CN105717053A - 一种基于疲劳试验台的体外生物瓣钙化评价方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物瓣钙化评价领域，具体涉及一种基于疲劳试验台的体外生物瓣钙化评价方法，包括以下步骤：体外钙化反应，取生物瓣样品放入到疲劳试验台的循环管路中，同时将血浆含钙溶液通过加液口加入到循环管路中，使血浆含钙溶液泵向并流经生物瓣；钙定量检测，对体外钙化反应完成后的生物瓣样品进行原子吸收光谱的钙含量测定，得到生物瓣样品的钙含量。本发明通过涉及一种基于疲劳试验台的体外生物瓣钙化评价方法，将生物瓣放入疲劳试验台，通过挤压血浆含钙溶液使其流动并通过所述的生物瓣样品，模拟人体内瓣膜的工作状态，以评价生物瓣的钙化情况，与现有恒温水浴摇床评价方法相比，可更快速有效地判断化学处理后的生物瓣的抗钙化性能。

Description

一种基于疲劳试验台的体外生物瓣钙化评价方法

技术领域

本发明涉及生物瓣钙化评价领域，具体涉及一种基于疲劳试验台的体外生物瓣钙化评价方法。

背景技术

目前年龄超过65岁老年人中，由于主动脉瓣钙化所致的主动脉瓣狭窄发生率达2％～7％，随着年龄增长主动脉瓣狭窄比例越来越高。严重主动脉瓣狭窄的病人左心功能严重受损，病人生活质量下降且生存时间明显缩短，必须进行有效的治疗。

针对外科手术适应症的严重主动脉瓣病人，外科人工主动脉瓣置换术(无论选用机械瓣或生物瓣)仍然是首选治疗，置换后主动脉瓣口面积常大于1.5cm²。然而，对于那些高龄、主动脉瓣狭窄终末期、全身多发的严重合并症的病人，外科主动脉瓣置换术后死亡和其它严重并发症的发生率大大增加。经皮球囊主动脉瓣成形术治疗老年主动脉瓣狭窄的方法，由于术中、手术后产生死亡、中风、主动脉破裂、主动脉瓣严重关闭不全等严重并发症的发生率高，术后短期(3～12个月)内主动脉瓣又明显狭窄，所以已不作为严重主动脉瓣狭窄的治疗方法。另外，严重主动脉瓣狭窄的高龄老年病人，无外科手术适应症时，临床治疗十分困难。

随着介入人工心脏生物瓣的广泛使用，如何提高其使用寿命，降低生物瓣膜的衰坏是我们面临的重要难题。钙化是生物瓣膜衰坏的首要因素,钙盐沉积为其最显著的病理特征。我们通过临床解剖，化学分析，结合血液中钙磷含量等因素，确定了以化学为主、物理作用为辅的研究方向，在生物瓣膜处理液中加入钙化抑制因子,对易钙化位点进行封闭或化学修饰，从而提高生物瓣膜的防钙化性能。

生物瓣因其材质原因，需要做生物相容性、疲劳试验、钙化试验等指标的评价，在钙化方面，目前普遍采用羊或者猪进行动物试验的评价方法，无快速有效的体外评价方法。

在进行动物试验前，选取适龄的猪或者羊，经过医生超声以及健康状况观察，评价手术风险和匹配度，确定瓣架和主肺动脉口径的吻合度，要求瓣架尺寸与主动脉或者肺动脉口径相匹配，防止瓣周漏或移位等情况发生。然后根据动物临床的要求开展动物临床，将经过处理后的生物瓣植入到猪或者羊体内，经超声影像观察瓣膜正常工作，通过饲养半年到一年的观察期，解剖取出生物瓣后经原子吸收光谱法检测生物瓣组织的含钙量，从而判定生物瓣的抗钙化性能。

通过动物临床来评价生物瓣钙化的方法具有一定的局限性，对临床手术和临床医生的技术依存度要求高、对动物选择也有相应要求，同时饲养周期长、受饲养环境和个体差异的影响较大，可能出现其它症状，比如生物瓣表皮化、生长赘生物等，不能准确有效的反映生物瓣化学处理后与钙离子的化学作用。

现有技术方法不仅仅在技术上增加了难度，而且时间和成本上都大幅的增加，也无法同时在相同条件下进行多个瓣膜的平行钙化评价试验，同时在生物瓣的钙化性能评价上，受到多种因素的影响。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术的上述缺陷，提供一种基于疲劳试验台的体外生物瓣钙化评价方法，快速有效地判断化学处理后的生物瓣的抗钙化性能。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种基于疲劳试验台的体外生物瓣钙化评价方法，对生物瓣进行化学抗钙化处理，形成生物瓣样品，包括以下步骤：

