CN103897049A - 一种聚合草叶蛋白的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种聚合草叶蛋白的提取方法，先用稀碱溶液使蛋白质溶解，分离出去不溶性高分子成分。再用酸调到等电点使蛋白质沉淀下来，除去非酸沉性可溶成分，进行洗涤，调pH值至中性，经均质，冷冻干燥等工艺制备成纯度较高的蛋白质。结果表明：该方法效果较好，蛋白提取率高达63.42％。最佳提取条件是：NaOH溶液浓度为0.15mol/L，固液比为1∶40，浸提时间为100min，浸提温度为60℃，提取率达63.42％。同时调节pH值在2.55～3.51之间沉淀聚合草中粗蛋白的效果最佳。

Description

一种聚合草叶蛋白的提取方法

技术领域

本发明属于农业技术领域，涉及一种聚合草叶蛋白的提取方法。

背景技术

叶蛋白是从绿色植物的新鲜茎叶直接提取出来的蛋白质制品，是一种无毒无害的天然高级营养品，其产品的蛋白质含量在50％-80％之间。叶蛋白富含18中氨基酸，其中8种人体必需氨基酸的含量较高，是优良的蛋白质饲料，国内外大量动物饲喂实验结果表明，叶蛋白完全可以代替豆粕和鱼粉。此外，叶蛋白的制品中叶黄素的含量高达1000mg/kg-1300mg/kg。而叶黄素是禽、肉、皮、蛋黄的天然着色剂，在养禽业生产中意义重大。在国际市场上，叶蛋白中叶黄素的价格比叶蛋白中蛋白质的价格高出50％。叶蛋白制品还含有糖、脂肪、多种维生素、胡萝卜素、及铁、镁、钙、锌、铜等矿物质元素，这些营养成分具有防病、治病、强身健体、防衰老等多种生理功能，是优良的添加剂。叶蛋白进入膳食结构后，将会降低胆固醇对身体的危害，符合食物结构回归大自然的发展趋势。无论对于饲料，还是对于食品或药品都有极其广阔的市场于效益空间，是一个极具开发价值的新兴产业。

聚合草产量大，易于存活和栽培，成本低廉，又称神奇草，还有许多生物学功能，可以用于治疗皮肤病、胃溃疡、便秘综合症、呼吸系统疾病等疾病，富含蛋白质，经氨基酸组分分析，聚合草蛋白质由18种氨基酸组成。其中，必需氨基酸8种，非必需氨基酸10种，氨基酸种类齐全，且必需氨基酸占总氨基酸含量的39.5％，高于淮山药蛋白。具有很高的营养价值，是制备植物叶蛋白的优良植物原料，也是制备生物活性肽的良好蛋白来源。现有技术中关于聚合草叶蛋白的提取方法尚未发现有关报道。

发明内容

本发明的目的在于克服上述技术存在的缺陷，提供一种聚合草叶蛋白的提取方法，将对本地产的聚合草的基本营养成分进行测定，然后采用“碱溶酸沉”原理，通过对影响蛋白质提取率的料液比、浸提温度、浸提时间及浸提液pH值进行单因素试验，采用L9(34)正交试验对聚合草叶蛋白的提取工艺条件进行优选，并对聚合草蛋白的氨基酸组成进行分析和氨基酸评分，以便为聚合草的深度和综合开发利用提供数据支持，并为聚合草生物活性肽的制备奠定基础。其具体技术方案为：

一种聚合草叶蛋白的提取方法，包括以下步骤：

(1)；试验选取聚合草的茎和叶，用蒸馏水进行清洗，洗涤后经37℃恒温烘干，经研磨进行粉碎；

(2)按照固液比为1∶40(g/mL)比加入浓度为0.1～0.15mol/L的NaOH溶液在为60℃下浸提100min；

(3)在5000r/min下低温离心，离心后取上清液调pH2.55～3.51之间，至聚合草蛋白质等电点进行蛋白质沉淀，再次在5000r/min下低温离心取沉淀，沉淀经低温冷冻干燥得蛋白质。

