KR102149227B1

KR102149227B1 - 멸균 방법

Info

Publication number: KR102149227B1
Application number: KR1020147015755A
Authority: KR
Inventors: 윌리엄 모리스 레너드 니들링
Original assignee: 애드메두스 레건 피티와이 엘티디
Priority date: 2011-11-10
Filing date: 2012-11-09
Publication date: 2020-09-01
Also published as: RU2630979C2; AU2012334826A1; CN104114195A; AU2012334826B2; KR20140128945A; WO2013067598A1; MY184479A; CA2855138C; EP2776074A4; EP2776074A1; US20160287748A1; NZ625543A; US20130122583A1; SG11201401789TA; MX2014005707A; CA2855138A1; CN109620978A; US20200353126A1; BR112014011089B1; JP2014534034A

Abstract

본 발명은 이식 가능한 생체 적합 물질의 멸균 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 가교 결합된 콜라겐계 생체 적합 물질의 멸균 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 가교 결합된 콜라겐계 생체 적합 물질을 3% 내지 6%(v/v) 프로필렌 옥사이드 포함하는 멸균 용액과 접촉시키고, 상기 생체 적합 물질을 30 내지 55℃에서 48 시간을 초과하는 시간 동안 배양하는 것을 포함하며, 단 상기 멸균 용액은 알코올을 함유하지 않는다.

Description

멸균 방법{STERILIZATION PROCESS}

본 발명은 이식 가능한 생체 적합 물질의 멸균 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 콜라겐을 함유한 이식 가능한 생체 적합 물질의 멸균 및 그 이후의 저장 방법에 관한 것이다.

이식 가능한 생체 적합 물질, 특히 콜라겐계 생체 적합 물질은 사용 전에 멸균하고, 대다수의 경우에 저장을 필요로 한다. 이식 가능한 콜라겐계 생체 적합 물질은 통상 2가지, (1) 천연 조직 및 (2) 화학적으로 가교 결합된 조직으로 크게 분류된다. 따라서, 콜라겐계 생체 적합 물질의 형태에 따라, 또한 가교 결합이 이루어졌는지의 여부에 따라, 조직을 멸균하는 수단뿐만 아니라, 멸균이 된 경우의 조직을 저장하는 수단이 필요하다.

화학적으로 가교 결합된 콜라겐계 생체 적합 물질, 예를 들면, 심혈관 패치, 심장 판막, 매트릭스 및 동맥은 통상 가교 결합 후에 멸균하고, 이식 시까지 멸균 용액에 저장한다. 화학적으로 가교 결합된 콜라겐계 생체 적합 물질에 대해, 감마선 조사, 자외선 조사 및 다양한 화학 제제를 비롯하여 몇몇 멸균 방법이 과거 3, 40년에 걸쳐 시험 되고 시행되었다. 이들 멸균 방법은 대부분 오염 방지에 효과가 있지만, 구조적 손상(펩타이드 결합의 분해) 및 조직 퇴행(인장 강도의 감소)과 같은 부작용으로 인해 이들 방법의 대다수가 산업상의 용도에 어필 하지 못했다.

예를 들면, 글루타르알데하이드로 가교 결합한 콜라겐계 생체 적합 물질은 알코올계 멸균 용액에 노출되면, 조직 내에 존재하는 잔류성 및 미결합 글루타르알데하이드와 알코올의 상호 작용으로 인해 화학적으로 불안정해질 수 있다. 알코올이 알데하이드와 반응할 때에 불안정한 헤미아세틸이 형성된다. 이들 불안정한 헤미아세틸은 알코올과 반응하여 아세틸을 형성하는 능력을 가지며, 이는 해리하여 알데하이드 및 알코올을 생성한다.

이와 같이, 현재, 콜라겐계 생체 적합 물질의 제조업자 대다수는 멸균을 위한 화학 가교 결합 및 비-알데하이드 제제로서 글루타르알데하이드-포름알데하이드 조합물을 사용하는 것을 선호한다. 이러한 비-알데하이드 제제의 하나는 에틸렌 옥사이드(옥시란) 가스이고, 이는 기계식 인공심장 판막의 멸균에 수년간 사용되어 왔다. 에틸렌 옥사이드 가스는 또한 여러 가지 의료 장치, 일회용품 아이템 및 기계식 인공심장 판막의 멸균에 사용되어 왔다.

콜라겐계 생체 적합 물질을 멸균하면, 통상적으로 이식 전에 일정 기간 동안 저장한다. 콜라겐계 생체 적합 물질의 중장기 저장에는 생리적으로 안정한 용액 중에서 오염으로부터 적절하게 보호할 필요가 있다. 시판되고 있는 대부분의 콜라겐계 생체 적합 물질은 여전히 알데하이드계 용액 중에 저장되지만, 석회화 및 섬유증과 같은 부작용이 알려져 있다.

1970년대 이후, 프로필렌 옥사이드가 멸균제로서 사용되었다(예를 들면, Hart & Brown, 1974, Appl Microbiol, Dec. p.1069-1070; Brown & Ng, 1975, Appl Microbiol, Sept. p483-484 참조). 각 경우에, 5% 프로필렌 옥사이드와 70% 이소프로필 알코올 또는 0.5% 클로르헥시딘 또는 2% 세트리미드를 포함하는 용액이 세균의 포자 현탁액을 파괴하는데 효과가 있었다. 그러나, 프로필렌 옥사이드의 사용이 기록되어 있지만, 이는 통상 알코올(에탄올 또는 이소프로판올)의 존재 하에 적용된다. 이와 같이, 알데하이드 가교 결합된 조직(잔류성 알데하이드 함유)에 대한 프로필렌 옥사이드의 멸균에 첨가제로서 알코올을 사용함으로써, 알데하이드 농도가 상승되므로, 이는 다시 이들 조직의 석회화 위험을 증가시켜 최종적으로 생체이식 실패로 이어질 수 있다.

결과적으로, 화학적으로 가교 결합된 콜라겐계 생체 적합 물질을 멸균할 뿐만 아니라, 멸균된 생체 적합 물질용으로 간편한 저장 배지(storage medium)를 제공하는 효과적인 멸균 방법이 요구된다.

본 발명자들은 가교 결합된 콜라겐계 생체 적합 물질에 전형적으로 사용된 멸균 및/또는 저장 방법과 관련된 문제를 해소하거나, 또는 적어도 경감하는 방법을 개발하였다.

따라서, 제 1 양태에 있어서, 본 발명은 가교 결합된 콜라겐계 생체 적합 물질의 멸균 방법을 제공한다. 상기 멸균 방법은 가교 결합된 콜라겐계 생체 적합 물질을, 3% 내지 6%(v/v) 프로필렌 옥사이드를 포함하는 멸균 용액과 접촉시키고, 상기 생체 적합 물질을 30℃ 내지 55℃에서 48시간을 초과하는 시간 동안 배양하는 것을 포함하며, 단 상기 멸균 용액은 알코올을 함유하지 않는다.

일부 실시형태에 있어서, 상기 배양 온도는 30℃, 31℃, 32℃, 33℃, 34℃, 35℃, 36℃, 37℃, 38℃, 39℃, 40℃, 41℃, 42℃, 43℃, 44℃, 45℃, 46℃, 47℃, 48℃, 49℃, 50℃, 51℃, 52℃, 53℃, 54℃ 내지 55℃이다. 다른 실시형태에 있어서, 상기 배양 온도는 30℃ 내지 31℃, 32℃, 33℃, 34℃, 35℃, 36℃, 37℃, 38℃, 39℃, 40℃, 41℃, 42℃, 43℃, 44℃, 45℃, 46℃, 47℃, 48℃, 49℃, 50℃, 51℃, 52℃, 53℃, 54℃ 또는 55℃이다. 즉, 30℃ 내지 55℃ 범위의 온도 내에서 모든 조합이 예상된다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 배양 온도는 35℃ 내지 50℃가 바람직하고, 더욱 바람직하게는 40℃ 내지 48℃이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 배양 온도는 약 45℃이다.

일단 상기 배양기간이 경과하면, 즉 48시간을 초과하여 경과하면, 상기 온도를 실온으로 저하할 수 있다. 정말로, 상기 멸균된 가교 결합 콜라겐계 생체 적합 물질은 이때 초기 48시간 후에 잠시 동안 실온에서 유지할 수 있다. 일단 멸균된 가교 결합 콜라겐계 생체 적합 물질을 적어도 4일간 프로필렌 옥사이드에서 배양하면, 상기 프로필렌 옥사이드는 프로필렌글리콜로 전환되고, 상기 콜라겐계 생체 적합 물질은 즉시 사용할 수 있다.

일부 실시형태에 있어서, 상기 멸균 용액은 3.8% 내지 4.5%(v/v)의 프로필렌 옥사이드를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 상기 멸균 용액은 약 4%(v/v)의 프로필렌 옥사이드를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 멸균 용액은 필수적으로 3% 내지 6%(v/v)의 프로필렌 옥사이드로 이루어지고, 더욱 바람직하게는 상기 멸균 용액은 3% 내지 6%(v/v)의 프로필렌 옥사이드로 이루어진다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 멸균 용액은 필수적으로 3.8% 내지 4.5%(v/v)의 프로필렌 옥사이드로 이루어지고, 더욱 바람직하게는 상기 멸균 용액은 3.8% 내지 4.5%(v/v)의 프로필렌 옥사이드로 이루어진다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 멸균 용액은 필수적으로 약 4%(v/v)의 프로필렌 옥사이드로 이루어지고, 더욱 바람직하게는 상기 멸균 용액은 약 4%(v/v)의 프로필렌 옥사이드로 이루어진다.

본 발명의 상기 멸균 용액에는 알코올, 특히 에탄올 및/또는 이소프로판올이 사용되지 않음을 인지할 것이다.

상기 멸균 단계는 48시간(2일)보다 더 오랫동안 수행할 필요가 있지만, 상기 멸균 용액을 또한 저장 배지로서 사용할 수 있기 때문에, 상기 멸균 단계는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10일 또는 그 이상 수행할 수 있다.