体外钙化反应，取生物瓣样品放入到疲劳试验台的循环管路中，同时将血浆含钙溶液通过加液口加入到循环管路中，使血浆含钙溶液泵向并流经生物瓣，模拟人体心脏的血液循环，该血浆含钙溶液流经瓣膜时，与瓣膜发生化学反应，钙离子通过化学键结合到瓣膜中；

钙定量检测，对体外钙化反应完成后的生物瓣样品进行原子吸收光谱的钙含量测定，得到生物瓣样品的钙含量。

其中，较佳方案是，该血浆含钙溶液为人工代血浆含钙溶液，其配置1L包括的成分及含量为：质量百分比浓度为2～30％的CaCl₂溶液5～40mL；羟乙基淀粉氯化钠注射液960～1000mL。

其中，较佳方案是，该人工代血浆含钙溶液配置1L的成分及含量还包括：卡那霉素4.5～5.5mg。

其中，较佳方案是：该循环管路包括若干密封且相互连通的腔体，取生物瓣样品放入到对应的腔体中，挤压血浆含钙溶液使其在腔体中流动并通过所述的生物瓣样品。

其中，较佳方案是：该疲劳试验台通过电机有规律的上下振动，挤压血浆含钙溶液使其在腔体中单向流动，并流经所述的生物瓣样品。

其中，较佳方案是：该疲劳试验台的电机振幅频率是可控的，该电机振幅频率为每分钟200～2000次。

其中，较佳方案是：在30～40℃的环境下，该疲劳试验台通过挤压血浆含钙溶液使其流动并流经所述的生物瓣样品，并持续工作30～60天。

其中，较佳方案是，该钙定量检测还包括步骤：

对体外钙化反应完成后的生物瓣样品，通过混合酸消化液进行消化并形成试样液；

将试样液导入原子吸收分光光度计中，经火焰原子化后，吸收422.7nm的共振线，该试样液的吸收量与其钙含量成正比，并与标准系列比较定量，得到生物瓣样品的钙含量。

其中，较佳方案是：在生物瓣样品进行消化后，加入适量的氧化镧并形成试样液。

其中，较佳方案是：该混合酸消化液包括体积比为4:1的硝酸和高氯酸,该硝酸的浓度为0.1～1mol/L，该高氯酸的浓度为0.1～1mol/L。

本发明的有益效果在于，与现有技术相比，本发明通过涉及一种基于疲劳试验台的体外生物瓣钙化评价方法，将生物瓣放入疲劳试验台，通过挤压血浆含钙溶液使其流动并通过所述的生物瓣样品，模拟人体内瓣膜的工作状态，以评价生物瓣的钙化情况，与现有恒温水浴摇床评价方法相比，可更快速有效地判断化学处理后的生物瓣的抗钙化性能；同时，减少工序和实现多个生物瓣同时体外钙化反应，从而极大的节省了科研费用和增加了钙化试验的精确度。

具体实施方式

现对本发明的较佳实施例作详细说明。

本发明旨在解决生物瓣经化学抗钙化处理后，通过疲劳试验台高效且快速地评估生物瓣的防钙化性能，对临床起到积极的推动作用；同时，本发明排除了其它因素对钙化的影响，如免疫反应、动物个体差异，在短周期内和相同条件下，对多个生物瓣同时进行体内模拟试验，可以快速地体现生物瓣中的各种化学基团与钙离子形成的化学反应，以及评价生物瓣的防钙化性能。

本发明提供一种基于疲劳试验台的体外生物瓣钙化评价方法的优选实施例。

一种基于疲劳试验台的体外生物瓣钙化评价方法，包括以下步骤：

S01、对生物瓣进行化学抗钙化处理，形成生物瓣样品，增强生物瓣膜的防钙化能力；

S02、体外钙化反应，取生物瓣样品放入到疲劳试验台的循环管路中，同时将血浆含钙溶液通过加液口加入到循环管路中，使血浆含钙溶液泵向并流经生物瓣，模拟人体心脏的血液循环，该血浆含钙溶液流经瓣膜时，与瓣膜发生化学反应，钙离子通过化学键结合到瓣膜中；

S03、钙定量检测，对体外钙化反应完成后的生物瓣样品进行原子吸收光谱的钙含量测定，得到生物瓣样品的钙含量。

在本实施例的步骤S02中，血浆含钙溶液为人工代血浆含钙溶液，其配置1L包括的成分及含量为：质量百分比浓度为2～30％的CaCl₂溶液5～40mL；羟乙基淀粉氯化钠注射液960～1000mL。进一步地，人工代血浆含钙溶液配置1L的成分及含量还包括：卡那霉素4.5～5.5mg；人工代血浆含钙溶液中增加卡那霉素，使溶液本身具有杀菌效果。