优选地，所述pH值应控制在2.55～3.51之间。

优选地，所述NaOH溶液浓0.1～0.15mol/L。

优选地，所述聚合草粗蛋白的固液比为1∶40(g/mL)。

优选地，所述聚合草粗蛋白的浸提温度为60℃。

优选地，所述聚合草粗蛋白的浸提时间为100min。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

聚合草是优良的叶蛋白和膳食纤维提取原料，可作优质蛋白源，传统的“碱溶酸沉”法提取聚合草叶蛋白，设备、工艺简单可行，适应工业化生产的需求。

附图说明

图1为定氮蒸馏装置图。

图2为聚合草粗蛋白等电点的确定。

图3为NaOH溶液浓度对粗蛋白提取率的影响。

图4为固液比对粗蛋白提取率的影响。

图5为浸提温度对粗蛋白提取率的影响。

图6为浸提时间对粗蛋白提取率的影响。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

材料与方法

材料

聚合草采自山西农业大学家属院，将鲜草洗净，经60℃恒温箱烘干后粉碎。

主要仪器与设备

酸度计(PHS-3C)，上海虹益仪器仪表有限公司；旋涡震荡仪，上海精科实业有限公司；冰箱(BCD-183)，中国重庆五洲实业公司；台式高速冷冻离心机，上海力中科学仪器有限公司；数显恒温水浴锅(HH-4)，金坛市科析仪器有限公司；可见风光光度计(WFJ2100)，龙尼柯(上海)仪器有限公司；电子天平(BS224S)，北京赛多利斯仪器系统有限公司；以及凯式定氮装置、氨基酸自动分析仪、真空泵、马福炉、索氏提取器、恒温干燥箱，DF205电热鼓风干燥箱等仪器设备。

主要生化试剂和溶液配置

试剂

本研究所使用的试剂均为分析纯，主要有盐酸、氢氧化钠、氯化钠、乙醇(95％)、磷酸、考马氏亮蓝G-250、硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸、硼酸、无水乙醚、石油醚、丙酮、重铬酸钾、蛋白酶、苯酚、柠檬酸钠、茚三酮、乙酸锂、二甲基亚铜、TRIS(三羟甲基氨基甲烷)、MES：2-(N-吗啉代)乙烷磺酸等。

溶液

热稳定α-淀粉酶溶液：于0℃-5℃冰箱储存；

蛋白酶：用MES-TRIS缓冲液配成浓度为50mg/ml的蛋白酶溶液，现用现配，于0℃-5℃储存；

淀粉葡萄糖苷酶溶液：于0℃-5℃储存；

酸洗硅藻土：取200g硅藻土于600ml的2mol/L盐酸中，浸泡过夜，过滤，用蒸馏水洗至滤液为中性，置于525℃±5℃马福炉中灼烧灰分后备用；

0.05mol/L MES-TRIS缓冲液：称取19.52gMES和12.2gTRIS，用1.7L蒸馏水溶解，用6mol/L氢氧化钠调PH至8.2，加水稀释至2L；

3mol/L乙酸溶液：取172ml乙酸，加入700ml水，混匀后用水定容至1L；

0.4g/L溴甲酚绿溶液：称取0.1g溴甲酚绿于研钵中，加入1.4ml0.1mol/L氢氧化钠研磨，加少许水继续研磨，直至完全溶解，用水稀释至250ml。

考马斯亮兰G-250蛋白显色液：称100mg考马斯亮兰G-250，溶于50ml95％的乙醇后，再加入120ml85％的磷酸，用水稀释至1升。

方法

聚合草干叶中蛋白质含量的测定

参照GB5009.5-2010第一法凯氏定氮法测定^[12]。其原理为食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵。碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质的含量。

试样处理

称取充分混匀的聚合草干叶0.2g～2g(约相当于30mg～40mg氮)，精确至0.001g，移入干燥的100mL、250mL或500mL定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜、6g硫酸钾及20mL硫酸，轻摇后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45°角斜支于有小孔的石棉网上。小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色并澄清透明后，再继续加热0.5h～1h。取下放冷，小心加入20mL水。放冷后，移入100mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。同时做试剂空白试验。

