CN107831124A - 一种饲料中有效磷含量的仿生消化测定方法 - Google Patents

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Abstract

一种饲料中有效磷含量的仿生消化测定方法，采用单胃动物仿生消化系统运行模拟消化过程，1)样品处理：2)胃模拟消化；3)小肠模拟消化；4)消化残渣的处理；5)制作磷含量标准曲线；6)比色法测定消化液中磷含量测定，移取上清液至试管中，加入钒钼酸铵显色剂摇匀，室温下放置10min，用比色皿在波长415nm处测定吸光值；准确移取样品空白上清液至试管中，加入钒钼酸铵显色剂，摇匀，室温下放置10min，用比色皿在波长415nm处测定吸光值；7)实验管OD415值与空白管OD415值之差，代入标准曲线中计算无机磷浓度。

Description

一种饲料中有效磷含量的仿生消化测定方法
技术领域
本发明涉及一种饲料有效磷仿生评定法，特别是涉及一种饲料中有效磷含量的仿生消化测定方法。
背景技术
磷(Phosphorus)是动植物体内的必需矿物元素，是继蛋白质和能量之外的第三昂贵的饲料原料。客观、准确评定各种饲料原料的生物学效价是动物营养需要量研究、优化饲料配方的基础，是提高畜禽日粮利用率、降低日粮成本及养殖业节能减排的决策依据。饲料磷生物学效价的评定方法主要有体内法(in vivo)和体外法(in vitro)。体内法耗资、费力、费时，系统误差和偶然误差影响因素多，不同时空条件下的测值重演性、可比性差不能满足研究和生产应用所需。而体外法具有快速、简便、费用低等优点，各国营养学家都有诸多研究报道。近年来，饲料磷的体外评定技术在国际上越来越受到关注，从而推动了相关研究的快速发展，其中以Zyla等(1995)和Liu等(1997，1998)所建立的方法应用最为广泛。然而这些体外法大都以三角瓶、试管、透析管等简单实验器材为基础，由于大量的人工操作引入的系统误差所得结果可重复性和精度较差。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供一种畜禽饲料有效性与安全性评价过程中饲料仿生消化后所释放的磷的含量测定方法。
在系统总结生长猪消化道主要消化酶变异规律的基础上，设计出模拟杜×长×大三元杂交生长猪在典型饲粮条件下的酶谱与水解环境，开发了可全自动模拟猪体内消化过程的单胃动物仿生消化系统(SDS-3)。模拟动物消化道内环境，饲料在单胃动物仿生消化系统完成模拟30kg生长猪的体内消化过程，水解产物通过钒钼酸铵测定消化液中磷的总量。同时，测定试样的干物质含量。以计算每克绝干饲料克释放的无机磷总量作为饲料有效磷的总量值，有效磷占总磷的百分比为磷的消化率。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种饲料中有效磷含量的仿生消化测定方法，采用单胃动物仿生消化系统运行模拟消化过程，其特征在于，包括以下步骤：
1)样品处理：样品采集后将样品粉碎至过孔径0.30mm试验筛；
2)胃模拟消化：饲料样品置于玻璃模拟消化管中，取胃缓冲液和模拟胃液加入消化管中，将消化管安装在带有搅拌电机的单胃动物方式消化系统的立式模块上，将立式专用模块架置于单胃动物仿生消化系统中，设定相应参数进行胃模拟消化；
3)小肠模拟消化：胃模拟消化结束时，小肠缓冲液注入消化管中，然后通过蠕动泵将自动入模拟消化管中，设定小肠阶段模拟消化的参数进行小肠消化；
4)消化残渣的处理：消化结束后，将玻璃消化管内的消化液用水冲洗干净无损失地转移到容量瓶中，用水准确定容至刻度，摇匀备用，取消化液与三氯乙酸以6:4比例混合后静置10min，离心10min，上清液备用；同样方法制备样品空白上清液；
