CN109498662A - 一种响应面法优化的罗汉松叶抗氧化成分的提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种响应面法优化的罗汉松叶抗氧化成分的提取方法，该方法包括如下步骤：a、称取罗汉松叶粉，加入超纯水按固定的料液比在不同温度、酶解时间、果胶酶的添加量下进行酶解浸提，通过单因素试验以及响应面法确定最佳配比；b、在单因素实验的基础上，以加酶量（A）、酶解时间（B）、酶解温度（C）为自变量，DPPH的清除率（Y）作为响应值，利用实验设计软件进行非线性回归的二次多项式模型拟合，c、根据回归方程得到响应面分析图，考察拟合之后的响应曲面形状，通过对响应面等值线的分析寻求最优工艺参数，并且通过对3D曲面图的分析，直观地评价各因素间的交互作用，最后得到最优工艺参数。

Description

一种响应面法优化的罗汉松叶抗氧化成分的提取方法
技术领域
本发明涉及一种植物成分提取方法，特别涉及一种响应面法优化的罗汉松叶抗氧化成分的提取方法。
背景技术
罗汉松，又名罗汉杉、土杉，学名Podocarpus macrophyllus(Thumb.)D.Don，裸子植物门罗汉松科的一属，为常绿乔木。近年来国内外学者对罗汉松药材的化学成分和药理作用[1]进行了许多研究，罗汉松属植物所含的双黄酮成分对抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、抗炎及对血液系统和神经系统的作用等方面显示了较好的活性。罗汉松种子提取物对人胃癌细胞MGC-803有明显的体外抑制作用，罗汉松实醇提物有降血脂、保肝及抗氧化的作用，罗汉松花托汁对实验动物没有明显的毒性反应。但关于罗汉松抗氧化成分的提取鲜有报道。
发明内容
为了进一步利用罗汉松的药用价值，本发明提供一种响应面法优化的罗汉松叶抗氧化成分的提取方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种响应面法优化的罗汉松叶抗氧化成分的提取方法，该方法包括如下步骤：
a、精确称取罗汉松叶粉，加入超纯水按固定的料液比在不同温度、酶解时间、果胶酶的添加量下进行酶解浸提，通过单因素试验以及响应面法确定最佳配比；
b、在单因素实验的基础上，由Design-Expert 8.0.6统计分析软件中的Box-Benhken试验设计，以加酶量(A)、酶解时间(B)、酶解温度(C)为自变量，DPPH的清除率(Y)作为响应值，建立三因素三水平的中心组合设计，利用实验设计软件进行非线性回归的二次多项式模型拟合，预测的模型如下：
Y＝53.57+1.96A+3.817B+7.3C+5.1AB-0.68AC+2.72BC-8.46A2-4.76B2-10.98C2
c、根据回归方程得到响应面分析图，考察拟合之后的响应曲面形状，分析所选定的三个变量对考察的响应值的影响；通过对响应面等值线的分析寻求最优工艺参数，并且通过对3D曲面图的分析，直观地评价各因素间的交互作用，最后得到最优工艺参数。
作为优选，酶解温度为48-52℃。
作为优选，所述料液比为1:20g/mL，果胶酶用量0.6g/L、酶解温度50℃、酶解时间2.5h。
作为优选，所述的统计分析软件为Design-Expert 8.0.6。
作为优选，所述的罗汉松叶粉是由新鲜罗汉松叶洗净后，杀青5-8min，于60±1℃下干燥，粉碎后得到。
本发明的有益效果是：本发明在单因素实验基础上，采用Box-Behnken响应面实验设计，根据Design-Expert 8.0.6软件进行分析，对果胶酶酶解提取罗汉松叶中抗氧化成分的工艺进行优化，建立了酶解法提取抗氧化成分的回归模型，由该模型优化的抗氧化成分提取的最佳工艺条件为：果胶酶用量0.6g/L、酶解温度50℃、酶解时间2.5h，对DPPH的清除率为43.7％。酶解液中主要的抗氧化成分黄酮的提取率为1.38％，多糖的提取率为6.52％。酶法提取罗汉松抗氧化成分，提取工艺简洁，提取条件温和，是一种合适的提取罗汉松抗氧化成分的方法。
附图说明
图1是料液比对DPPH清除率的影响曲线图；
图2是酶用量对DPPH清除率的影响曲线图；
图3是酶解时间对DPPH清除率的影响曲线图；
图4是酶解温度对DPPH清除率的影响曲线图；
图5是Y＝f(A,B)的响应面图和等高线图；
图6是Y＝f(A,C)的响应面图和等高线图；
图7是Y＝f(B,C)的响应面图和等高线图。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