测定

按图1装好定氮蒸馏装置，向水蒸气发生器内装水至2/3处，加入数粒玻璃珠，加甲基红乙醇溶液数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加热煮沸水蒸气发生器内的水并保持沸腾。向接收瓶内加入10.0mL硼酸溶液及1滴～2滴混合指示液，并使冷凝管的下端插入液面下，根据试样中氮含量，准确吸取2.0mL～10.0mL试样处理液由小玻杯注入反应室，以10mL水洗涤小玻杯并使之流入反应室内，随后塞紧棒状玻塞。将10.0mL氢氧化钠溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其缓缓流入反应室，立即将玻塞盖紧，并加水于小玻杯以防漏气。夹紧螺旋夹，开始蒸馏。蒸馏10min后移动蒸馏液接收瓶，液面离开冷凝管下端，再蒸馏1min。然后用少量水冲洗冷凝管下端外部，取下蒸馏液接收瓶。以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定至终点，其中2份甲基红乙醇溶液与1份亚甲基蓝乙醇溶液指示剂，颜色由紫红色变成灰色，pH5.4；1份甲基红乙醇溶液与5份溴甲酚绿乙醇溶液指示剂，颜色由酒红色变成绿色，pH5.1。同时作试剂空白。

结果计算

聚合草干叶中的蛋白质的含量按式(1)进行计算。

$X=\frac{(V\underset{\‾}{1}-V2)\×c\×0.0140}{m\×V3/100}\×F\×100$

式(1)中：

X——试样中蛋白质的含量，单位为克每百克(g/100g)；

V1——试液消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，单位为毫升(mL)；

V2——试剂空白消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，单位为毫升(mL)；

V3——吸取消化液的体积，单位为毫升(mL)；

c——硫酸或盐酸标准滴定溶液浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；

0.0140——1.0mL硫酸[c(1/2H₂SO₄)＝1.000mol/L]或盐酸[c(HCI)＝1.000mol/L]标准滴定溶液相当的氮的质量，单位为克(g)；

m——试样的质量，单位为克(g)；

F——氮换算为蛋白质的系数。聚合草干叶按照一般食物的6.25计算。

总膳食纤维测定

总膳食纤维参照GB/T5009.88-2008酶-重量法测定^[13]。其原理为取干燥试样，经蛋白酶和葡萄糖苷酶酶解消化，去除蛋白质和淀粉，酶解后样液用乙醇沉淀、过滤，残渣用乙醇和丙酮洗涤，干燥后物质称重即为总膳食纤维残渣。本法测定的膳食纤维是指不能被α-淀粉酶、蛋白酶和葡萄糖苷酶酶解消化的碳水化合物聚合物，包括纤维素、半纤维素、木质素、果胶、部分回生淀粉、果聚糖及美拉德反应产物等。

酶解

称取双份样品(m₁和m₂)1.0000g于400mL高脚烧杯中，加入pH8.2的MES-TRIS缓冲液40mL，用磁力搅拌使聚合草干叶粉完全分散在缓冲液中。加入50μL热稳定α-淀粉酶溶液缓慢搅拌，然后用铝箔将烧杯盖住，置于95～100℃的恒温振荡水浴中持续振摇，当温度升至95℃开始计时，反应持续35min。将烧杯从水浴中移出，冷却至60℃，打开铝箔盖，用刮勺将烧杯内壁的环状物以及烧杯底部的胶状物刮下，用10mL蒸馏水冲洗烧杯壁和刮勺。在每个烧杯中加入50mg/mL的蛋白酶液100μL，盖上铝箔，继续水浴振荡，60℃开始计时，反应持续30min。酶解结束后，边搅拌边加入3mol/L乙酸溶液5mL，溶液60℃时，以溴甲酚绿为外指示剂，调节pH约4.5.边搅拌边加入100μL淀粉葡萄糖苷酶溶液，盖上铝箔，持续振荡，水温到60℃时开始计时，在60℃±1℃条件下反应30min。

总膳食纤维的测定

沉淀：在每份试样中，加入预热至60℃的95％乙醇225ml(预热以后的体积)，乙醇与样液的体积比为4∶1，取出烧杯，盖上铝箔，室温下沉淀1h。

过滤：用78％乙醇15ml将称重过的坩埚中的硅藻土润湿并铺平，抽滤去除乙醇溶液，使坩埚中硅藻土在烧结玻璃滤板上形成平面。乙醇沉淀处理后的样品酶解液倒入坩埚中过滤，用刮勺和78％乙醇将所有残渣转至坩埚中。