상기 가교 결합된 콜라겐계 생체 적합 물질은 콜라겐을 포함하거나, 콜라겐으로 필수적으로 이루어지거나, 콜라겐으로 이루어진 물질일 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 콜라겐계 생체 적합 물질은 동물로부터 직접 분리된다. 상기 생체 적합 물질은 수용체(recipient)와 같은 종이거나 수용체와 다른 종의 어떠한 동물로부터 분리할 수 있다. 바람직하게는, 상기 동물은 포유류 계층, 즉 소목류(Artiodactyla ), 토끼목( Lagomorpha ), 쥐목( Rodentia ), 기제류( Perissodactyla ), 식육목( Carnivora ) 및 유대목( Marsupialia ) 중에서 선택된다. 더욱 바람직하게는, 상기 동물은 양, 소, 염소, 말, 돼지, 유대목 동물 및 인간으로 이루어진 그룹 중에서 선택되다.

상기 생체 적합 물질은 세포 조직의 어느 형태일 수 있다. 상기 세포 조직은 심혈관 조직, 심장 조직, 심장 판막, 대동맥근, 대동맥벽, 대동맥판엽(aortic leaflet), 심막 조직, 결합 조직, 경막, 진피 조직, 도관 조직, 연골, 심막, 인대, 힘줄, 혈관, 배꼽 조직(umbilical tissue), 뼈 조직, 근막, 및 점막하 조직 및 피부로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것이 바람직하다.

일부 실시형태에 있어서, 상기 생체 적합 물질은 자연적으로 발생하는 콜라겐 함유 조직보다는 개별, 즉 단리한 콜라겐이고/이거나, 이를 포함한다. 상기 개별 콜라겐은 그의 단리된 상태로 사용할 수도 있고, 또는 본 분야에서 알려진 어느 의료 장치 또는 의료용품으로 형성할 수도 있다.

일부 실시형태에 있어서, 상기 생체 적합 물질은 배양 조직, 동물에서 얻은 세포외 매트릭스를 함유하는 인공 기관, 재구성 조직(예, 콜라겐 매트릭스) 등이다.

상기 생체 적합 물질이 통상 천연 조직 매트리스에서 발견된 것을 비롯하여, 합성 폴리머, 또는 생체 폴리머를 추가로 포함하는 것을 또한 이해할 것이다. 적합한 합성 폴리머에는 예를 들면, 폴리아미드 및 폴리술폰이 포함된다. 생체 폴리머는 자연적으로 발생할 수 있거나, 또는 예를 들면, 발효 등에 의해 시험관 내에서 생성할 수 있다.

제2 양태에 있어서, 본 발명은 콜라겐계 생체 적합 물질의 멸균 방법을 제공한다. 이 멸균 방법은

(a) 콜라겐계 생체 적합 물질을 제공하여, 이를 빙냉의 0.9%(v/v) 염수 용액으로 세정하고, 상기 생체 적합 물질을 빙냉의 0.9%(v/v) 염수/페닐-메틸-술포닐-플루오라이드(PMSF) 중에 넣고,

(b) 상기 콜라겐계 생체 적합 물질을 0.625%(v/v) 글루타르알데하이드 용액 및 pH 7.4의 인산 이수소 칼륨과 접촉시키고, 약 1℃ 내지 5℃에서 적어도 5일간 배양하여 가교 결합된 콜라겐계 생체 적합 물질을 생성하며;

(c) 상기 가교 결합된 콜라겐계 생체 적합 물질을 대략 10℃에서 멸균의 0.9%(v/v) 염화 나트륨으로 세정한 다음, 상기 가교 결합된 콜라겐계 생체 적합 물질을 3.8% 내지 4.5%(v/v)의 프로필렌 옥사이드를 포함하는 멸균 용액과 접촉시키고, 상기 조직을 30℃ 내지 55℃에서 48시간을 초과하는 시간 동안 배양하는 것을 포함하며, 단 상기 멸균 용액은 알코올을 함유하지 않는다.

제3 양태에 있어서, 본 발명은 멸균된 가교 결합 콜라겐계 생체 적합 물질의 저장 방법을 제공한다. 상기 저장 방법은 가교 결합된 콜라겐계 생체 적합 물질을, 3% 내지 6%(v/v)의 프로필렌 옥사이드를 포함하는 용액과 접촉시키고, 상기 생체 적합 물질을 30℃ 내지 55℃에서 48시간을 초과하는 시간 동안 배양한 다음, 상기 프로필렌옥사이드가 프로필렌글리콜로 전환될 때까지, 상기 생체 적합 물질을 상기 프로필렌 옥사이드와 접촉한 상태로 유지시키는 것을 포함하고, 단 상기 용액은 알코올을 함유하지 않는다.

제4 양태에 있어서, 본 발명은 제1, 제2 또는 제3 양태에 따른 방법에 의해 생성된 멸균의 가교 결합된 콜라겐계 생체 적합 물질을 제공한다.

일단 상기 멸균의 가교 결합된 콜라겐계 생체 적합 물질이 본 발명의 방법에 의해 얻어지면, 이는 이식 가능한 생물 제제 장치에 포함될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 제 5 양태에 있어서, 본 발명은 제 4 양태에 따른 멸균의 가교 결합된 콜라겐계 생체 적합 물질을 포함하는 이식 가능한 생물 제제 장치를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 있어서, 본 발명의 가교 결합된 콜라겐계 생체 적합 물질은 조직 손상의 회복을 위한 키트 내에 함유된다. 이와 같이, 제6 양태에 있어서, 본 발명은 조직 손상을 회복하기 위한 키트를 제공한다. 상기 키트는

(a) 제 4 양태에 따른 멸균되고 가교 결합된 콜라겐계 생체 적합 물질 또는 제5 양태에 따른 장치를 갖는 멸균 용기, 및

(b) 손상된 대상을 위한 사용 설명서

를 포함한다.

제7 양태에 있어서, 본 발명은 용기를 제공한다. 상기 용기는 멸균된 가교 결합 콜라겐계 생체 적합 물질 및 3% 내지 6%(v/v)의 프로필렌글리콜 용액을 포함하며, 여기에서 상기 프로필렌글리콜은 상기 생체 적합 물질의 존재 하에 있는 동안, 3% 내지 6%(v/v) 프로필렌 옥사이드 용액의 동일반응계 내(in situ) 전환으로부터 생성된다.

본 발명의 상기 콜라겐계 생체 적합 물질은 문헌[Eyre et al., 1984, Annu . Rev. Biochem. 537, 717-748; Eyre, 1982, In: Symposium on Heritable Disorders of Connective tissue(Akeson et al. eds) pp. 43-58, Mosby, St. Louis, Missouri; Davison & Brennan, 1983, Connect . tissue Res. 11, 135-151; Robins, 1982, Methods Biochem. Analysis , 28, 330-379; Reiser, 1991, Proc . Soc . Exp . Biol. Med. 196, 17-29]에 기재된 방법을 비롯하여, 이들에 한정되지 않고, 가교 결합 콜라겐의 분야에서 알려진 방법 중 어느 방법에 의해서 가교 결합할 수 있으며, 모든 문헌은 그 전체가 참고로 본원에 원용된다. 그러나, 본 발명의 상기 콜라겐계 생체 적합 물질을 가교 결합하는 바람직한 방법은

(a) 콜라겐계 생체 적합 물질을 알코올 함유 용액에 적어도 24시간 동안 노출시키고;

(b) 단계(a)의 상기 생체 적합 물질을 가교 결합제에 노출시키며;

(c) 단계(b)의 상기 생체 적합 물질을 산성 용액에 노출시키고;

상기 단계(b) 및 단계(c)는 단계(a)에 연속하여 이루어진다.

단계(a)에서 사용된 알코올 함유 용액은 수계 액체, 즉 약 50%(v/v) 초과의 알코올, 바람직하게는 60% 내지 80%(v/v)의 알코올 수용액이 바람직하다. 완충된 또는 완충되지 않은 알코올 함유 용액을 사용할 수 있지만, 완충된 알코올 함유 용액이 후속의 가교 결합 절차에 악영향을 미쳐 황화 생체 적합 물질을 생성한다고 밝혀졌기 때문에, 완충되지 않은 알코올 함유 용액을 사용하는 것이 바람직하다.

바람직한 가교 결합 방법은 알코올 함유 용액의 분야에서 알려진 어느 알코올이라도 사용할 수 있다. 바람직하게는, 상기 알코올은 완충제가 없는 용액 중의 C₁-C₆저급 알코올이다. 더욱 바람직하게는, 상기 알코올은 메탄올, 에탄올, 사이클로헥산올, 이소프로판올, 프로판올, 부탄올, 펜탄올, 이소부탄올, sec-부탄올 및 t-부탄올로 이루어진 군 중에서 선택된다.

일부 실시형태에 있어서, 상기 알코올 함유 용액은 2 이상의 알코올의 혼합물을 포함하는데, 단 상기 알코올의 부피 합계는 50%(v/v)를 넘는다. 예를 들면, 약 70%(v/v) 에탄올과 약 10%(v/v) 이소부탄올의 혼합물이 효과적이다.

단계(a)의 생체 적합 물질은 상기 생체 적합 물질이 생체 내에서 병원성 석회화에 내성이 있도록 하기에 충분한 시간 동안 상기 알코올 함유 용액에 노출시킬 수 있다. 상기 생체 적합 물질은 알코올이 확산하여 상기 생체 적합 물질로 침투할 수 있도록 하기에 충분한 시간 동안 상기 알코올 함유 용액과 접촉한 상태로 두는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 상기 생체 적합 물질을 상기 알코올 함유 용액에 적어도 24시간, 더욱 바람직하게는 적어도 36시간, 가장 바람직하게는 적어도 48시간 동안 노출시킨다.