材料与试剂
罗汉松叶于2018年5月采自本学院校园内，洗净后，杀青5min，于60℃下干燥，粉碎后储存备用。无水酒精、葡萄糖、浓硫酸、苯酚、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、碳酸氢钠均为国产分析纯：上海联试化工试剂有限公司；维生素C：天津博迪化工股份有限公司；芦丁：国药集团化学试剂有限公司。DPPH即1,1-二苯基-2-三硝基苯肼：东京化成工业株式会社；FeSO4·7H2O：江苏强盛功能化学股份有限公司；Na2SO4：兰溪中星化工试剂有限公司；果胶酶(酶活力≥50.0u/g)：国药集团化学试剂有限公司)。
仪器与设备
DK-S24型恒温水浴锅，上海森信实验仪器有限公司；UV-1800PC紫外可见分光光度计：上海色谱仪器有限公司；ATY224分析天平，日本岛津；电热恒温干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；JYS-MO1九阳磨粉机，九阳股份有限公司；Synergy UV超纯水仪、MerckMillipore(美国)。
实施例1
一、试验方法
1抗氧化成分提取
精确称取罗汉松叶样品5.000g，用超纯水在一定的料液比、加酶量和提取温度下浸提一定时间，经离心分离后，将所得溶液用超纯水稀释定容到一定体积，摇匀，得到样品溶液。
2抗氧化活性测定
用DPPH自由基清除法衡量样品的抗氧化性。罗汉松叶提取液的DPPH自由基清除测定参照秦嫚嫚等(秦嫚嫚,冯育林,邵崇钰,等DPPH法测定芒果叶中总黄酮提取物的抗氧化活性[J]..中药新药与临床药理,2014,25(2):185-188)的方法，并进行了修改。
准确称取25.8mg DPPH·，用70％乙醇溶解后定容于200mL容量瓶，作为储备液储藏在棕色瓶于4℃的冰箱中保存，用时取出。利用DPPH·溶液的紫红色，在加入抗氧化剂后颜色变淡来表示其对自由基的清除能力。取0.50mL样品溶液加入10.00mL DPPH·乙醇溶液，摇匀，37℃避光反应15min后，在523nm波长处测定其吸光度(以70％乙醇为空白调零白样对照用0.50mL超纯水代替样品溶液，重复测定3次，取平均值。根据下列)，空公式计算榨汁对DPPH·自由基的清除率：
DPPH·清除率(％)＝(A0－Ai)/A0×100％。
3黄酮含量的测定
黄酮含量的测定采用NaNO2-Al(NO3)3，比色法测黄酮。
4多糖含量的测定
多糖含量的测定采用苯酚-硫酸法。
二.单因素实验
1料液比
称取5.000g罗汉松叶粉末5份，分别加入超纯水50、100、150、200、250mL，pH为4.5，在40℃水浴浸提90min，离心分离得上清液，将上清液定容至250mL，料液比对DPPH清除率的影响见图1。由图1可知料液比为1:20(g/mL)时，对DPPH的清除率最大，故选择料液比为1:20(g/mL)。
2加酶量
称取5.000g罗汉松叶粉末6份，酶解时间为2h，酶解温度为40℃，料液比为(1:20g/mL)，pH为4.5，不同果胶酶量下提取液对DPPH清除率的影响见图2。由图2可见，在酶用量小于3g/L时，随着果胶酶量的增加对DPPH的清除率缓慢增大；当酶用量大于3g/L时，随着酶用量的增加，对DPPH的清除率显著增大。其原因是酶的用量不足，酶分子只与少数底物结合。在所试范围内加酶量为5g/L(即1L提取液中加5g果胶酶)时对DPPH的清除率最大，故选加酶量为5g/L。
3酶解时间
称取5.000g罗汉松叶粉末6份，果胶酶加量为5g/L，酶解温度为40℃，料液比1:20(g/mL)，pH为4.5，酶解时间对DPPH清除率的影响如图3所示，随着酶解时间的增加对DPPH的清除率增大，但随着时间的延长增加速度放缓，原因是罗汉松细胞结构已破坏，再增加酶解时间，对抗氧化成分释放影响不大，选择酶解时间为3h。
4酶解温度
称取5.000g罗汉松叶粉末5份，果胶酶加量为5g/L，料液比为1:20(g/mL)，酶解时间为3h，pH为4.5，不同酶解温度下提取液对DPPH的清除率影响见图4。由图4可知，对DPPH清除率在30～40℃呈增加趋势，这是因为温度高，浸提体系的粘度低，有助于胞内抗氧化成分向外扩散。但温度高于40℃随着温度的升高抗氧化性降低，因为酶催化具有最适温度，当温度高于最适温度，酶蛋白发生变性，酶活力降低，因此选择酶解温度为40℃。
根据单因素实验选择对抗氧化性影响大的三个因素及水平，结果见表1。