洗涤：分别用78％乙醇，95％乙醇和丙酮15ml洗涤残渣各2次，抽滤去除洗涤液后，将坩埚连同残渣在105℃烘干过夜。将坩埚置于燥器中冷却1h，称重(包括坩埚，膳食纤维残渣和硅藻土)，精确至0.1mg。减去坩埚和硅藻土的干重，计算残渣质量。

蛋白质和灰分的测定：称重后的试样残渣，分别按GB/T5009.5的规定测定氮(N)，以N×6.25为换算系数，计算蛋白质质量：按GB/T5009.4测定灰分，即在525℃灰化5h，于干燥器中冷却，精确称量坩埚总质量(精确至0.1mg)，减去坩埚和硅藻土质量，计算灰分质量。

结果计算

空白的质量按式(2)计算

$\mathrm{mB}=\frac{\mathrm{mBR}!+\mathrm{mBR}2}{2}-\mathrm{mpB}-\mathrm{mAB}$

式(2)中：

mB：空白的质量，单位为毫克(mg)；

mBR1和mBR2：双份空白测定的残渣质量，单位为毫克(mg)

mpB：残渣中蛋白质质量，单位为毫克(mg)

mAB：残渣中灰分质量，单位为毫克(mg)

总膳食纤维含量按式(3)计算

$X=\frac{[(\mathrm{mR}1+\mathrm{mR}2)/2-\mathrm{mp}-\mathrm{mA}-\mathrm{mB}}{(m1+m2)/2}\×100$

式(3)中：

X：总膳食纤维的含量，单位为克每百克(g/100g)

mR1和mR2：双份试样残渣的质量，单位为毫克(mg)

mp：试样残渣中蛋白质质量，单位为毫克(mg)

mA：试样残渣中灰分的质量，单位为毫克(mg)

mB：空白的质量，单位为毫克(mg)

m1和m2：试样的质量，单位为毫克(mg)

其他基本成分的测定

脂肪

脂肪参照GB/T5009.6-2003第一法索氏抽提法测定^[14]。其原理为试样用无水乙醚等溶剂抽提后，蒸去溶剂所得的物质即为粗脂肪，因为除脂肪外还含色素及挥发性油、蜡、树脂等物质，抽提法所测得的脂肪为游离脂肪。

碳水化合物

碳水化合物采用计算法，公式如下：

碳水化合物(％)＝100-(蛋白质+脂肪+水分+灰分+膳食纤维)

灰分

灰分采用GB5009.4-2010灼烧法测定^[15]，本标准适用于除淀粉及其衍生物之外的食品中灰分含量的测定，其原理为食品经灼烧后所残留的无机物质称为灰分，灰分数值系用灼烧，称重后计算得出。

水分

水分采用GB5009.3-2010第一法直接干燥法测定^[16]。利用食品中水分的物理性质，在101.3kPa(一个大气压)，温度101℃～105℃下采用挥发方法测定样品中干燥减失的重量，包括吸湿水、部分结晶水和该条件下能挥发的物质，再通过干燥前后的称量数值计算出水分的含量。

聚合草粗蛋白提取

聚合草粗蛋白提取工艺流程

试验选取聚合草的茎和叶，用蒸馏水进行清洗，洗涤后经37℃恒温烘干，经研磨进行粉碎，按照料液比加入一定浓度的NaOH溶液在一定的温度下浸提，浸提一定时间后在5000r/min下低温离心，离心后取上清液调pH至聚合草蛋白质等电点进行蛋白质沉淀，再次在5000r/min下低温离心取沉淀，沉淀经低温冷冻干燥得蛋白质。

溶液中粗蛋白测定方法

吸取0.1mL离心上清液，进行100倍稀释，加入5mL考马氏亮蓝G-250染色剂，充分振荡混匀，静置5min后在595nm的波长下测定吸光值。考马氏亮蓝G-250染色法原理是考马氏亮蓝G-250具有红色和青色两种色调、在酸性溶液中游离状度下为棕红色，当它通过疏水作用与蛋白质结合后，变成蓝色，最大吸收波长从465nm转移到595nm处，在一定的范围内，蛋白质含量与595nm的吸光度成正比，测定595nm处光密度值的增加即可进行蛋白质的定量。