상기 알코올 함유 용액에 노출 후에, 상기 생체 적합 물질을 꺼내어, 하나 이상의 가교 결합제에 노출시킨다. 콜라겐을 가교 결합할 수 있는 한, 본 분야에서 알려진 모든 형태의 가교 결합제 또는 그의 조합을 사용할 수 있다. 따라서, 상기 가교 결합제로는 디비닐 술폰(DVS), 폴리에틸렌 글리콜 디비닐 술폰(VS-PEG-VS), 하이드록시에틸 메타크릴레이트 디비닐 술폰(HEMA-DIS-HEMA), 포름알데하이드, 글루타르알데하이드, 알데하이드, 이소시아네이트, 알킬 및 아릴 할라이드, 이미도에스테르, N-치환된 말레이미드, 아실화 화합물, 카보디이미드, 하이드록시클로라이드, N-하이드록시숙신이미드, 광(예, 청색 광 및 UV 광), pH, 온도, 및 이의 조합이 포함되나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 상기 가교 결합제는 카보디이미드, 폴리에폭시에테르, 디비닐 술폰(DVS), 폴리알데하이드 및 디페닐포스포릴 아자이드(DPPA)로 이루어진 군에서 선택된 화학적 가교 결합제가 바람직하다.

일부 실시형태에 있어서, 상기 폴리알데하이드는 디-(bi-), 트리-(tri-) 또는 디-(di-) 알데하이드이다. 글루타르알데하이드가 특히 바람직하다.

일부 실시형태에 있어서, 상기 가교 결합 단계(b)에 이어서 세정 단계를 거치거나, 또는 세정 단계를 거치지 않고 단계(c)를 수행한다. 단계(c)에서 사용된 상기 산성 용액은 이용가능한 칼슘 결합부를 제거하거나, 또는 감소시키기 위해 상기 단계(b) 이후의 상기 생체 적합 물질에 존재하는 고정된 및/또는 고정되지 않은 가교 결합제 부위를 불활성화 및/또는 변형시킬 수 있는 어느 산을 함유한다. 대신에, 또는 덧붙여, 단계(c)에서 사용된 산성 용액은 상기 콜라겐 상의 활성화된 아민기와 상기 활성화된 카복실기를 추가로 가교 결합하여 아미드 결합을 형성할 수 있는 어느 산을 함유한다. 상기 산성 용액 중의 산은 아미노카복실산을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 아미노카복실산은 적어도 하나의 아미노기와 적어도 하나의 카르복실산 치환기를 갖는 산이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 상기 아미노카복실산은 L-알기닌, L-라이신, L-히스티딘, L-글루타메이트 또는 L-아스파르테이트로 이루어진 군에서 선택된다.

상기 생체 적합 물질의 세정 단계는 인산염이 없는 0.9%(v/v) 염수 용액을 사용하여 수행한다.

바람직한 가교 결합 방법의 각 단계를 수행하는 온도는 결정적이지 않음은 당업자에게 명백하나, 상기 온도는 2℃ 내지 40℃가 바람직하고, 더욱 바람직하게는 4℃ 내지 30℃이고, 가장 바람직하게는 5℃ 내지 25℃인 것이 인지될 것이다.

일 실시형태에 있어서, 상기 알코올, 산성 용액 및 세정 용액은 모두 완충제를 함유하지 않는다.

도 1은 시간의 경과에 따라 고초균(B. subtilis ) 포자에 미치는 15℃ 내지 45℃의 온도 변화에 따른 2% 프로필렌 옥사이드의 영향을 나타낸다.
도 2는 시간의 경과에 따라 고초균(B. subtilis) 포자에 미치는 15℃ 내지 45℃의 온도 변화에 따른 4% 프로필렌 옥사이드의 영향을 나타낸다.

본 발명을 구체적으로 설명하기에 앞서, 본 발명은 특별히 예시된 생산 방법에 한정되는 것이 아니고, 당연히 변경할 수 있음을 이해할 것이다. 본 명세서에 사용된 용어는 단지 본 발명의 특정한 실시형태를 설명하기 위한 것으로, 첨부된 특허청구범위로만 한정하고자 하는 것이 아님을 또한 인지할 것이다.

상기 또는 하기에 인용한 공개 문헌, 특허 및 특허 출원은 모두 그 전체가 참고로 본 명세서에 원용된다. 그러나, 언급한 공개 문헌은 그 공개 문헌에 보고되어 있고, 또한 본 발명과 관련하여 사용할 수 있는 프로토콜 및 시약을 기술하여 설명하기 위한 목적으로 인용된다. 본 발명이 선행 발명의 그러한 개시에 대해 우선하는 권리가 없음을 인정하는 것으로 해석되는 것은 아니다.

더욱이, 본 발명의 실시에는 별도의 언급이 없는 한, 해당 분야의 기술에 속하는 기존의 면역학적 기술, 화학 및 약학을 사용한다. 이러한 기술은 숙련된 기술자에게 잘 알려져 있으며, 문헌에 충분히 설명되어 있다[예를 들면, Coligan, Dunn, Ploegh, Speicher and Wingfield "Current protocols in Protein Science"(1999) Volume I and II(John Wiley & Sons Inc.); and Bailey, J.E. and Ollis, D.F., Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill Book Company, NY, 1986; Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV(D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986) 참조].

본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수형의 하나("a", "an") 및 상기 ("the")는 문맥에서 명확하게 달리 언급하지 않는 한, 복수를 포함하는 점에 유의해야한다. 따라서, 예를 들면, "가교 결합제"에 대한 언급은 그러한 제제의 복수를 포함하며, "알코올"에 대한 언급은 하나 이상의 알코올 등을 의미한다. 별도의 언급이 없다면, 본원에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 개시된 바와 유사하거나 동등한 모든 물질 및 방법은 본 발명을 실시 또는 시험하기 위해 사용할 수 있지만, 바람직한 물질 및 방법을 이하에 기술한다.

가장 광의의 양태들 중 하나로서, 본 발명은 콜라겐계 생체 적합 물질의 멸균 방법이다.

본원에서 사용된 용어 "생체 적합 물질(biomaterial)"은 잠재적으로 생물학적 용도를 갖는 물질을 함유하는 임의의 콜라겐을 말한다. 상기 콜라겐은 모든 소스 유래의 콜라겐의 모든 타입일 수 있으며, 단독으로 존재하거나, 또는 다른 물질과의 조합일 수 있다. 따라서, 상기 콜라겐은 생체 적합 물질의 총 중량의 최저 1%(w/w)에서 최고 100%(w/w)까지 나타낼 수 있다.

본원에 사용된 용어 "콜라겐"은 그들의 단단한 3중 가닥의 나선형 구조를 특징으로 하는 세포외 섬유성 단백질류를 말한다. 3개의 콜라겐 폴리펩타이드 쇄("알파 쇄")는 서로 감겨 상기 나선형 분자를 형성한다. 상기 용어는 또한 다양한 타입의 콜라겐을 포함하는 것으로 의도된다.

콜라겐의 나선형 부분은 대부분 포유류의 종간에 거의 다르지 않다. 실제로, 다수의 콜라겐 타입은 고도의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열 상동성을 갖는다. 예를 들면, 인간, 말 및 쥐과 동물을 비교하면, 콜라겐 알파 I 타입 II의 뉴클레오타이드 서열 상동성은 적어도 88%이다. 인간 및 말은 뉴클레오타이드 레벨에서 93% 서열 상동성을 보이는 반면, 마우스와 말은 89% 서열 상동성을 보인다. 인간 및 마우스의 뉴클레오타이드 서열 상동성은 88%이다(NCBI accession numbers U62528(Equine), NM033150(Human) and NM031163(mouse) http://www.ncbi.nlm.nih.gov 참조). 다른 타입의 콜라겐은 유사한 수준의 아미노산 상동성을 보인다. 예를 들면, 돼지 콜라겐 알파 I 타입 I 및 양 콜라겐 알파 I 타입 I 간의 뉴클레오타이드 서열 상동성은 90%이다(NCBI accession numbers AF29287(Ovine) and AF201723(Porcine) http://www.ncbi.nlm.nih.gov 참조).

다수의 상기 동물들에 공통되는 기원 및 생물학 수준을 고려하면, 즉 소, 양, 마우스 및 돼지와 같은 다수의 종들에 걸쳐 나타나는 콜라겐에 대한 높은 아미노산 서열 상동성 및 뉴클레오타이드 서열 상동성을 고려하면, 본원에 개시된 생체 적합 물질을 생성하는 방법은 모든 포유류 동물로부터 분리한 콜라겐성 물질에 적용가능하다는 것을 당업자는 이해할 것이다.

따라서, 일부 실시형태에 있어서, 상기 생체 적합 물질은 포유류 계층, 즉 소목류(Artiodactyla), 토끼목(Lagomorpha), 쥐목(Rodentia), 기제류(Perissodactyla), 식육목(Carnivora) 및 유대목(Marsupialia) 중 하나에 속하는 동물로부터 분리하거나 또는 채취한다. 상기 동물은 양, 소, 염소, 말, 돼지, 유대류 동물 또는 인간이 바람직하다. 상기 생체 적합 물질은 수용체와 동일한 동물 종으로부터 분리되는 것이 바람직하지만, 상기 생체 적합 물질은 수용체와 상이한 종으로부터 분리될 수 있는 것으로 파악된다.

대안으로, 일부 실시형태에 있어서, 상기 생체 적합 물질은 배양 조직, 재구성 조직 등을 포함한다.

상기 생체 적합 물질은 어느 타입의 세포 조직일 수 있다. 예를 들면, 상기 세포 조직은 심혈관 조직, 골반기부 조직, 심장 조직, 심장 판막, 대동맥근, 대동맥벽, 대동맥판엽, 심막 조직, 결합 조직, 연기관 또는 고형 기관의 매트릭스, 진피 조직, 도관 조직, 경막, 연골, 심막, 인대, 힘줄, 혈관, 배꼽 조직, 뼈 조직, 근막, 및 점막하 조직 또는 피부일 수 있으며, 이들은 모두 일부 콜라겐을 포함한다.

상기 생체 적합 물질은 통상 천연 조직 매트릭스에서 발견되는 것을 비롯하여, 합성 폴리머, 또는 정제된 생체 폴리머를 또한 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 적합한 합성 폴리머로는 예를 들면, 폴리아미드 및 폴리술폰이 포함된다. 생체 폴리머는 자연적으로 생성되거나 또는 예컨대, 발효 등에 의해 시험관 내에서 제조할 수 있다.