其中，CaCl₂溶液的浓度为1000ug/mL，具体配置方法如下：称取经烧灼后的高纯氧化钙1.3992g，置于250mL烧杯中，加入盐酸20mL，低温加热溶解，冷却后移入1000mL容量瓶中，用去离子水定容刻度，摇匀。同时，CaCl₂溶液配置完成后贮存于聚乙烯瓶内并在4℃环境下保存。

其中，本实施例还提供人工代血浆含钙溶液的配置1L包括的成分及含量的方案，包括四种配制方案，如下所示：

人工代血浆溶液中钙含量配比是关键因素，直接影响到瓣膜抗钙化的效果，通过考虑成人血液中钙离子的含量和生物瓣的化学反应量来确定溶液中钙含量配比。由于瓣膜经戊二醛充分交联以后，瓣膜中会残留一定数量的醛基和游离羧基，通过化学反应封闭胶原蛋白中游离羧基和醛基，同时醛基性质活泼，容易还原成羟甲基(—CH₂OH)或氧化成羧基，在人工代血浆溶液中加入钙离子含量的多少，直接影响到钙与组织中游离基团的反应量，从而影响瓣膜的挂钙量。

在本实施例的步骤S02中，该循环管路包括若干密封且相互连通的腔体，取生物瓣样品放入到对应的腔体中，通过挤压血浆含钙溶液使其在腔体中流动并通过所述的生物瓣样品。进一步地，该疲劳试验台通过电机有规律的上下振动，挤压血浆含钙溶液使其在腔体中单向流动，并流经所述的生物瓣样品。

优选地，生物瓣工作位置包括四个密封且相互连通的腔体，取3个生物瓣样品和1个未经过抗钙化处理的正常生物瓣，分别放置在对应的腔体中，进行体外钙化反应和钙定量检测，用于评价生物瓣样品的抗钙化的有效性。此过程是评价生物瓣的钙化性能的重要环节，模拟人体心脏的血液循环，即模拟人体心脏收缩和舒张，血液有规律的经过瓣膜流向全身循环的原理，该血浆含钙溶液流经瓣膜时，与瓣膜发生化学反应，钙离子通过化学键结合到瓣膜中。

进一步地，该疲劳试验台的电机振幅频率是可控的，该电机振幅频率为每分钟200～2000次；同时，在30～40℃的环境下，该疲劳试验台通过挤压血浆含钙溶液使其流动并流经所述的生物瓣样品，并持续工作30～60天，即可取出生物瓣并进行钙定量检测。

其中，加速瓣膜运转频率(提高电机振动频率)可以缩短评价时间，提高效率；模拟心脏瓣膜运动方式(对血浆含钙溶液挤压使其在腔体中单向流动，并通过所述的生物瓣样品的瓣叶开闭口)，能更好的促进钙化反应；在同一液体环境中同时进行4个生物瓣的体外钙化反应(生物瓣工作位置包括四个密封且相互连通的腔体)，使结果更趋合理性。

本发明在时间上极大的缩短了钙化评价周期，与动物临床6个月相比，缩短了5个月时间。同时减少了工序，以及一台疲劳试验台可以同时工作4个瓣膜，通过疲劳试验的加速试验，不再需要试验动物和临床医生的参与，从而极大的节省了科研费用和增加了钙化试验的精确度，在技术上对生物瓣化学处理的钙化评价，形成了一套高效的评价方法，标准化的评价，不易受其它因素的影响，对因化学基团造成的生物瓣钙化现象具有很好的评价意义，也为后续动物体内生物瓣的钙化评价起到了辅助和指导作用。

在本实施例的步骤S03中，钙定量检测包括步骤：

S031、对体外钙化反应完成后的生物瓣样品，通过混合酸消化液进行消化并形成试样液；

S032、将试样液导入原子吸收分光光度计中，经火焰原子化后，吸收422.7nm的共振线，该试样液的吸收量与其钙含量成正比，并与标准系列比较定量，得到生物瓣样品的钙含量。

其中，该混合酸消化液包括体积比为4:1的硝酸和高氯酸,该硝酸的浓度为0.1～1mol/L，该高氯酸的浓度为0.1～1mol/L；优选地，硝酸和高氯酸分别为0.5mol/L和0.4mol/L。

具体生物瓣样品和正常生物瓣的钙含量如下表所示：

进一步地，在生物瓣样品进行消化后，加入适量的氧化镧并形成试样液；优选地，氧化镧为20g/L氧化镧溶液，具体配置方式是：称取23.45g氧化镧(纯度大于99.99％)，现用少量水湿润，再加75mL盐酸1000mL容量瓶中，加去离子水稀释至刻度。