聚合草粗蛋白等电点的测定

称取5g样品，料液比为1∶40，用NaOH调pH值至10。温度30℃下搅拌浸提1h。离心(5000r/min，20min)后分别取提取液10mL装入8支离心管中，用HCL调节各个离心管的pH值，使得1～8个离心管中的pH值依次递增，静置10min后离心，干燥称重，得到各个离心管中的粗蛋白沉淀量，根据沉淀量多少确定其最适pH值。

蛋白质提取率的测定和计算

参见Bradford^[17]方法，配制考马斯亮兰G-250蛋白显色液，其组成为：0.01％(w/v)考马斯亮兰G-250，4.7％(w/v)乙醇，8.5％(w/v)磷酸。以牛血清白蛋白为标准蛋白作标准曲线，取待分析的蛋白溶液0.1mL进行10倍稀释再加入5.0mL考马斯亮兰G-250显色液，漩涡振荡混合，放置5min后，用分光光度计测其吸光度值，根据标准曲线即知待分析蛋白液中蛋白的浓度。

单因素试验

NaOH溶液浓度对聚合草粗蛋白提取率的影响

选取浸提温度为30℃，固液比为1∶40，NaOH溶液浓度(mol/L)分别设为：0.1、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35，混匀后提取60min，离心后取0.1mL上清液稀释100倍测定595nm下吸光值，并计算蛋白质含量。

固液比对聚合草粗蛋白提取率的影响

分别选取固液比为1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70，震荡提取60min，温度和NaOH溶液浓度分别为30℃和0.12mol/L，离心后取0.1mL上清液稀释100倍测定595nm下吸光值，并计算蛋白质含量。

浸提温度对聚合草中粗蛋白提取率的影响

选取固液比为1∶40，NaOH溶液浓度为0.12mol/L，分别在30℃、40℃、50℃、60℃和70℃下浸提时间60min，离心后取0.1mL上清液稀释100倍测定595nm下吸光值，并计算蛋白质含量。

浸提时间对聚合草中粗蛋白提取率的影响

选取浸提温度为60℃，固液比为1∶40，NaOH溶液浓度为0.12mol/L条件下混匀后浸提20min、40min、60min、80min、100min和120min，离心后取0.1mL上清液稀释100倍测定595nm下吸光值，并计算蛋白质含量。

正交试验设计

为了优化提取条件，在单因素分析的基础上，以表中所列的影响蛋白质提取率的pH等为因素进行L9(3⁴)正交试验。

表1 正交试验因素表

Table1 Factors of orthogonal design

结果与分析

聚合草干叶蛋白质含量

目前高蛋白质植物最为显著的是苜蓿，文李玲、杜小琴测得的苜蓿草粉中的蛋白质含量为16％^[21]本研究经测定，聚合草干叶中的蛋白质含量为24.3％，因此可见聚合草的蛋白质含量高于苜蓿的蛋白质含量。由此可见，聚合草是优良的植物蛋白来源，建立可行高效的蛋白提取工艺，对其中的蛋白质进行提取。

聚合草干叶总膳食纤维含量

经测定和计算，聚合草干叶中的总膳食纤维含量为29.52％，高于蛋白质。国家标准GB/T5009.88-2008定义膳食纤维(dietary fiber)是指植物的可食部分，不能被人体小肠消化吸收，对人体有健康意义，聚合度(degree of polymerization)≥3的碳水化合物和木质素，包括纤维素、半纤维素、果胶、菊粉等。

聚合草干叶中其他基本成分含量

表2 聚合草干草中各组分含量(％)

Table2 The content of each component of Symphytum officinal Linn(％)

由表2和前面实验结果可知，聚合草干草中各营养成分的含量(％)，其中总膳食纤维含量最多，其次是蛋白质，脂肪含量最低。

聚合草叶蛋白的提取

聚合草粗蛋白的等电点及沉淀最适pH值的确定

由图2可知，pH在2.55～3.51之间聚合草粗蛋白的沉淀量在增加，pH在3.51时，沉淀量最大，因此聚合草粗蛋白的等电点(pI)是3.51。此后随着pH的增大沉淀量逐渐减少，pH值达到5.59时沉淀量最少；且pH值从4.18到5.59之间沉淀量减少最快。所以调节pH值沉淀聚合草粗蛋白时，pH值应控制在2.55～3.51之间。