정제된 생체 폴리머는 직조, 편물, 캐스팅, 몰딩, 압출, 세포 정렬 및 자기 정렬(magnetic alignment)과 같은 기법에 의해 기질로 적절하게 형성할 수 있다. 적합한 생체 폴리머로는 콜라겐, 엘라스틴, 실크, 케라틴, 젤라틴, 폴리아미노산, 다당류(예, 셀룰로오스 및 전분), 및 이들 모두의 공중합체가 포함되나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 콜라겐 및 엘라스틴 폴리머는 직조 및 몰딩과 같은 여러 가지 기법 중 어느 기법에 의해 이식 가능한 합성 물질로 형성할 수 있다. 합성 조직 유사체는 천연 조직 매트릭스를 모방한다. 대안으로, 합성 기질을 사용하여 단독으로, 또는 천연 기질과 함께 조직 유사체를 형성할 수 있고, 그의 예로는 폴리프로필렌, 폴리락트산, 폴리에스테르, 나일론, 실리콘 등을 들 수 있으며, 이들에 한정되는 것은 아니다.

상기 생체 적합 물질이 얻어지면, 이를 가교 결합한다. 상기 가교 결합은 문헌[Eyre et al., 1984, Annu . Rev . Biochem. 537, 717-748; Eyre, 1982, In: Symposium on Heritable Disorders of Connective tissue(Akeson et al. eds) pp. 43-58, Mosby, St. Louis, Missouri; Davison & Brennan, 1983, Connect . T issue Res. 11, 135-151; Robins, 1982, Methods Biochem . Analysis 28, 330-379; Reiser, 1991, Proc . Soc . Exp . Biol . Med. 196, 17-29]에 개시된 바와 같은 것을 비롯하여, 잘 알려진 절차 중 어느 절차를 이용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

가교 결합의 바람직한 방법은 본 출원인들의 국제 특허 출원 WO2006/066327호에 개시되어 있으며, 그의 전체가 참고로 본원에 원용된다. 간단히, 본 발명의 콜라겐계 생체 적합 물질을 가교 결합하는 바람직한 방법에서 초기 단계는 상기 생체 적합 물질을 알코올 함유 용액과 접촉시키는 것을 포함한다. 본 명세서에 사용된 용어 "접촉된(contacted)" 또는 "접촉시키는(contacting)"은 상기 콜라겐계 생체 적합 물질을 여기 또는 이하에 기술한 바와 같은 용액 또는 제제 중에 액침시키고, 계속해서 상기 생체 적합 물질을, 원하는 결과를 가져오기에 충분한 시간 동안 가교 결합제, 산성 용액 또는 다른 물질과 접촉시키는 활성 단계를 말한다. 상기 생체 적합 물질을 예를 들면, 알코올 함유 용액과 접촉시키는 방법은 본 분야에서 잘 알려져 있다. 예를 들면, 일반적으로 상기 생체 적합 물질을 용액 또는 제제 중에 분무하거나, 침지하거나 또는 액침시켜 상기 생체 적합 물질을 접촉시킬 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "알코올"은 트리글리세라이드의 양을 제거하거나 또는 감소시킬 수 있고, 콜라겐 상의 카복실기를 적어도 부분적으로 에스테르화할 수 있는 본 분야에서 알려진 어느 알코올을 말한다. 바람직하게는, 상기 알코올은 수용성 알코올이다. 더욱 바람직하게는, 상기 알코올은 완충제가 없는 용액 중의 C₁-C₆저급 알코올이다. 더더욱 바람직하게는, 상기 알코올은 메탄올, 에탄올, 사이클로헥산올, 이소프로판올, 프로판올, 부탄올, 펜탄올, 이소부탄올, sec-부탄올 및 t-부탄올로 이루어진 군에서 선택된다.

어떠한 특정 이론 또는 가설로도 구속되는 것을 원치 않고, 본 발명자들은 상기 알코올 함유 용액이 콜라겐 3중 나선의 완화를 도움으로써, 소수성 부위가 노출되는 것이라 생각했다(Karube & Nishida, 1979, Biochim Biophys Acta., 23;581(1): 106-13 참조). 본 발명자들은 또한 콜라겐에서 보이는 카복실 및 아민기가 알코올 함유 용액의 존재 하에서 에스테르화되어, 이들을 후속 단계에서 가교 결합에 이용할 수 있게 된다고 생각했다. 그런 바람직한 알코올 용액은 완충제가 없는 수용액에 대해 적어도 약 50%(v/v), 더욱 바람직하게는 적어도 약 70%(v/v), 가장 바람직하게는 적어도 약 80%(v/v)의 알코올을 포함하는 것이다. 일 실시형태에 있어서, 상기 알코올 용액은 0.9% 염수(0.5mM PMSF 함유) 중의 70%(v/v) 에탄올이다.

일부 실시형태에 있어서, 본 명세서에서 사용된 다른 용액 및 시약뿐 아니라, 상기 알코올 함유 용액은 알데하이드를 함유하는 가교 결합제가 고정화 중에 완충제와 반응하여 알데하이드의 탈중합화를 일으킨다고 가정하면 "완충제가 없는" 것이다.

상기 생체 적합 물질을 알코올 함유 용액에 접촉시키는 단계는 상기 생체 적합 물질이 생체 내에서 병원성 석회화에 대해 내성이 있도록 하기에 충분하고 콜라겐 중의 카복실기 및 아민기의 대부분(즉, 높은 퍼센트로)이 에스테르화하는 시간 동안 수행할 수 있다. 상기 생체 적합 물질을, 알코올이 확산하여 상기 생체 적합 물질로 침투할 수 있도록 하기에 충분한 시간 동안 상기 알코올 함유 용액과 접촉해 있는 상태로 두는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 상기 생체 적합 물질은 적어도 24시간 동안, 더욱 바람직하게는 적어도 36시간 동안, 가장 바람직하게는 적어도 48시간 동안 알코올 함유 용액에 노출시킨다.

일단 상기 콜라겐계 생체 적합 물질이 알코올에 노출되면 이를 꺼낸다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 생체 적합 물질은 알코올에 노출 후, 0.9%(v/v) 염수의 인산염이 없는 용액을 포함하는 세정 용액으로 세정한다. 그러나, 생리학적으로 허용가능한 비완충 용액을 세정 용액으로서 사용할 수 있다. 세정 용액의 목적은 주로 과잉의 알코올을 제거하는 것이며, 그렇게 결정적인 것은 아니다.

상기 콜라겐계 생체 적합 물질이 알코올에 24시간보다 더 노출된 후, 이를 하나 이상의 가교 결합제, 특히 이작용성 가교 결합제와 접촉시킨다. 본 명세서에서 사용된 용어 "이작용성(bifunctional)"은 5개의 탄소 쇄의 양 말단에 2개의 작용성 알데하이드기가 존재하는 것을 말한다. 상기 가교 결합은 콜라겐을 가교 결합할 수 있는 한 어떤 형태의 가교 결합제를 사용하여 본 분야에 알려진 기법에 의해 이루어질 수 있다. 가교 결합제로는 아실화 화합물, 아디필 클로라이드, 알데하이드, 알킬 및 아릴 할라이드, 비스이미데이트, 카보디이미드, 디비닐 술폰(DVS), 포름알데하이드, 글루타르알데하이드, 글리옥살, 헥사메틸렌 디이소시아네이트, 하이드록시클로라이드, 하이드록시에틸 메타크릴레이트 디비닐 술폰(HEMA-DIS-HEMA), 이미도에스테르, 이소시아네이트, 광(예, 청색 광 및 UV 광), N-하이드록시숙신이미드, N-치환된 말레이미드, pH, 폴리알데하이드, 디페닐포스포릴 아자이드(DPPA), 17 내지 25개의 탄소 골격 및 4, 5개의 에폭시기를 포함하는 폴리에폭시 화합물, 폴리에폭시 에테르, 폴리에틸렌 글리콜 디비닐 술폰(VS-PEG-VS), 폴리글리세롤 폴리글리시딜 에테르 및 온도, 및 이들의 조합이 포함되나, 이들에 한정되는 것은 아니다.

일부 실시형태에 있어서, 상기 가교 결합제는 카보디이미드, 폴리에폭시 에테르, 디비닐 술폰(DVS), 제니핀, 글루타르알데하이드, 포름알데하이드 및 디페닐포스포릴 아자이드(DPPA)와 같은 화학 가교 결합제이다.

17 내지 25개의 탄소 골격과 4, 5개의 에폭시기를 포함하는 폴리에폭시 화합물은 콜라겐의 가교 결합에 고 효율을 나타내는 것이 또한 입증되었다(예를 들면, 미합중국 특허 출원 제20040059430호(S/N 10/618,447) 참조). 콜라겐과 같은 나선형 폴리펩타이드 분자와 반응하는 경우에, 폴리에폭시 화합물의 독성은 글루타르알데하이드의 독성보다 더 낮고, 조직의 항원성 또는 면역 반응 유도가 반응 시간에 비례하여 감소하는 것을 또한 보여준다. 당연히 그것은 비교적 우수한 생체적합성을 나타낸다(예를 들면, Lohre et al., (1992), Artif . organs, 16:630-633; Uematsu et al., (1998), Artif . Organs, 22:909-913 참조). 결과적으로, 기술한 폴리에폭시 화합물은 바람직한 가교 결합제이다.

일부 실시형태에 있어서, 상기 가교 결합제는 약 1%의 글루타르알데하이드를 포함하며, 노출 시간은 적어도 약 24시간이다. 상기 생체 적합 물질을 가교 결합제에 노출하는 시간 길이는 사용된 제제, 농도 및 온도에 의존하는 것을 인지할 것이다. 대표적으로, 노출 기간은 24시간 내지 28일이다. 상기 생체 적합 물질을 가교 결합제에 노출하는 시간의 정확한 양에 대한 측정은 본 분야에서 숙련된 기술자의 범위 내에서 잘 알려져 있다.

또한, 어떠한 특정 이론 또는 가설로도 구속되는 것을 원치 않고, 본 발명자들은 알코올에 노출된 상기 콜라겐계 생체 적합 물질을 가교 결합제에 노출시킴으로써, 상기 생체 적합 물질에 존재하는 콜라겐 상의 에스테르화된 카복실기 및 아민기가 가교 결합하는 것으로 생각한다.