5)制作磷含量标准曲线；
6)消化液中磷含量测定，移取上清液至试管中，加入钒钼酸铵显色剂摇匀，室温下放置10min，用比色皿在波长415nm处测定吸光值；准确移取样品空白上清液至试管中，加入钒钼酸铵显色剂，摇匀，室温下放置10min，用比色皿在波长415nm处测定吸光值；
7)实验管OD415值与空白管OD415值之差，代入标准曲线中计算无机磷浓度；
8)计算有效磷含量X1，
有效磷含量
式中：
X1为有效磷含量，％；
a为标准曲线回归系数；
b为标准曲线回归常数；
OD1—测定管的吸光度值；
OD2—无饲料空白管的吸光度值；
m—饲料样品重量(g)；
DM为饲料样品的干物质含量；
9)磷的消化率
X1—有效磷含量(％)；
X—饲料中总磷含量(％)。
P—磷的消化率。
胃阶段模拟消化的参数为：温度39℃，蠕动泵转速188rpm/min，消化时间4h；小肠阶段模拟消化的参数为：温度39℃，蠕动泵转速188rpm/min，小肠消化时间为16h。
所述胃缓冲液的配制方法为：称取14.705g二水合柠檬酸三钠，2.59g氯化钠，0.25g氯化钾放入500mL烧杯中，加入400ml去离子水溶解，并用6mol/L盐酸或氢氧化钠在39℃下调节溶液的pH至2.50，冷却后转入500mL容量瓶，并用去离子水定容；所述小肠缓冲液为：称取18.165gTris，2.6g氢氧化钠放入500ml烧杯中，加去离子水溶解，转入500ml容量瓶并定容至刻度；模拟胃液：称取147.5KU的胃蛋白酶溶解于100ml pH 2.50的胃缓冲液中，缓慢搅拌30min；模拟小肠液为：称取猪液素0.81g溶解于20ml去离子水中，磁力搅拌溶解30min，作为模拟肠液。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行进一步说明。
实施例1
1样品采集
按GB/T 14699.1进行采样。
2样品处理
将采样的样品用四分法分至200g左右，用植物粉碎机或研钵将样品粉碎至过孔径0.30mm试验筛(60目)，封入样品袋密封存放，作为试样。
磷标准液(50.0mmol/L)：称取0.3402g在105℃烘至恒重的磷酸二氢钾于50ml容量瓶中，用去离子水溶解，并定容至刻度，浓度为50.0mmol/L。
钼酸铵溶液，100g/L：10g钼酸铵[(NH4)5Mo7O24·4H2O]于烧杯中加水溶解，必要时可微加热，转移至100ml容量瓶中，加入1.0ml氨水(25％)用水定容至刻度，避光保存。
偏矾酸铵溶液，2.35g/L：0.235g偏矾酸铵(VH4VO3)于烧杯中，加入2ml硝酸溶液(1.8)及少量水，用玻璃棒研磨溶解，转移至100ml棕色容量瓶中，用水定容至刻度，避光保存。
反应显色液：2份硝酸溶液，1份钼酸铵溶液，1份偏矾酸铵溶液混合后使用，临用前配制。
胃缓冲液(pH 2.50)：称取14.705g二水合柠檬酸三钠，2.59g氯化钠，0.25g氯化钾放入500mL烧杯中，加入400ml去离子水溶解，并用6mol/L盐酸或氢氧化钠在39℃下调节溶液的pH至2.50。冷却后转入500mL容量瓶，并用去离子水定容。
小肠缓冲液：称取18.165gTris，2.6g氢氧化钠放入500ml烧杯中，加去离子水溶解，转入500ml容量瓶并定容至刻度。
模拟胃液(胃蛋白酶活性737.5U/ml)：根据KLANS/X 1001-2010描述的胃蛋白酶活性测定方法，测定胃蛋白酶中胃蛋白酶的活性。然后，根据模拟胃液中胃蛋白酶的浓度为737.5U/ml，称取147.5KU的胃蛋白酶(0.2625g,Sigma P7000)溶解于100ml pH 2.50的胃缓冲液中，缓慢搅拌30min。勿在加热板上加热模拟胃液，或配制时过热。临用前配制。
