物材料的步骤包括使交联的胶原基生物材料接触包括3％和6％v/v之间的氧化丙烯的消毒溶液和在30℃和55℃之间温育所述生物材料大于48小时；条件是消毒溶液不包含醇。

应该理解，醇，尤其是乙醇和/或异丙醇不用于本发明的消毒溶液。

已经很好地确定，在升高的温度下，例如高于55℃，胶原经历细胞内降解。事实上，已经显示，人皮肤成纤维细胞内的胶原在高于41℃的温度下开始经历加强的降解(Palotie,1983,Coll Relat Res.Mar；3(2):105-13)。因此，在消毒本发明交联的胶原基生物材料中，温育温度是关键因子。温度优选不大于55℃，因为这增加胶原开始降解的机会。然而，如在实施例9和别处所述，重要的是温育温度不小于30℃，因为低于30℃的温度已经降低消毒潜力。

本领域技术人员会理解，低于3％的氧化丙烯浓度将不会提供充分的消毒，如本文所限定的。高于6％的氧化丙烯浓度是有毒性的，并对生物材料的完整性具有不良影响。在一些实施方式中，消毒溶液包含3.8％和4.5％之间氧化丙烯。在其它实施方式中，消毒溶液包含大约4％氧化丙烯。在一些实施方式中，消毒溶液主要由3％和6％之间氧化丙烯组成，更优选消毒溶液由3％和6％之间氧化丙烯组成。在一些实施方式中，消毒溶液主要由3.8％和4.5％之间氧化丙烯组成，更优选消毒溶液由3.8％和4.5％之间氧化丙烯组成。在一些实施方式中，消毒溶液主要由约4％氧化丙烯组成，更优选消毒溶液由约4％氧化丙烯组成。

如本文所使用的，术语“约”是指偏离术语的值10％以上或以下。例如，提及约4％氧化丙烯包括3.6％和4.4％之间范围，即，4％值上下10％的范围。这包括3.7％、3.8％、3.9％、4.0％、4.1％、4.2％、4.3％和4.4％氧化丙烯。

要求消毒步骤进行大于48小时；然而，如本文所述，氧化丙烯也可被用作存储介质，因此，消毒步骤可进行至少2、3、4、5、6、7、8、9、10天或更多天。

本文所述方法的一个主要益处是本文所用的消毒溶液，即，3％和6％v/v之间的氧化丙烯，将不仅消毒含胶原组织而不影响胶原原纤维，而且因为氧化丙烯在与生物材料接触约4天后转化成丙二醇(其没有毒性)，在初始48小时后，消毒的交联的胶原基生物材料可良好地保持在消毒溶液中。事实上，考虑交联的胶原基生物材料将被消毒和存储，然后在相同容器中被船运至末端消费者而无须进一步处理。

如本文所使用的，术语“消毒”意为交联的胶原基生物材料满足ISO 14160的要求。ISO 14160覆盖保健用品的消毒，并涉及用于利用动物组织及其衍生物的单用途医疗装置的液体化学消毒剂。简言之，ISO 14160要求组织接种以枯草芽孢杆菌孢子，然后被处理以除去污染物。ISO 14160试验的要求描述在上面实施例6中。

在一些实施方式中，消毒溶液是不含缓冲剂的。在其它实施方式中，溶液包含去离子水。

用本文公开的方法处理后，交联的胶原基生物材料具有高水平的钙化抗性，即，其是“抗钙化生物材料”。如本文所使用的，术语“钙化”是指与传统生产的包含结缔组织蛋白质(即，胶原和弹性蛋白)的生物材料有关的主要病理问题之一。之前已经显示，在植入体内后，这些材料可变得钙化。这样的钙化可导致不期望的生物材料的硬化或降解。两(2)种类型的钙化：内在的和外在的，已知发生在固定的胶原生物材料中，尽管这样的钙化发生的确切机理(一种或多种)是未知的。内在的钙化特征在于钙和磷酸盐离子在固定的生物假体组织——包括胶原基质和剩余细胞——中的沉淀。外在钙化特征在于钙和磷酸盐离子在生物材料的贴壁(粘连，adherent)血栓——包括贴壁细胞——(例如，血小板)内的沉淀和生物材料上含磷酸钙表面斑点的形成。