바람직한 가교 결합 방법의 각 단계가 수행되는 온도는 결정적이지 않음은 본 분야에서 숙련된 자에게 명백하지만, 상기 온도는 2℃ 내지 40℃가 바람직하고, 더욱 바람직하게는 4℃ 내지 30℃, 가장 바람직하게는 5℃ 내지 25℃라는 것을 이해할 것이다.

또한, 상기 가교 결합 단계 후, 상기 콜라겐계 생체 적합 물질을 상기 알코올 노출 단계(a) 이후에 사용된 바와 같은 세정 용액으로 세정하는 것이 바람직하다. 그러나, 상기 세정 단계는 단지 선택(preferment)인 것을 이해할 것이다.

상기 가교 결합 단계에 이어서, 또는 상기 가교 결합 단계 후의 세정 단계를 이용한 경우에는 그 이후에, 상기 콜라겐계 생체 적합 물질은 사용하기 위해 본 명세서에 기재된 방법에 의해 멸균할 수 있다. 대안적으로, 이용가능한 칼슘 결합부를 제거하거나 감소시키기 위해 단계(b) 이후의 생체 적합 물질에 존재하는 고정된 및/또는 고정되지 않은 가교 결합제 부위를 불활성화 및/또는 변형할 수 있는 임의의 산을 함유하는 산성 용액과 상기 콜라겐계 생체 적합 물질을 접촉시킨다. 대신에, 또는 덧붙여, 단계(c)에 사용된 산성 용액은 콜라겐 상의 활성화된 아민기와 활성화된 카복실기를 또한 가교 결합하여 아미드 결합을 형성할 수 있는 임의의 산을 포함한다.

바람직하게는 상기 산성 용액은 적어도 하나의 아미노카복실산을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "아미노카복실산"은 적어도 하나의 아미노기와 적어도 하나의 카복실산 치환체를 갖는 어느 산을 말한다. 본 발명에 유용한 아미노카복실산의 대표예로는 L-글루타메이트, L-아스파르테이트, L-라이신, L-알기닌, L-히스티딘이 포함되나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 산성 용액의 목적은 2가지이다: 첫째로, 상기 아미노카복실산은 고정된 및 고정되지 않은 가교 결합제 부위의 불활성화 및/또는 변형을 보조함으로써, 생물학적 부작용을 감소시키거나 또는 경감시킨다. 둘째로, 상기 아미노카복실산은 콜라겐 상의 활성화된 아민기와 활성화된 카복실기를 추가로 가교 결합하여 아미드 결합을 형성한다.

상기 아미노카복실산의 농도는 실제 사용된 산과 다른 파라미터 예를 들면, 사용된 생체 적합 물질의 총 질량 등에 의존한다. 또한, 아미노카복실산 대 생체 적합 물질의 최소 습식 중량비는 약 1:4이다. 상기 산성 용액의 가장 중요한 측면은 pH이다. pH는 pH 7 미만, 바람직하게는 pH 6 미만, 더욱 바람직하게는 pH 5 미만, 가장 바람직하게는 약 pH 4.6 미만이어야 한다.

일 실시형태에 있어서, 상기 산성 용액은 탈이온수 밀리리터당 아미노카복실산 8mg이며, 인산염이 함유되지 않고, 약 pH 4이다.

상기 가교 결합된 콜라겐계 생체 적합 물질은 상기 아미노카복실산에 적어도 6시간, 더욱 바람직하게는 적어도 24시간, 훨씬 더 바람직하게는 48시간보다 더 노출시킨다. 상기 배양 온도는 결정적이지 않지만, 5℃ 내지 55℃가 바람직하고, 더욱 바람직하게는 10℃ 내지 45℃, 가장 바람직하게는 약 45℃이다.

일부 실시형태에 있어서, 기술된 가교 결합 방법의 단계(c)는 상기 생체 적합 물질에 존재하는 엘라스틴 분자에 대한 메탈로프로테아제의 생성을 억제하는 방법으로 대체되거나 또는 이 방법으로 보충된다. 구체적으로, 대동맥 조직과 같은 조직에서, 다른 조직에서보다 더욱 높은 비율의 엘라스틴이 존재한다. 이들 엘라스틴 분자는 그러한 이들 부위가 감소되거나, 제거되거나 또는 불활성화될 필요가 있어 메탈로프로테아제의 형성을 위한 부위를 제공할 수 있다.

상기 가교 결합된 콜라겐계 생체 적합 물질은 상기 생체 적합 물질을, 다가 양이온을 함유하는 산성 용액 및/또는 완충제가 없는 용액에 노출시키는 단계 이전 또는 이후에, 세정 용액으로 다시 세정하는 것이 바람직하다. 다음에는 상기 가교 결합된 콜라겐계 생체 적합 물질을 멸균한다.

상기 생체 적합 물질을 멸균하는 단계는 상기 가교 결합된 콜라겐계 생체 적합 물질을, 3% 내지 6%(v/v)의 프로필렌 옥사이드를 포함하는 멸균 용액과 접촉시키고, 상기 생체 적합 물질을 30℃ 내지 55℃에서 48시간을 초과하는 시간 동안 배양하는 것을 포함하며, 단 상기 멸균 용액은 알코올을 함유하지 않는다.

알코올, 특히 에탄올 및/또는 이소프로판올은 본 발명의 멸균 용액에 사용되지 않음을 인지할 것이다.

예를 들어, 55℃를 넘는 승온에서, 콜라겐은 세포간 분해를 하는 것이 밝혀졌다. 실제로, 인체 피부의 섬유아세포 내의 콜라겐이 41℃ 이상의 온도에서 분해 상승이 일어나기 시작하는 것을 보여주었다(Palotie, 1983, Coll Relat Res. Mar; 3(2): 105-13). 따라서, 본 발명의 상기 가교 결합된 콜라겐계 생체 적합 물질을 멸균함에 있어서, 배양 온도는 결정적 인자이다. 상기 온도는 콜라겐이 분해되기 시작하는 기회를 증가시키므로, 55℃보다 높지않은 것이 바람직하다. 그러나, 실시예 9 및 그외에서 기술된 바와 같이, 상기 배양 온도는 30℃보다 낮은 온도가 멸균 가능성을 감소시키므로 30℃보다 낮지 않은 것이 중요하다.

프로필렌 옥사이드의 농도가 3% 미만이면, 본 명세서에서 정의한 바와 같은 충분한 멸균을 제공하지 못하는 것은 본 분야에서 숙련된 자에게 인지될 것이다. 프로필렌 옥사이드의 농도가 6%를 넘으면, 독성이 있고, 생체 적합 물질의 완전성에 악영향을 미친다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 멸균 용액은 3.8% 내지 4.5%의 프로필렌 옥사이드를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 상기 멸균 용액은 약 4%의 프로필렌 옥사이드를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 멸균 용액은 필수적으로 3% 내지 6%의 프로필렌 옥사이드로 이루어지는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 상기 멸균 용액은 3% 내지 6%의 프로필렌 옥사이드로 이루어진다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 멸균 용액은 필수적으로 3.8% 내지 4.5%의 프로필렌 옥사이드로 이루어지고, 상기 멸균 용액은 3.8% 내지 4.5%의 프로필렌 옥사이드로 이루어지는 것이 더욱 바람직하다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 멸균 용액은 필수적으로 약 4%의 프로필렌 옥사이드로 이루어지고, 상기 멸균 용액이 약 4%의 프로필렌 옥사이드로 이루어지는 것이 더욱 바람직하다.

본 명세서에서 사용된 용어 "약"은 이 용어 다음에 언급되는 값에서 위 아래로 10%의 편차를 말한다. 예를 들면, 약 4%의 프로필렌 옥사이드에 대한 언급은 3.6% 내지 4.4% 범위, 즉 4%에서 10% 아래 또는 위의 값을 포함한다. 이는 3.7%, 3.8%, 3.9%, 4.0%, 4.1%, 4.2%, 4.3% 및 4.4%의 프로필렌 옥사이드를 포함한다.

상기 멸균 단계는 48시간보다 더 수행하는 것이 요구되지만, 본 명세서에 기술된 바와 같이, 프로필렌 옥사이드는 또한 저장 배지로서 사용할 수 있고, 그리하여 상기 멸균 단계는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10일 또는 그 이상 동안 수행할 수 있다.

본 명세서에 기술된 방법의 주된 이점은 본원에 사용된 멸균 용액, 즉 3% 내지 6%(v/v)의 프로필렌 옥사이드가 콜라겐 피브릴에 영향을 미치지 않고, 콜라겐 함유 조직을 멸균할 뿐만 아니라, 프로필렌 옥사이드가 생체 적합 물질과 접촉하고 있는 상태로 약 4일 후에 프로필렌글리콜(독성 없음)로 전환되기 때문에, 멸균된 가교 결합 콜라겐계 생체 적합 물질은 초기 48시간 후에 멸균 용액 중에 양호하게 남아있을 수 있다. 실제로, 상기 가교 결합된 콜라겐계 생체 적합 물질은 멸균되고 저장된 다음에, 추가의 취급이 필요 없이 동일한 용기에 담겨 최종 소비자에게 보내지는 것을 상정한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "멸균"은 상기 가교 결합된 콜라겐계 생체 적합 물질이 ISO 14160 하의 필요 조건을 만족시키는 것을 의미한다. ISO 14160은 의료보호용품의 멸균을 다루며, 동물 조직 및 이들의 파생물을 이용하는 일회용 의료 장치를 위한 액체 화학 멸균제와 관련이 있다. 간단히, ISO 14160은 조직에 고초균(B. subtilis) 포자를 접종한 다음 오염을 제거하기 위해 처리하는 것을 필요로 한다. ISO 14160 시험의 필요 조건은 앞서 언급한 실시예 6에 기재되어 있다.

일부 실시형태에 있어서, 상기 멸균 용액에는 완충제가 없다. 다른 실시형태에 있어서, 상기 용액은 탈이온수를 포함한다.