单因素试验分析

NaOH溶液浓度对聚合草粗蛋白提取率的影响

由图3可知聚合草粗蛋白提取率的总趋势是随着NaOH溶液浓度增大而降低，主要原因是聚合草的氨基酸组分中酸性氨基酸含量居多。NaOH浓度为0.1mol/L到0.2mol/L之间时，蛋白提取率缓慢下降，而后出现一个小波峰，紧接着快速下降。由于高碱浓度下会导致蛋白质的变性和水解，美拉德反应加剧，产生黑褐色物质，提取物中非蛋白物质增加^[22]。所以选择NaOH溶液浓0.1～0.15mol/L提取效果较好。

固液比对聚合草粗蛋白提取率的影响

图4结果表明，聚合草粗蛋白的提取率在1∶40以下时随着固液比的增加，叶蛋白的提取率也随着增加，当固液比大于40(g/mL)时呈下降趋势。因而确定提取聚合草粗蛋白的固液比为1∶40(g/mL)。

浸提温度对聚合草中粗蛋白提取率的影响

从图5可见，粗蛋白提取率随温度的升高而增加；当提取温度达到70℃时，提取液的颜色变成了墨绿色，是因为提取温度过高时，可能会把非蛋白物质提取出来，且可能会使蛋白质变性，影响其活性。所以，确定聚合草粗蛋白的浸提温度为60℃。

浸提时间对聚合草中粗蛋白提取率的影响

由图6可知，浸提时间在80min以内时，提取率随着浸提时间的延长而降低，但是当浸提时间再延长时，提取率增加到100min达到波峰，而后又出现下降。因此100min为聚合草粗蛋白的最佳浸提时间。

正交试验结果分析

在单因素实验的基础上，为获得最佳提取工艺条件，进行了4因素3水平的L₉(3⁴)正交试验，正交试验结果及极差分析见表3。

表3 正交分析试验

Table3 Orthogonal experiment analysis

极差分析结果表明，对提取效果的影响因素主次顺序依次为：A＞C＞B＞D，即NaOH溶液浓度对聚合草粗蛋白的提取率影响最大，其次是浸提温度，再是固液比，浸提时间的影响最小。从表3可以直观地辨别影响聚合草粗蛋白的最佳提取工艺组合为A₃C₂B₁D₂，即NaOH溶液浓度为0.15mol/L，固液比为1∶40，浸提时间为100min，浸提温度为60℃。按此优化条件进行重复试验验证，聚合草粗蛋白的提取率为63.42％，高于组合7(A₃C₂B₁D₃)时的提取率47.06％，这两个工艺唯一不同点是提取的时间，可见在其他条件都一致的情况下，浸提100min的提取率反而要高于浸提120min时的提取率，不仅提高了提取效率，还节约了生产成本。究其原因，可能是由于时间越长，蛋白质在碱溶液中的水解会增加。

Claims (6)

1.一种聚合草叶蛋白的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)；试验选取聚合草的茎和叶，用蒸馏水进行清洗，洗涤后经37℃恒温烘干，经研磨进行粉碎；

(2)按照固液比为1∶40(g/mL)比加入浓度为0.1～0.15mol/L的NaOH溶液在为60℃下浸提100min；

(3)在5000r/min下低温离心，离心后取上清液调pH2.55～3.51之间，至聚合草蛋白质等电点进行蛋白质沉淀，再次在5000r/min下低温离心取沉淀，沉淀经低温冷冻干燥得蛋白质。

2.根据权利要求1所述的聚合草叶蛋白的提取方法，其特征在于，所述pH值应控制在2.55～3.51之间。

3.根据权利要求1所述的聚合草叶蛋白的提取方法，其特征在于，所述NaOH溶液浓0.1～0.15mol/L。

4.根据权利要求1所述的聚合草叶蛋白的提取方法，其特征在于，所述聚合草粗蛋白的固液比为1∶40(g/mL)。

5.根据权利要求1所述的聚合草叶蛋白的提取方法，其特征在于，所述聚合草粗蛋白的浸提温度为60℃。

6.根据权利要求1所述的聚合草叶蛋白的提取方法，其特征在于，所述聚合草粗蛋白的浸提时间为100min。

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