钙定量检测的具体方式是：

1、将生物瓣样品在105℃下烘干，持续3小时，至恒重并记录此时生物瓣样品的质量m；

2、取生物瓣样品(烘干后)于100mL高型烧杯中，加入20mL的混合酸消化液，上盖表面皿，并置于电热板或沙浴上加热消化；其中，如未消化好而混合酸消化液过少时，再补加几毫升的混合酸消化液，继续加热消化，直至溶液呈无色透明为止；

3、加几毫升水，加热以除去多余的硝酸，并且，待烧杯中液体接近2～3mL时，取下冷却；

4、用20g/L氧化镧溶液洗并转移于10mL容量瓶中，并定容至刻度，获得试样液；

5、取同量的混合酸消化液，按上述步骤1-4操作，获得空白液；

6、将试样液、空白液分别导入火焰进行测定；其中，若试样液的含钙浓度超过标准曲线最高浓度时，则稀释后再进行测定；

7、在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值，检验不得超过算术平均值的10％，确定本次测定有效。

其中，生物瓣样品中钙含量的计算式如下：

$X=\frac{(C1-C0)\×V\×f\×100}{m\×1000}$

在式中，

X---生物瓣样品中钙的含量，单位为毫克每百克(mg/l00g)；

C1---试样液中钙的浓度，单位为微克每毫升(μg/mL)；

C0---空白液中钙的浓度，单位为微克每毫升(μg/mL)；

V---试样液定容体积，单位为毫升(mL)；

f---稀释倍数；

m---生物瓣样品的质量，单位为克(g)。

上述计算结果表示到小数点后三位。

以上所述者，仅为本发明最佳实施例而已，并非用于限制本发明的范围，凡依本发明申请专利范围所作的等效变化或修饰，皆为本发明所涵盖。

Claims (10)

1.一种基于疲劳试验台的体外生物瓣钙化评价方法，对生物瓣进行化学抗钙化处理，形成生物瓣样品，其特征在于，包括以下步骤：

体外钙化反应，取生物瓣样品放入到疲劳试验台的循环管路中，同时将血浆含钙溶液通过加液口加入到循环管路中，使血浆含钙溶液泵向并流经生物瓣，模拟人体心脏的血液循环，该血浆含钙溶液流经瓣膜时，与瓣膜发生化学反应，钙离子通过化学键结合到瓣膜中；

钙定量检测，对体外钙化反应完成后的生物瓣样品进行原子吸收光谱的钙含量测定，得到生物瓣样品的钙含量。

2.根据权利要求1所述的体外生物瓣钙化评价方法，其特征在于，该血浆含钙溶液为人工代血浆含钙溶液，其配置1L包括的成分及含量为：质量百分比浓度为2～30％的CaCl₂溶液5～40mL；羟乙基淀粉氯化钠注射液960～1000mL。

3.根据权利要求2所述的体外生物瓣钙化评价方法，其特征在于，该人工代血浆含钙溶液配置1L的成分及含量还包括：卡那霉素4.5～5.5mg。

4.根据权利要求1所述的体外生物瓣钙化评价方法，其特征在于：该循环管路包括若干密封且相互连通的腔体，取生物瓣样品放入到对应的腔体中，挤压血浆含钙溶液使其在腔体中流动并通过所述的生物瓣样品。

5.根据权利要求4所述的体外生物瓣钙化评价方法，其特征在于：该疲劳试验台通过电机有规律的上下振动，挤压血浆含钙溶液使其在腔体中单向流动，并流经所述的生物瓣样品。

6.根据权利要求5所述的体外生物瓣钙化评价方法，其特征在于：该疲劳试验台的电机振幅频率是可控的，该电机振幅频率为每分钟200～2000次。

7.根据权利要求1或6所述的体外生物瓣钙化评价方法，其特征在于：在30～40℃的环境下，该疲劳试验台通过挤压血浆含钙溶液使其流动并流经所述的生物瓣样品，并持续工作30～60天。

8.根据权利要求1所述的体外生物瓣钙化评价方法，其特征在于，该钙定量检测还包括步骤：

对体外钙化反应完成后的生物瓣样品，通过混合酸消化液进行消化并形成试样液；

将试样液导入原子吸收分光光度计中，经火焰原子化后，吸收422.7nm的共振线，该试样液的吸收量与其钙含量成正比，并与标准系列比较定量，得到生物瓣样品的钙含量。

9.根据权利要求8所述的体外生物瓣钙化评价方法，其特征在于：在生物瓣样品进行消化后，加入适量的氧化镧并形成试样液。

10.根据权利要求8所述的体外生物瓣钙化评价方法，其特征在于：该混合酸消化液包括体积比为4:1的硝酸和高氯酸,该硝酸的浓度为0.1～1mol/L，该高氯酸的浓度为0.1～1mol/L。