본 명세서에 기술된 상기 방법으로 처리 후, 상기 가교 결합된 콜라겐계 생체 적합 물질은 석회화에 대한 고도의 내성을 가지며, 즉 이는 "석회화 내성 생체 적합 물질"이다. 본 명세서에 사용된 용어 "석회화"는 결합 조직 단백질(즉, 콜라겐 및 엘라스틴)을 포함하는 전통적으로 생성된 생체 적합 물질과 관련된 주된 병리학적 문제의 하나를 말한다. 이들 물질은 체내에 이식 후에 석회화될 수 있는 것으로 이전에 나타났다. 그러한 석회화로 인해 생체 적합 물질의 원치않는 경직 또는 분해를 가져온다. 이러한 석회화가 발생하는 정확한 메카니즘은 알려져 있지 않지만, 고정된 콜라겐성 생체 적합 물질에서는 내인성 및 외인성의 2 타입의 석회화가 발생하는 것이 알려져 있다. 내인성 석회화는 콜라겐 매트릭스 및 나머지 세포를 포함하여, 고정된 생체 인공 조직 내에 칼슘 및 인산염 이온을 침전시키는 특징이 있다. 외인성 석회화는 상기 생체 적합 물질에 대한 부착 세포(예, 혈소판)를 포함하여 유착성 혈전 내에 칼슘 및 인산염 이온을 침전시키고, 생체 적합 물질 상에 인산 칼슘 함유 표면 플라그를 전개시키는 특징이 있다.

결과적으로, 표현 "석회화에 대한 고도의 내성" 또는 "석회화 내성"은 본 발명의 생체 적합 물질에 적용했을 때 상기 생체 적합 물질은 적어도 200일간 생체 내에 이식한 후, 이를 꺼낸 후에 건조된 조직 mg당 칼슘 50㎍ 미만, 바람직하게는 20㎍ 미만, 더더욱 바람직하게는 10㎍ 미만을 나타내는 것을 의미한다.

바람직하게는 본 발명의 생체 적합 물질은 또한 효소 분해에 대한 내성이 있다. 본 명세서에서 사용된 용어 "효소 분해에 대한 내성"은 본 발명의 생체 적합 물질이 전통적인 고정 조직에 상당하는 수준으로 효소 분해에 견디는 능력을 말한다.

본 발명의 멸균된 가교 결합 콜라겐계 생체 적합 물질이 형성되면, 다음에는 다수의 질환 및/또는 장애를 치료하기 위해 사용할 수 있다.

일반적으로, 용어 "치료(treating)", "치료(treatment)" 등은 본원에서 개체 또는 동물, 이들의 조직 또는 세포에 작용하여 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 의미한다. 이 효과는 특히 질환 및/또는 장애의 부분 또는 완전 치유 측면에서의 치료이다. 본 명세서에서 사용된 "치료"는 척추 동물, 포유류, 특히 인간의 질환 및/또는 장애의 모든 치료를 포괄하며, (a)질환 및/또는 장애를 억제, 즉 발병 정지; 또는 (b)질환 및/또는 장애의 증상을 완화 또는 개선, 즉 효소 분해/질환 및/또는 장애의 증상을 회복시키는 것을 포함한다.

용어 "질환" 및/또는 "장애"는 본원에서 상호 호환으로 사용되며, 인간을 포함한 동물이 겪는 비정상적인 상태를 말하며, 이는 본 발명의 생체 적합 물질로 치료할 수 있다. 따라서, 상처, 병변, 조직 변성, 미생물 감염, 화상, 궤양, 진피 질환의 치료가 본 발명에 포함된다. 더욱이, 심장 판막, 대동맥근, 대동맥벽, 대동맥판엽, 심막 조직, 결합 조직, 경막, 진피 조직, 도관 조직, 연골, 심막, 인대, 힘줄, 혈관, 배꼽 조직, 뼈 조직, 근막, 및 점막하 조직의 대체도 또한 포함된다.

본 발명의 석회화 내성 생체 적합 물질은 또한 의료 장치의 광범위한 여러 접촉 표면 모두에 적용할 수도 있다. 접촉 표면으로는 특히 인간을 포함한 동물의 혈액, 세포 또는 다른 체액이나 조직에 접촉시키고자하는 표면이 포함되나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 적합한 접촉 표면으로는 혈액 또는 다른 조직의 접촉에 의도된 의료 장치의 하나 이상의 표면이 포함된다. 상기 의료 장치로는 동맥류 코일, 인공 혈관, 인공 심장, 인공 판막, 인공 신장, 인공 힘줄 및 인대, 혈액백, 혈액 산소화장치, 뼈 및 심혈관 대체물, 인공 뼈, 뼈 왁스, 심혈관 그래프트, 연골 치환 장치, 카테터, 콘택트 렌즈, 세포 및 조직의 배양물 및 재생물의 용기, 색전술 입자(embolization particles), 여과 시스템, 그래프트, 가이드 채널, 유치형 카테터(in-dwelling catheters), 실험 기구, 마이크로비드, 신경 성장 가이드, 안과용 임플란트, 정형 외과용 임플란트, 인공 심장 박동기 리드(pacemaker leads), 프로브, 보형물, 션트, 스텐트, 펩타이드 지지체, 외과용 기구, 봉합사, 시린지, 배뇨관 치환물, 상처 피복물, 상처 드레싱, 상처 치유기 및 본 분야에서 알려진 다른 의료 장치가 포함된다.

본 발명의 적용으로 이익을 얻는 의료 장치의 다른 예는 외과 및 의료 절차 분야의 숙련자에게 분명할 것이며, 본 발명에 포함된다. 접촉 표면은 메쉬, 코일, 와이어, 팽창 기구(inflatable balloon), 또는 혈관 내 위치, 루멘 내 위치, 고형 조직 내의 위치 등을 포함한 표적 위치에 이식될 수 있는 그외의 다른 구조를 포함할 수 있다. 이식 가능한 장치는 영구적인 또는 일시적인 이식을 목적으로 할 수 있다. 이러한 장치는 혈관 내 및 다른 의료용 카테터에 의해 전달되거나 이들 내로 결합될 수 있다.

이러한 장치의 표면을 코팅하는 방법은 국제 특허 출원 WO96/24392호에 개시된 바와 같이, 플라즈마 코팅 기법에 의해 수행할 수 있다.

"포함하는"은 단어 "포함하는"에 이어지는 모든 것을 포함하는 것을 의미하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 따라서, 용어 "포함하는"의 사용은 나열된 요소들이 필수적이거나 강제적인 것을 의미하나, 다른 요소는 임의 사항으로 존재할 수도 있고, 존재하지 않을 수도 있다. "이루어진"은 표현 "이루어진"에 이어지는 모든 것을 포함하는 것을 말하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 따라서, 표현 "이루어진"은 나열된 요소들이 필수적이거나 강제적인 것을 의미하며, 다른 요소는 존재하지 않을 수 있다. "필수적으로 이루어진"은 이 표현 이후에 나열된 모든 요소를 포함하는 것을 의미하며, 나열된 요소에 대해 기재된 내용에 명시된 활성 또는 작용을 방해하거나 또는 책임지지 않는 다른 요소에 한정된다. 따라서, 표현 "필수적으로 이루어진"은 나열된 요소들이 필수적이거나 강제적이지만, 다른 요소는 선택적이며, 나열된 요소의 활성 또는 작용에 영향을 미치는지의 여부에 따라 존재할 수도 있고, 존재하지 않을 수 있음을 의미한다.

이하에서는 본 발명을 하기 비제한적 실시예를 예로 들어 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 하기 실시예들은 단지 예시에 불과할 뿐이며, 전술한 본 발명의 일반론을 어떤 방법으로든 제한하고자 하는 것이 아니다.

실시예 1 생체 적합 물질의 기본적인 처리 및 저장

콜라겐 유래의 생체 적합 물질의 채취

성장한 피그의 돼지 심장을 지역 도살장에서 채취하여, 죽은지 2 내지 4시간 이내에 아이스팩 위에 넣어 실험실로 이송했다. 상기 심장을 빙냉의 0.9%(v/v) 염수 용액으로 2회 세정하여, 붙어있는 지방을 조심스럽게 제거하고 결합 조직을 느슨하게 하였다. 대동맥 판막이 있는 대동맥근을 심장에서 적출하여, 빙냉의 0.9%(v/v) 염수/페닐 메틸 술포닐 플루오라이드(PMSF) 중에 넣고, 판막이 있는 대동맥근은 PMSF를 함유하는 0.9%(v/v) 염수 용액으로 20분간 세정하였다. 판막엽을 대동맥 판막 구멍에서 꺼내어, 빙냉의 0.9%(v/v) 염수 용액에 저장하였다.

생체 적합 물질의 가교 결합(고정화)

멸균 탈이온수 중의 인산 이수소 칼륨 완충제 9.07g/l를 함유하는 0.625%(v/v) 글루타르알데하이드 용액을 제조하였다. 상기 글루타르알데하이드 용액의 pH를 수산화 나트륨으로 pH 7.4로 조정하였다. 상기 대동맥 판막엽(aortic valve leaflets)을 글루타르알데하이드 용액 중, 1 내지 5℃에서 최소한 5일간 가교 결합하여 조직의 콜라겐에 존재하는 단백질을 가교 결합시켰다.

가교 결합된 생체 적합 물질의 세정

상기 대동맥 판막엽을 상기 글루타르알데하이드 용액에서 꺼내어 멸균 0.9%(v/v) 염화 나트륨으로 약 15분간 세정한다. 세정하는 동안, 세정 용액의 온도는 대략 10℃로 유지하였다.

생체 적합 물질의 최종 멸균 및 저장

돼지의 대동맥 판막엽을, 멸균 탈이온수 중에 인산 이수소 칼륨 완충제 29.02 g/l를 함유하는 글루타르알데하이드의 2.0%(v/v) 용액에 액침시켰다. 상기 알데하이드 용액의 pH를 수산화 나트륨으로 7.4로 조정하였다. 멸균 공정을 약 25℃에서 5일간 수행하였다. 멸균한 조직을 4그룹으로 나누어, 추가 사용할 때까지 (i) 0.625%(v/v) 글루타르알데하이드, (ii) 5.0%(v/v) 글루타르알데하이드, (iii) 10%(v/v) 글루타르알데하이드; 및 (iv) 2%(v/v) 프로필렌 옥사이드에 저장하였다.