因此，在应用于本发明的生物材料时，用语“高水平的钙化抗性”或“抗钙化”意为在体内植入至少200天后，生物材料在其去除后显示小于50μg，优选小于20μg和甚至更优选小于10μg钙/mg干燥组织。

优选地，本发明的生物材料还抵抗酶促降解。如本文所使用的，术语“抵抗酶促降解”是指本发明生物材料抵挡酶促降解的能力达到与传统固定的组织相当的水平。

一旦形成，本发明消毒的、交联的胶原基生物材料可然后用于治疗一些状况和/或疾病。

通常，术语“治疗(treating或treatment)”等在本文中用于表示影响个体或动物、其组织或细胞，以获得期望的药理学和/或生理学作用。就状况和/或疾病部分或全部治愈而言，该作用尤其是治疗性的。如本文所使用的，“治疗”涵盖在脊椎动物、哺乳动物，尤其是人中对状况和/或疾病的任何治疗，包括：(a)抑制状况和/或疾病，即，防止其发展；或(b)减轻或改善状况和/或疾病的症状，即，导致酶促降解/状况和/或疾病的症状消退。

在本文中，术语“状况”和/或“疾病”可互换使用，指影响动物，包括人的异常状况，其可利用本发明的生物材料治疗。因此，对伤口、损伤、组织退化、微生物感染、烧伤、溃疡、皮状况的治疗包括在本发明内。而且，心瓣膜、主动脉根、主动脉壁、主动脉小叶、心包组织、结缔组织、硬膜、皮组织、血管组织、软骨、心包膜、韧带、腱血管、脐组织、骨组织、筋膜、和粘膜下层组织的置换也包括在内。

本发明的抗钙化生物材料还可应用于医疗装置的各种接触表面的任一种。接触表面包括但不限于意图接触动物——尤其包括人——的血液、细胞或其它体液或组织的表面。合适的接触表面包括一个或更多个意图接触血液或其它组织的医疗装置表面。医疗装置包括动脉瘤线圈、人造血管、人造心、人造瓣膜、人造肾、人造腱和韧带、血袋、血充氧器、骨和心血管替换物、骨假器官、骨蜡、心血管移植物、软骨替换装置、导管、接触镜、用于细胞和组织培养和再生的容器、栓塞颗粒、过滤系统、移植物、导向通道、留置导管、实验室仪器、微珠、神经生长导轨、眼移植物、矫形移植物、起搏器导线、探针、假器官、支路、支架、肽支持物、手术仪器、缝合线、注射器、尿道植入物、伤口包覆材料、伤口敷料、伤口愈合装置和本领域中已知的其它医疗装置。

可得益于应用本发明的医疗装置的其它实例对于手术和医疗程序领域的技术人员来说是显而易见的，因而被本发明考虑。接触表面可包括筛眼、线圈、线材、可充气气囊或能够被植入到目标位置的任意其它结构，所述目标位置包括血管内位置、腔内位置、实体组织内的位置等。可植入装置可计划用于永久或暂时植入。这样的装置可通过血管内和其它医疗导管输送或结合到血管内和其它医疗导管中。

涂覆这样的装置的表面的方法可通过国际专利申请号WO96/24392中描述的等离子体涂覆技术来执行。

“包括”意为包括、但不限于词语“包括”后面的所有内容。因此，术语“包括”的使用表明所列元素是必需的或强制性的，但其它元素是可选的并且可以存在或不存在。“由…组成”意为包括和限于用语“由…组成”后面的所有内容。因此，用语“由…组成”表示所列元素是必需的或强制性的，并且不存在其它元素。“主要由…组成”意为包括该用语后列出的任何元素，并限于不干涉或促进在公开内容中针对所列元素指定的活性或作用的其它元素。因此，用语“主要由…组成”表示所列元素是必需的或强制性的，但其它元素是可选的并且可以存在或不存在，这取决于它们是否影响所列元素的活性或作用。