模拟小肠液：称取猪液素(Sigma P-1750)0.81g溶解于20ml去离子水中，磁力搅拌溶解30min，作为模拟肠液。临用前配制。
3.测定步骤
3.1准备与上样
3.1.1用1000mL去离子水代替胃缓冲液、小肠前段缓冲液、小肠后段缓冲液放入单胃动物仿生消化系统的相应位置，并将系统的管道与缓冲液瓶连接好。
3.1.2在控制软件中，设置单胃动物仿生消化系统的预热时间为60min。待所有消化阶段的参数输入完毕后，运行模拟消化过程。
3.1.3在单胃动物仿生消化系统预热期间，进行下述上样工作。
3.1.4称取0.5g饲料样品置于玻璃模拟消化管中。同步测定样品的干物质含量。
3.2模拟猪胃肠道消化
3.2.1胃模拟消化
3.2.1.1分别量取6ml胃缓冲液和4ml模拟胃液加入消化管中。
3.2.1.2将消化管安装在带有搅拌电机的单胃动物方式消化系统的立式模块上。
3.2.1.3将立式专用模块架置于单胃动物仿生消化系统中，按照模拟消化器下端进水，上端出水的原则，接好管路。每组5根模拟消化器间串联连接。消化液加液管与系统依次以快速接头相连，将电机的插头与电源相连接。
3.2.1.4在单胃动物仿生消化系统控制软件中，胃阶段模拟消化的参数为：温度39℃，蠕动泵转速188rpm/min，消化时间4h。其他控制参数按仪器说明书操作。
3.2.2小肠模拟消化
3.2.2.1在胃模拟消化结束时，6ml小肠缓冲液通过SDS-3的3蠕动泵自动注入消化管中，然后通过4号蠕动泵将1.6ml模拟小肠液自动入模拟消化管中。
3.2.2.2在单胃动物仿生消化系统控制软件中，小肠阶段模拟消化的参数为：温度39℃，蠕动泵转速188rpm/min，小肠消化时间为16h。其他控制参数按仪器说明书操作。
3.3消化残渣的处理
3.3.1消化结束后，将玻璃消化管内的消化液用水冲洗干净无损失地转移到100ml容量瓶中，用水准确定容至刻度，摇匀备用。
3.3.2将容量瓶中消化液，从容量瓶中取消化液，与0.4mol/L三氯乙酸以6:4比例混合后静置10min，8000rpm离心10min，上清液备用。
3.3.3样品空白：模拟消化过程中，不上饲料样品，缓冲液与消化液添加剂量与实验管相同，添加时间与实验管相同。从容量瓶中取空白消化液与0.4mol/L三氯乙酸以6:4比例混合后静置10min，8000rpm离心10min，上清液备用。
3.4磷含量标准曲线的制作
3.4.1按下表比例用去离子水将磷标准液稀释成不同浓度梯度溶液。取0.2ml稀释液至试管中，加入5.8ml去离子水，再加入4mL显色剂，摇匀后静置10min，在415nm测定OD值。
以序号为1、2、3、4所测得吸光度值减去序号为0所测得吸光度值为横坐标，无机磷浓度(单位mmol/L)为纵坐标，绘制标准曲线。
3.5消化液中磷含量测定
3.5.1准确移取上清液6ml至试管中，加入4mL钒钼酸铵显色剂，摇匀，室温下放置10min，用1cm比色皿在波长415nm处测定吸光值。
3.5.2准确移取样品空白上清液6ml至试管中，加入4mL钒钼酸铵显色剂，摇匀，室温下放置10min，用1cm比色皿在波长415nm处测定吸光值。
3.5.3实验管OD415值与空白管OD415值之差，代入标准曲线中计算无机磷浓度。
3.6饲料中总磷的测定
采用GB/T6437-2002方法，得到以质量分数表示的磷含量(％)。
4结果计算
4.1计算公式
4.1.1有效磷含量X1
有效磷含量
式中：
X1为有效磷含量，％；
a为标准曲线回归系数；