실시예 2 생체 적합 물질의 석회화 양상에 미치는 저장 용액의 영향

작은 동물 모델 및 큰 동물 모델에서의 실험 연구를 수행하여, 콜라겐 함유 생체 적합 물질 처리군의 석회화 완화에서 상술한 멸균-저장 공정의 효과를 분석하였다.

1차 동물 연구에서, 실시예 1에서 기술한 방법에 따라 멸균하여 저장한 돼지의 대동맥 판막엽을 작은 동물 모델의 경우에 사용하였다.

4그룹 모두의 멸균되고 저장된 돼지의 대동맥 판막엽을 0.9%(v/v) 염수로 5분간 세정하였다. 세정한 조직을 성장기(6주령)의 수컷 위스터(Wistar) 래트의 중앙 복벽 영역에 만들어진 피하 포켓(래트당 각 그룹의 샘플 하나)에 외과적으로 이식하였다. 60일 후에 이들 조직을 꺼내고, 숙주 조직을 제거하여, 이 샘플을 Biotherm^TM 항온기(Marcus Medical, JHB, RSA) 내에서 90℃로 48시간 동안 건조하였다. 건조된 샘플의 무게를 측정하고, 5.0ml의 6N 초순수 염산(Merck, JHB, RSA) 중, 75℃에서 24시간 동안 칼슘 함량을 추출하였다. 다음에는 원자 흡광 분광광도계(Varian AA1275)를 사용하여 추출가능한 칼슘 함량을 측정하고, 조직(건조 중량) mg 당 칼슘 ㎍으로 환산하였다. 이들 데이터를 표 1에 요약하였다. 결과(건조된 조직 mg당 칼슘 ㎍)를 표 1에 요약하였다.

[표 1]

실시예 3 생체 적합 물질의 석회화 양상에 미치는 멸균 및 저장 용액의 영향

콜라겐 유래의 생체 적합 물질의 채취

제2 동물 연구에서, 실시예 1에 기술된 방법에 따라 돼지의 대동맥 판막엽을 채취하여 분리하였다. 분리한 돼지의 대동맥 판막엽을 3그룹으로 나누었다. 그룹I은 대표적인 가교 결합 처리(대조군)를 수용하고; 그룹II는 특허의 가교 결합 방법(WO2006/066327호, 참고로 본 명세서에 원용함)을 수용하며; 그룹III은 그룹II와 동일한 가교 결합 처리를 수용하지만, 계속해서 가교 결합된 생체 적합 물질을, 약 4%(v/v)의 프로필렌 옥사이드를 포함하는 멸균 용액과 접촉시키고, 상기 생체 적합 물질을 30℃ 내지 55℃에서 48시간을 초과하는 시간 동안 배양하였다.

대동막 판막엽의 가교 결합(고정화)

그룹I에서, 멸균 탈이온수 중의 인산 이수소 칼륨 완충제 9.07g/l를 함유하는 0.625% 글루타르알데하이드 용액을 제조하였다. 상기 글루타르알데하이드 용액의 pH를 수산화 나트륨으로 7.4로 조정하였다. 상기 대동맥 판막엽을 상기 글루타르알데하이드 용액 중, 1 내지 5℃에서 최소 5일 동안 가교 결합하여 조직의 콜라겐에 존재하는 단백질을 가교 결합시켰다.

그룹II 및 III에서, 60 내지 80%(v/v) 알코올 에탄올의 수용성 알코올 함유 용액을 제조하였다. 돼지의 대동맥 판막엽을 4℃에서 밤새 저장한 후 알코올 용액에 액침시켰다. 판막이 있는 대동맥근을 빙냉의 0.9%(v/v) 염수(0.5mM PMSF 함유)로 최종 세정한 후 즉시 동일한 알코올 용액에 액침시켰다. 돼지의 대동맥 판막엽을 상기 알코올 용액 중, 약 5℃에서 최소 24시간 동안 유지시켰다.

상기 돼지의 대동맥 판막엽을 알코올 용액에서 꺼내어 0.9%(v/v) 염수로 약 10분간 세정하였다. 세정하는 동안, 세정 용액의 온도는 대략 10℃로 유지하였다.

상기 대동맥 판막엽을, 멸균 탈이온수 중의 인산 이수소 칼륨 완충제 9.07g/l를 함유하는 글루타르알데하이드의 0.625%(v/v) 용액 중에 액침시켰다. 상기 글루타르알데하이드 용액의 pH를 수산화 나트륨으로 7.4로 조정하였다. 심막 및 판막이 있는 대동맥근을 글루타르알데하이드 용액 중, 1 내지 5℃에서 최소 24시간 동안 고정하여 조직의 콜라겐에 존재하는 단백질을 가교 결합시켰다.

상기 글루타르알데하이드 용액에서 돼지의 판막엽을 꺼내어 멸균 0.9%(v/v) 염화 나트륨으로 약 15분간 세정하였다. 세정하는 동안, 세정 용액의 온도는 대략 10℃에서 유지하였다.

다음에는, 돼지의 대동맥 판막엽을, 탈이온수 1ml당 이카복실산 8mg을 함유하는 완충제가 없는 용액 중에 액침시켰다. 상기 용액의 pH를 희석된 염산 일정량으로 pH 4.5로 조정하였다. 심막 및 판막이 있는 대동맥근을 상기 용액 중, 약 45℃에서 약 48 시간 동안 액침시켰다.

생체 적합 물질의 최종 멸균 및 저장

다음에는 돼지의 대동맥 판막엽을 하기와 같이 하여 멸균한 후 저장하였다.

(i) 상기 조직을 멸균 탈이온수 중의 인산 이수소 칼륨 완충제 9.07g/l를 함유하는 0.25%(v/v) 글루타르알데하이드 용액 중에 액침시켰다. 상기 알데하이드 용액의 pH를 수산화 나트륨으로 7.4로 조정하였다. 멸균 공정을 약 45℃의 온도에서 약 120분간 수행하였다(처리 A); 또는

(ii) 돼지의 대동맥 판막엽을, 4%(v/v)의 프로필렌 옥사이드와 20%(v/v)의 에틸 알코올을 조합하여 포함하는 수용액 중, 37℃에서 약 24시간 동안 멸균하고, 4%(v/v)의 프로필렌 옥사이드 용액 중에 저장하였다(처리 B-본 발명).

3그룹 모두의 멸균 및 저장한 돼지의 대동맥 판막엽을 0.9%(v/v) 염수로 5분간 세정하였다. 세정한 조직을 성장기(6주령)의 수컷 위스터(Wistar) 래트의 중앙 복벽 영역에 만들어진 피하 포켓(래트 당 각 그룹의 샘플 하나)에 외과적으로 이식하였다. 60일 후에 이들 조직을 꺼내고, 숙주 조직을 제거하여, 이 샘플을 Biotherm^TM항온기(Selby Scientific, Perth, WA) 내에서 90℃로 48시간 동안 건조하였다. 건조된 샘플의 무게를 측정하고, 5.0ml의 6N 초순수 염산(Merck, Sydney, Australia) 중, 75℃에서 24시간 동안 칼슘 함량을 추출하였다. 다음에는 원자 흡광 분광광도계(Varian AA1275)를 사용하여 추출가능한 칼슘 함량을 측정하고, 조직(건조 중량) mg당 칼슘 ㎍으로 환산하였다. 결과(건조된 조직 mg당 칼슘 ㎍)를 표 2에 요약하였다.

실시예 4 소 심막의 석회화 양상에 미치는 처리 B의 영향

제3 동물 연구에 있어서, 실시예 3에서와 같이(0.625% 완충된 글루타르알데하이드, 처리 A + 0.25%(v/v) 글루타르알데하이드 및 처리 B 4%(v/v) 프로필렌 옥사이드) 제조되고, 가교 결합 및 저장된 소 심막의 석회화 가능성을, 0.2% 글루타르알데하이드 용액 중에 저장된 시판되고 있는 한콕 심막(Hancock pericardium)의 석회화 가능성과 비교하였다.

각 그룹의 대표 샘플을 1 x 1cm 크기로 잘라 0.9%(v/v) 염수로 5분간 세정하였다. 이들 샘플을 성장기(6주령) 수컷 위스터(Wistar) 래트의 중앙 복벽 영역에 만들어진 피하 포켓에 외과적으로 이식하였다. 60일 후에, 이들 조직을 꺼내고, 숙주 조직을 제거하여 원자 흡광 분광광도계로 칼슘 함량을 측정하였다. 결과(건조 조직 mg당 칼슘 ㎍)를 표 3에 요약하였다.

실시예 5 큰 동물 모델에서 돼지 대동맥 판막 조직( 판막엽 & 대동맥벽)의 석회화 양상에 미치는 처리 B의 영향

제4 동물 연구에 있어서, 돼지의 대동맥 판막 조직(판막엽 및 대동맥벽)을 준비하고, 0.625% 완충된 글루타르알데하이드 중에서 가교 결합하여, (i) 0.625% 글루타르알데하이드, (ii) 처리 A(0.625% 글루타르알데하이드)로 처리, (iii) 처리 B(4% 프로필렌 옥사이드)로 처리한 조직의 석회화 가능성을 시험하였다.

각 그룹의 대표 샘플을 대략 1.2 x 1cm의 타원형 크기로 잘라 0.9%(v/v) 염수로 5분간 세정하였다. 이들 샘플을 어린 양(체중 22 내지 25 kg)의 경정맥에 외과적으로 이식하였다. 150일 후에, 이들 조직을 꺼내고, 숙주 조직을 제거하여 원자 흡광 분광광도계로 칼슘 함량을 측정하였다. 결과(건조 조직 mg당 칼슘 ㎍)를 표 4-A(판막엽) 및 표 4-B(대동맥벽)에 요약하였다.

실시예 6 유효 검사: 고초균( Bacillus subtilis ) 포자로 접종한 시판의 심장 판막의 멸균

시판의 심장 판막 조직을 48시간 후에 45℃에서 4% 프로필렌 옥사이드로 멸균하는 실현 가능성을 시험하기 위해 유효 검사(validation)를 실시하였다. 이 실현 가능성 연구의 목적은 3.8% 프로필렌 옥사이드("최악의 경우" 농도 수준으로서)가 FDA 규정에 따라 "최악의 경우" 조건(고초균(Bacillus subtilis) 포자로 오염) 하에서 시판의 심장 판막 X 조직을 멸균할 수 있는 지를 조사하기 위한 것이다. 상기 시험 조건은 다음과 같다:

- 0.5% 글루타르알데하이드에서 상기 판막을 꺼내어 멸균 증류수 총 1000ml로 총 6분간 세정하였다.