现在将通过仅参考以下非限制性实施例的方式进一步描述本发明。然而，应该理解，下面的实施例仅是说明性的，而不应该以任何方式被看做是对上面描述的本发明的一般性的限制。

实施例1 生物材料的基本加工和存储

胶原衍生的生物材料的收获

在当地屠宰场收获成年猪的猪心，并在死亡后2-4小时内在冰袋上运输至实验室。在冰冷0.9％v/v盐水溶液中洗涤心两次，并从贴壁脂肪和松散结缔组织仔细地进行清洁。将具有主动脉瓣的主动脉根从心切除并放入冰冷0.9％v/v盐水/苯基-甲基-磺酰基-氟化物(PMSF)，并在含PMSF的0.9％v/v盐水溶液中洗涤具有瓣膜的主动脉根20分钟。从主动脉瓣口去除瓣膜小叶并存贮在冰冷0.9％v/v盐水溶液中。

生物材料的交联(固定)

在无菌去离子水中制备含9.07g/l磷酸二氢钾缓冲剂的0.625％v/v的戊二醛溶液。用氢氧化钠将戊二醛溶液的pH调至7.4。主动脉瓣小叶在戊二醛溶液中在1-5℃下交联5天的最小时期，以交联存在于组织胶原中的蛋白质。

漂洗交联的生物材料

从戊二醛溶液中去除主动脉瓣小叶，并在无菌0.9％v/v氯化钠中漂洗约15分钟。在漂洗阶段中，漂洗溶液温度维持在大约10℃。

生物材料的最终消毒和存储

将猪主动脉瓣小叶浸入含29.02g/l磷酸二氢钾缓冲剂的戊二醛在无菌去离子水中的2.0％v/v溶液中。用氢氧化钠将醛溶液的pH调至7.4。消毒过程在大约25℃下进行5天。将消毒的组织分成四组并存储于：(i)0.625％v/v戊二醛、(ii)5.0％v/v戊二醛、(iii)10％v/v戊二醛；和(iv)2％v/v的氧化丙烯，直到进一步的使用。

实施例2 存储溶液对生物材料钙化属性(profile)的影响

在小和大动物模型中进行试验研究，以评估上述消毒-存储方法在减轻处理的含胶原生物材料的钙化中的效率。

在第一动物研究中，根据实施例1描述的方法消毒和存储的猪主动脉瓣小叶被用于在小动物模型中进行评估。

所有四组的消毒和存储的猪主动脉瓣小叶均在0.9％v/v盐水中被漂洗5分钟。漂洗的组织经手术植入皮下袋中(一只大鼠每组一个样品)，在成长的(6周龄)雄性Wistar大鼠的中央腹壁区产生。这些组织在60天后去除，宿主组织被去除，并将样品在Biotherm^TM培养箱(Marcus Medical,JHB,RSA)中，在90℃下干燥48h。干燥样品被称重，并在5.0ml6N超纯盐酸(Merck,JHB,RSA)中，在75℃下提取钙含量24h。然后利用原子吸收分光光度计(Varian AA1275)测量可提取的钙含量，并将其表示为μg钙/mg组织(干重)。这些数据总结于表1中。结果(μg钙/mg干燥组织)总结于表1。

表1

实施例3 消毒和存储溶液对生物材料钙化属性的影响

胶原衍生的生物材料的收获

在第二动物研究中，根据实施例1描述的方法收获和分离猪主动脉瓣小叶。分离的猪主动脉瓣小叶被分成三组。组I接受常规交联处理(对照)；组II接受专利交联方法(见，WO2006/066327，通过引用并入本文)；和组III接受与组II相同的交联处理，但这之后是用包括约4％v/v的氧化丙烯的消毒溶液温育交联的生物材料和在30℃和55℃之间温育生物材料大于48小时。

主动脉瓣小叶的交联(固定)

在组I中，猪主动脉瓣小叶于在无菌去离子水中制备的含9.07g/l磷酸二氢钾缓冲剂的0.625％的戊二醛溶液中进行交联。用氢氧化钠将戊二醛溶液的pH调至7.4。主动脉瓣小叶在戊二醛溶液中，在1-5℃下交联5天的最小时期，以交联存在于组织胶原中的蛋白质。