b为标准曲线回归常数；
OD1—测定管的吸光度值；
OD2—无饲料空白管的吸光度值；
m—饲料样品重量(g)；
DM为饲料样品的干物质含量。
4.1.2磷的消化率
X1—有效磷含量(％)；
X—饲料中总磷含量(％)。
P—磷的消化率。
4.2重复性
每试样称取4个平行样进行测定，取平均值为分析结果。
允许相对标准偏差≤2％。

Claims (3)

1.一种饲料中有效磷含量的仿生消化测定方法，采用单胃动物仿生消化系统运行模拟消化过程，其特征在于，包括以下步骤：
1)样品处理：样品采集后将样品粉碎至过孔径0.30mm试验筛；
2)胃模拟消化：饲料样品置于玻璃模拟消化管中，取胃缓冲液和模拟胃液加入消化管中，将消化管安装在带有搅拌电机的单胃动物方式消化系统的立式模块上，将立式专用模块架置于单胃动物仿生消化系统中，设定相应参数进行胃模拟消化；
3)小肠模拟消化：胃模拟消化结束时，小肠缓冲液注入消化管中，然后通过蠕动泵将自动入模拟消化管中，设定小肠阶段模拟消化的参数进行小肠消化；
4)消化残渣的处理：消化结束后，将玻璃消化管内的消化液用水冲洗干净无损失地转移到容量瓶中，用水准确定容至刻度，摇匀备用，取消化液与三氯乙酸以6:4比例混合后静置10min，离心10min，上清液备用；同样方法制备样品空白上清液；
5)制作磷含量标准曲线；
6)消化液中磷含量测定，移取上清液至试管中，加入钒钼酸铵显色剂摇匀，室温下放置10min，用比色皿在波长415nm处测定吸光值；准确移取样品空白上清液至试管中，加入钒钼酸铵显色剂，摇匀，室温下放置10min，用比色皿在波长415nm处测定吸光值；
7)实验管OD415值与空白管OD415值之差，代入标准曲线中计算无机磷浓度；
8)计算有效磷含量X1，
有效磷含量
式中：
X1为有效磷含量，％；
a为标准曲线回归系数；
b为标准曲线回归常数；
OD1—测定管的吸光度值；
OD2—无饲料空白管的吸光度值；
m—饲料样品重量(g)；
DM为饲料样品的干物质含量；
9)磷的消化率
<mrow> <mi>P</mi> <mrow> <mo>(</mo> <mi>%</mi> <mo>)</mo> </mrow> <mo>=</mo> <mfrac> <mrow> <mi>X</mi> <mn>1</mn> </mrow> <mi>X</mi> </mfrac> </mrow>
X1—有效磷含量(％)；
X—饲料中总磷含量(％)；
P—磷的消化率。
2.根据权利要求1所述的一种饲料中有效磷含量的仿生消化测定方法，其特征在于，阶段模拟消化的参数为：温度39℃，蠕动泵转速188rpm/min，消化时间4h；小肠阶段模拟消化的参数为：温度39℃，蠕动泵转速188rpm/min，小肠消化时间为16h。
3.根据权利要求1所述的一种饲料中有效磷含量的仿生消化测定方法，其特征在于，所述胃缓冲液的配制方法为：称取14.705g二水合柠檬酸三钠，2.59g氯化钠，0.25g氯化钾放入500mL烧杯中，加入400ml去离子水溶解，并用6mol/L盐酸或氢氧化钠在39℃下调节溶液的pH至2.50，冷却后转入500mL容量瓶，并用去离子水定容；所述小肠缓冲液为：称取18.165gTris，2.6g氢氧化钠放入500ml烧杯中，加去离子水溶解，转入500ml容量瓶并定容至刻度；模拟胃液：称取147.5KU的胃蛋白酶溶解于100ml pH 2.50的胃缓冲液中，缓慢搅拌30min；模拟小肠液为：称取猪液素0.81g溶解于20ml去离子水中，磁力搅拌溶解30min，作为模拟肠液。
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