- 다음에, 상기 판막 홀더 및 상기 판막을 무균적으로 분리한 후 눈에 보이게 건조할 때까지 또는 대략 30분 동안 건조시켰다.

- 각 장치의 상기 판막 홀더 및 판막을 STERIS Corporation, USA에서 입수한

고초균(Bacillus subtilis) 포자의 현탁액 총 20 ㎕로 접종하였다. 상기 현탁액의 포자 수는 1.25 x 10⁶개였다.

- 다음에는 상기 판막을 실온에서 대략 1시간 동안 건조시켰다.

- 다음에는 상기 장치를 수용체에 따라 재조립하여 멸균 병에 넣었다.

- 10개의 장치에 160ml의 새로 제조한 3.8% 프로필렌 옥사이드를 가하였다.

- 최종 장치에, 160ml의 대두 카제인 다이제스트 배지(SCDM)를 가하였다. 이를 상기 포자 현탁액의 유효성을 조사하기 위한 양성 대조군으로 하였다. 이 양성 대조군을 32℃에서 48시간 동안 배양하였다.

- 다음에는 10개의 시험 판막을 42℃에서 44시간 동안 배양하였다.

- 배양에 이어서, 각 판막에 대해 멸균 시험을 실시하였다.

- 상기 판막을 분리하여 각 성분을 멸균 빈 병에 옮기고, SCDM을 가하였다.

- 다음에는 상기 병을 32℃에서 14일 동안 배양했다.

- 상기 병의 혼탁 징후를 매일 검사했다.

시험의 상세 내용:

Lab Number: 7343042W

방법: British Pharmacopoeia, 2010, 부록 XVI, 및 제약 시험 기능 절차 MB:PT:0110 멸균 시험에 따른 방법.

실시예 7 작은 동물 모델에서 시판의 심장 판막 조직(소의 심막 조직)의 석회화 양상에 미치는 처리 B의 영향

표 6은 제5 동물 연구의 결과를 나타내며, 여기에서 0.625%(v/v) 글루타르알데하이드 중에서 가교 결합 및 멸균된 소의 심막(대조군으로서 제공-A 표시)의 석회화 가능성을, 시판의 심장 판막 조직(0.625%(v/v) 완충된 글루타르알데하이드 가교 결합 + 포름알데하이드 저장인 시판의 특허 프로토콜에 따라 가교 결합 및 저장한 소의 심막-B 표시) 및 4%(v/v) 프로필렌 옥사이드 중, 45℃에서 48시간 동안 멸균하고, 4%(v/v) 프로필렌 옥사이드 용액 중에 저장한 동일한 시판의 심장 판막 조직(C 표시)과 비교하였다.

각 그룹의 대표 샘플을 1 x 1cm 크기로 잘라 0.9%(v/v) 염수로 5분간 세정하였다. 이들 샘플을 성장기(6주령) 수컷 위스터(Wistar) 래트의 중앙 복벽 영역에 만들어진 피하 포켓에 외과적으로 이식하였다. 8주, 16주 및 24주 후에, 이들 조직을 꺼내어, 숙주 조직을 제거하고, 원자 흡광 분광광도계로 칼슘 함량을 측정하였다. 결과(건조 조직 mg당 칼슘 ㎍)를 표 6에 요약하였다.

실시예 8 신속한 시험관내 석회화 모델에서 시판의 심장 판막 조직(소의 심막 조직)의 석회화 양상에 미치는 처리 B의 영향

추가의 실험 평가에 있어서, 시판의 판막 조직(대조군)의 석회화 가능성을, 신속한 시험관내 석회화 모델에서 4% 프로필렌 옥사이드 중, 45℃에서 48시간 동안 멸균하고, 4% 프로필렌 옥사이드 용액 중에 저장한 시판의 심장 판막 조직(처리군)과 비교하였다.

덧댄 시판의 심장 판막(대조군 및 처리군)을 로원 애쉬 피로 시험기(Rowan Ash Fatigue tester)에 올려놓고, 유속(분당 시험 400 사이클)을 5000만 사이클 이하로 가속화하는 동안 생리 용액(칼슘/인산염 고 함량)에 노출시켰다.

5000만 시험 사이클 이후에, 심장 판막을 꺼내고, 제시된 조직 샘플을 조직학으로 생각했다. 각 판막에서 3개의 판막엽 각각에 대한 나머지 조직을 꺼내어 원자 흡광 분광광도계로 칼슘 함량을 측정했다. 결과(건조 조직 mg당 칼슘 ㎍)를 표 7에 요약하였다.

실시예 9 고초균( Bacillus subtilis ) 포자로 접종한 조직에 미치는 멸균 및 저장 방법의 영향

도 1 및 도 2는 시간의 경과에 따라 고초균(B. subtilis ) 포자에 미치는 15℃ 내지 45℃의 온도 변화에 따른 2%(v/v) 및 4%(v/v) 프로필렌 옥사이드 각각의 영향을 나타낸다. 사용된 실험 조건은 실시예 6에 기재되어 있다. 기본적으로, 멸균 용액(2% 또는 4%)은 모두 48시간 전에는 멸균 효과를 전혀 갖지 않음을 알 수 있다. 또한, 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 48시간 이내에 온도 상승의 효과는 멸균에 지대한 영향을 미친다. 예를 들면, 40℃ 및 그 이상의 온도에서 24시간 후에 멸균되었고, 48시간까지 25℃ 및 그 이상의 온도에서조차 멸균되었다. 도 1은 2%(v/v) 프로필렌 옥사이드로 멸균효과를 얻기 위해서 상기 조직을 35℃가 넘는 온도에서 적어도 6일간 배양할 필요가 있음을 보여준다. 15 내지 20℃에서 10일간 배양하여도 2%(v/v) 프로필렌 옥사이드를 사용한 멸균에 대해 재료 영향을 나타내지 않는다.

따라서, 도 1 및 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 상기 조직을 4%(v/v) 프로필렌 옥사이드 용액과 접촉시키고, 상기 조직을 약 45℃에서 48시간을 초과하는 시간 동안 배양함으로써 최적의 멸균이 얻어진다.

Claims

(i) 가교 결합된 콜라겐계 생체 적합 물질을, 3 내지 6 %(v/v) 프로필렌 옥사이드를 함유하는 멸균 용액과 접촉시키고, 상기 생체 적합 물질을 30℃ 내지 55℃의 배양 온도에서 48시간을 초과하는 시간 동안 배양하는 단계로서, 단 상기 멸균 용액은 알코올을 함유하지 않는 단계; 및
(ii) 생체 적합 물질의 존재 하에 적어도 상기 프로필렌옥사이드가 프로필렌글리콜로 전환될 때까지, 상기 생체 적합 물질을 멸균 용액 내에 유지시키는 단계를 포함하는 것인, 가교 결합된 콜라겐계 생체 적합 물질의 멸균 방법.
제1항에 있어서,
상기 배양 온도가 35℃ 내지 50℃인 방법.
제1항에 있어서,
상기 배양 온도가 45℃인 방법.
제1항에 있어서,
48시간 후에, 상기 배양 온도를 실온으로 낮추는 것인 방법.
제1항에 있어서,
상기 멸균 용액이 3.8 내지 4.5%(v/v) 프로필렌 옥사이드를 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서,
상기 멸균 용액이 4%(v/v) 프로필렌 옥사이드를 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서,
상기 멸균은 2 내지 10일 또는 그 이상의 기간 동안 수행되는 것인 방법.
제1항에 있어서,
상기 콜라겐계 생체 적합 물질은 양, 소, 염소, 말, 돼지, 유대목 동물 및 인간으로 이루어진 군으로부터 선택된 동물로부터 분리된 것인 방법.
제1항에 있어서,
상기 생체 적합 물질이 심혈관 조직, 심장 조직, 심장 판막, 대동맥근, 대동맥벽, 대동맥판엽, 심막 조직, 결합 조직, 경막, 진피 조직, 도관 조직, 연골, 심막, 인대, 힘줄, 혈관, 배꼽 조직, 뼈 조직, 근막, 및 점막하 조직 및 피부로 이루어진 군에서 선택된 세포 조직인 방법.
삭제
(a) 콜라겐계 생체 적합 물질을 제공하고, 0.625%(v/v)의 글루타르알데하이드 용액 및 pH 7.4의 인산 이수소 칼륨과 접촉시키고;
(b) 상기 생체 적합 물질을 1℃ 내지 5℃에서 적어도 5일간 배양하여 가교 결합된 콜라겐계 생체 적합 물질을 생성하고;
(c) 상기 가교 결합된 콜라겐계 생체 적합 물질을, 3% 내지 6%(v/v) 프로필렌 옥사이드를 포함하는 멸균 용액과 접촉시키고, 상기 생체 적합 물질을 30℃ 내지 55℃에서 48시간을 초과하는 시간 동안 배양하는 단계로서, 단, 상기 멸균 용액은 알코올을 함유하지 않는 단계; 및
(d) 생체 적합 물질의 존재 하에 적어도 상기 프로필렌옥사이드가 프로필렌글리콜로 전환될 때까지, 상기 생체 적합 물질을 멸균 용액 내에 유지시키는 단계를 포함하는 것인, 콜라겐계 생체 적합 물질의 멸균 방법.
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제1항의 방법에 의해 생성된, 멸균된 가교 결합된 콜라겐계 생체 적합 물질.
멸균된 가교 결합된 콜라겐계 생체 적합 물질 및 3% 내지 6%(v/v) 프로필렌 글리콜 용액을 포함하는 용기로서,
상기 프로필렌 글리콜은 상기 생체 적합 물질의 존재 하에서, 3% 내지 6%(v/v) 프로필렌 옥사이드 용액의 동일반응계 내(in situ) 전환으로부터 생성된 것인 용기.