在组II和III中，制备按体积计60–80％v/v醇乙醇的水溶性含醇溶液。在4℃存储过夜后，将猪主动脉瓣小叶浸入到醇溶液中。具有瓣膜的主动脉根在冰冷0.9％v/v盐水(含0.5mM PMSF)中最后洗涤后即被浸入到相同的醇溶液中。在大约5℃，将猪主动脉瓣小叶保持在醇溶液最少24小时。

将猪主动脉瓣小叶从醇溶液中移除，并用0.9％v/v盐水漂洗约10分钟。在漂洗期间，漂洗溶液温度维持在大约10℃。

主动脉瓣小叶被浸入含9.07g/l磷酸二氢钾缓冲剂的戊二醛在无菌去离子水中的0.625％v/v溶液中。用氢氧化钠将戊二醛溶液的pH调至7.4。心包膜和具有瓣膜的主动脉根在1-5℃，在戊二醛溶液中被固定24小时的最小时期，以交联存在于组织胶原中的蛋白质。

将猪瓣膜小叶从戊二醛溶液中移除，并在无菌0.9％v/v氯化钠中漂洗约15分钟。在漂洗期间，漂洗溶液温度维持在大约10℃。

然后，将猪主动脉瓣小叶浸入不含缓冲剂的、含8mg二羧酸/1ml去离子水体积的溶液中。用一定体积的稀释盐酸将溶液pH调至pH4.5。心包膜和具有瓣膜的主动脉根在约45℃温度下被浸入溶液约48小时。

生物材料的最终消毒和存储

然后，猪主动脉瓣小叶通过以下方式任意之一消毒和存储：

(i)将组织浸入含9.07g/l磷酸二氢钾缓冲剂的戊二醛在无菌去离子水中的0.25％v/v溶液中。用氢氧化钠将醛溶液pH调至7.4。消毒过程在约45℃温度下进行约120分钟(处理A)；或

(ii)在37℃下，在包括按重量计4％v/v的氧化丙烯组合20％v/v乙基醇的含水溶液中将猪主动脉瓣小叶消毒约24小时，并存储在4％v/v的氧化丙烯溶液中，处理B–本发明)。

所有三组的消毒的和存储的猪主动脉瓣小叶均在0.9％v/v盐水中被漂洗5分钟。漂洗的组织经手术植入皮下袋中(每组一个样品/大鼠)，在成长的(6周龄)雄性Wistar大鼠的中央腹壁区产生。这些组织在60天后去除，宿主组织被去除，并将样品在Biotherm^TM培养箱(Selby Scientific,Perth,WA)中，在90℃下干燥48h。干燥样品被称重，并在5.0ml6N超纯盐酸(Merck,Sydney,Australia)中，在75℃下提取钙含量24h。然后利用原子吸收分光光度计(Varian AA1275)测量可提取的钙含量，并将其表示为μg钙/mg组织(干重)。结果(μg钙/mg干燥组织)总结于表2。

表2

实施例4处理B对牛心包膜钙化属性的影响

在第三动物研究中，将根据实施例3的组织制备的、交联的和存储的牛心包膜(0.625％缓冲戊二醛、处理A+0.2％戊二醛和处理B4％v/v的氧化丙烯)的钙化潜力与存储在0.2％的戊二醛溶液中的商业牛心包膜(Hancock心包膜)的钙化潜力进行比较。

各组的代表性样品均被修剪成1x1cm尺寸并在0.9％v/v盐水中漂洗5分钟。这些样品经手术植入皮下袋中，在成长的(6周龄)雄性Wistar大鼠的中央背壁区产生。这些组织在60天后去除，宿主组织被去除，并利用原子吸收分光光度计测定钙含量。结果(μg钙/mg干燥组织)总结于表3。

表3

实施例5 在大动物模型中处理B对猪主动脉瓣组织(瓣膜小叶&主动脉壁) 钙化属性的影响

在第四动物研究中，在0.625％缓冲戊二醛中制备和交联并存储于(i)0.625％戊二醛、(ii)用处理A(0.625％戊二醛)处理和(iii)用处理B(4％氧化丙烯)处理的猪主动脉瓣组织(瓣膜小叶和主动脉壁)的钙化潜力。

各组的代表性样品均被修剪成大约1.2x1cm的卵圆形尺寸并在0.9％盐水中漂洗5分钟。这些样品经手术植入幼年羊(体重22-25kg)的颈静脉中。这些组织在150天后被去除，宿主组织被去除，并利用原子吸收分光光度计测定钙含量。结果(μg钙/mg干燥组织)总结于表4-A(瓣膜小叶)和表4-B(主动脉壁)。

表4-A(瓣膜小叶))

表4-B(主动脉壁)

实施例6 验证：接种以枯草芽孢杆菌孢子的商业心瓣膜的消毒

进行该验证，以测试在48小时后，在45℃下，用4％氧化丙烯消毒商业心瓣膜组织的可行性。该可行性研究的目的是调查3.8％氧化丙烯(作为“最坏情况”浓度水平)是否能够在由FDA条例规定的“最坏情况”条件(被枯草芽孢杆菌孢子污染)下消毒商业心瓣膜X组织。测试条件为：

·将瓣膜从0.5％戊二醛中移除，并在总计1000mls的无菌蒸馏水中漂洗总计6mins。

·然后，无菌分离瓣膜支持物和瓣膜，然后干燥大约30mins或直到明显干燥。

·然后，各装置的瓣膜支持物和瓣膜被接种以总计20μl的枯草芽孢杆菌孢子悬浮物，其获自STERIS Corporation，USA。悬浮物含1.25x10⁶孢子。

·然后，使瓣膜在室温下干燥大约1小时。

·然后，根据收到物再次组装装置，并将其放入无菌罐中。

·向10个装置中加入160ml新鲜制备的3.8％氧化丙烯。

·向最终装置中加入160ml大豆酪蛋白消化物培养基(Soybean-Casein Digestmedium)(SCDM)。这是评估孢子悬浮物的阳性对照。阳性对照在32℃温育48小时。

·然后，将10个测试瓣膜在42℃温育44小时。

·在温育后，对每一瓣膜进行无菌测试。

·分离瓣膜，并将每一部分转移至空的无菌罐中，向该罐中加入SCDM。

·然后，在32℃温育罐14天。

·每日检查罐的浑浊征兆。

测试细节：

实验室号：7343042W

方法：方法根据无菌测试，附录XVI，英国药典，2010(Test for Sterility,Appendix XVI,British Pharmacopoeia,2010)和制药测试设备程序(PharmaceuticalTesting Facility procedure)MB:PT:0110。

表5

实施例7 在小动物模型中处理B对商业心瓣膜组织(牛心包组织)钙化属性 的影响

表6显示第五动物研究的结果，其中将在0.625％v/v戊二醛中交联和消毒的牛心包膜(其用作参考对照–标记A)的钙化潜力与商业心瓣膜组织(根据商业专利方案交联和存储的牛心包膜，所述商业专利方案是0.625％v/v缓冲戊二醛交联+甲醛存储–标记B)和在4％v/v的氧化丙烯中，在45℃消毒48小时，并存储在4％v/v的氧化丙烯溶液中的同样的商业心瓣膜组织–标记C进行比较。

各组的代表性样品均被修剪成1x1cm尺寸和并在0.9％v/v盐水中漂洗5分钟。这些样品经手术植入皮下袋中，在成长的(6周龄)雄性Wistar大鼠的中央背壁区产生。这些组织在8、16和24周后去除，宿主组织被去除，并利用原子吸收分光光度计测定钙含量。结果(μg钙/mg干燥组织)总结于表6。

表6

实施例8 在快速体外钙化模型中处理B对商业心瓣膜组织(牛心包)组织钙 化属性的影响

在进一步的试验评估中，在快速体外钙化模型中将商业瓣膜组织(对照组织)的钙化潜力与在4％氧化丙烯中，在45℃消毒48小时和存储在4％氧化丙烯溶液中的商业心瓣膜组织(处理的组织)进行比较。

支架的商业心瓣膜(对照和处理的)被安装在瓣膜疲劳试验仪(Rowan AshFatigue tester)中，并在上至五千万个循环的加速流动(400个测试循环/分钟)期间被暴露于生理溶液(具有高的钙/磷酸盐含量)。

在五千万个测试循环之后，心瓣膜被移除，并采取代表性组织样品用于组织学。各瓣膜中三个瓣膜小叶各自的剩余组织被移除，并利用原子吸收分光光度计测定钙含量。结果(μg钙/mg干燥组织)总结于表7。

表7

瓣膜组织             平均值±标准误差

商业瓣膜             49.71μg Ca/mg组织±2.112

商业瓣膜+4％氧化丙烯 32.34μg Ca/mg组织±1.336

实施例9 消毒和存储方法对接种以枯草芽孢杆菌孢子的组织的作用

图1和2显示2％v/v和4％v/v的氧化丙烯(各自)在15℃和45℃之间的不同温度下随着时间对枯草芽孢杆菌孢子的作用。利用的试验条件描述在实施例6。主要地，可以看到两种消毒溶液(2％或4％)在48小时之前均没有一点消毒作用。由图2还可见，在48小时之内，提高温度的作用对消毒具有深远影响。例如，在40℃及以上的温度下，在24小时之后存在消毒，并且，甚至在25℃及以上的温度下，到48小时时存在消毒。图1显示，为了通过2％v/v的氧化丙烯获得消毒，组织需要在高于35℃的温度下被温育至少6天。在15至20℃下甚至温育10天2％v/v的氧化丙烯对消毒也没有实质性作用。

因此，由图1和2可见，通过用4％v/v的氧化丙烯溶液温育组织和在大约45℃下温育组织大于48小时获得最佳消毒。

Claims (14)

1.消毒交联的胶原基生物材料的方法，包括使所述交联的胶原基生物材料接触包括3％和6％v/v之间的氧化丙烯的消毒溶液和在30℃和55℃之间温育所述生物材料大于48小时；条件是所述消毒溶液不包含醇。

2.权利要求1所述方法，其中所述温育温度在35℃和50℃之间。

3.权利要求1所述方法，其中所述温育温度是大约45℃。

4.权利要求1所述方法，其中48小时后所述温育温度降至室温。

5.权利要求1所述方法，其中所述消毒溶液包含3.8％和4.5％v/v之间的氧化丙烯。

6.权利要求1所述方法，其中所述消毒溶液包含大约4％v/v的氧化丙烯。

7.权利要求1所述方法，其中所述消毒步骤进行2至10天或更长。

8.权利要求1所述方法，其中所述胶原基生物材料分离自动物，所述动物选自绵羊、牛、山羊、马、猪、有袋类动物和人。

9.权利要求1所述方法，其中所述生物材料是细胞组织，所述细胞组织选自心血管组织、心组织、心瓣膜、主动脉根、主动脉壁、主动脉小叶、心包组织、结缔组织、硬膜、皮组织、血管组织、软骨、心包膜、韧带、腱、血管、脐组织、骨组织、筋膜、和粘膜下层组织和皮肤。

10.权利要求9所述方法，其中所述生物材料进一步包含由合成聚合物、生物聚合物或两者形成的合成类似物。

11.用于消毒胶原基生物材料的方法，包括：

(a)提供胶原基生物材料和接触0.625％v/v的戊二醛溶液和磷酸二氢钾，pH7.4；

(b)在大约1-5℃温育所述生物材料至少5天，以产生交联的胶原基生物材料；

(c)使所述交联的胶原基生物材料与包括3％和6％v/v之间的氧化丙烯的消毒溶液接触和在30℃和55℃之间温育所述生物材料大于48小时；条件是所述消毒溶液不包含醇。

12.消毒和存储交联的胶原基生物材料的方法，包括使所述交联的胶原基生物材料接触包括3％和6％v/v之间的氧化丙烯的溶液和在30℃和55℃之间温育所述生物材料大于48小时，然后使所述生物材料保持接触所述氧化丙烯，直到其转化成丙二醇；条件是所述溶液不包含醇。

13.消毒的、交联的胶原基生物材料，由权利要求1所述方法产生。

14.容器，包括消毒的、交联的胶原基生物材料和3％至6％v/v的丙二醇溶液，其中所述丙二醇产生自3％至6％v/v的氧化丙烯溶液在所述生物材料存在时的原位转化。