表1响应面的因素与水平
三、响应面实验设计
在单因素实验的基础上，选择对抗氧化活性影响较为显著的3个因素作为考察对象，即加酶量(A)、酶解时间(B)、酶解温度(C)为自变量，以DPPH的清除率(Y)为因变量(响应值)进行Box-Behnken中心组合设计，建立数学模型优化工艺条件。
由Design-Expert 8.0.6统计分析软件中的Box-Benhken试验设计，以加酶量(A)、酶解时间(B)、酶解温度(C)为自变量，对DPPH的清除率(Y)为因变量，建立三因素三水平的中心组合设计，设计15个试验方案，每个试验方案进行测定3次，取平均值，具体的试验方案及试验结果如表2所示。
表2 Box-Behnken设计方案及试验结果
通过Design Expert 8.0.6软件进行非线性回归的二次多项式模型拟合，预测的模型为：Y＝53.57+1.96A+3.817B+7.3C+5.1AB-0.68AC+2.72BC-8.46A2-4.76B2-10.98C2
根据表3方差分析结果，对方差分析进行显著性检验显示，该模型回归极显著(<0.0001)，失拟项不显著，计算结果表明该模型R2＝0.9954，说明该模型与实际生产结果拟合性很好。由表3中F值的大小可判断各因素对抗氧化成分的影响大小，F值越大，影响越强。对抗氧化成分影响大小顺序为：酶解温度>酶解时间>加酶量。
表3 DPPH清除率实验结果方差分析表
注：***差异极显著p＜0.0001；**差异高度显著p＜0.01；*差异显著p＜0.05
2.2.2响应曲面分析
响应面为响应值对两两交互因素所构成的三维空间曲线图，曲面的倾斜度表明该试验因素对响应值的影响程度，倾斜度越高，即坡度越陡峭，表明该试验因素对响应值Y的影响越显著。响应面等高线图可以直观地反映出两个因素间交互效应的强弱，等高线的形状越接近椭圆形，表示两个因素交互效应越强，而圆形则反之。如图5～7所示，对DPPH的清除率的影响AB、AC、BC之间的交互作用都很强。
验证实验
以罗汉松抗氧化成分对DPPH的清除率为最终考察指标，根据Design-Expert8.0.6软件所得回归方程的最优预测值求解，可得果胶酶对罗汉松抗氧化成分提取的最佳工艺条件为：在料液比为1:20(g/mL)，果胶酶用量0.6g/L，酶解温度50℃，酶解时间2.5h，pH为4.5，酶解液的理论预测值对DPPH的清除率为43.2％。在此条件下进行3次平行验证实验，实验结果对DPPH的平均清除率是43.7％，RSD是0.393％，与预测值的相对偏差为1.11％。结果表明，经过响应回归方程拟合出的理论值与实际值相吻合，证明本实验建立的二次多项回归方程模型能准确预测各因素与效应面之间的关系。
本发明在单因素实验基础上，采用Box-Behnken响应面实验设计，根据Design-Expert 8.0.6软件进行分析，对果胶酶酶解提取罗汉松叶中抗氧化成分的工艺进行优化，建立了酶解法提取抗氧化成分的回归模型，由该模型优化的抗氧化成分提取的最佳工艺条件为：果胶酶用量0.6g/L、酶解温度50℃、酶解时间2.5h，pH为4.5，对DPPH的清除率为43.7％。酶解液中主要的抗氧化成分黄酮的提取率为1.38％，多糖的提取率为6.52％。酶法提取罗汉松抗氧化成分，提取工艺简洁，提取条件温和，是一种合适的提取罗汉松抗氧化成分的方法。
实施例2：
一种罗汉松叶抗氧化成分的果胶酶辅助提取方法，具体过程如下：
新鲜罗汉松叶洗净后，杀青5min，于60℃下干燥，粉碎后得到罗汉松叶粉。
罗汉松叶粉加入超纯水使料液比为1:20g/mL，pH为4.5，在酶解温度50℃的条件下加入果胶酶进行酶解，酶解时间2.5h，果胶酶用量为0.6g/L。
用四层纱布过滤酶解液，将滤液加热至90℃5min使酶失活，冷却后装入试剂瓶，密封，4℃保存。
经检测，酶解液中黄酮的提取率为1.38％，多糖的提取率为6.52％。
实施例3：
一种罗汉松叶抗氧化成分的果胶酶辅助提取方法，具体过程如下：
新鲜罗汉松叶洗净后，杀青5min，于60℃下干燥，粉碎后得到罗汉松叶粉。
罗汉松叶粉加入超纯水使料液比为1:22g/mL，pH为4.5，在酶解温度55℃的条件下加入果胶酶进行酶解，酶解时间2.0h，果胶酶用量为0.5g/L。
用四层纱布过滤酶解液，将滤液加热至90℃5min使酶失活，冷却后装入试剂瓶，密封，4℃保存。
经检测，酶解液中黄酮的提取率为1.23％，多糖的提取率为6.31％。
实施例4：
一种罗汉松叶抗氧化成分的果胶酶辅助提取方法，具体过程如下：
新鲜罗汉松叶洗净后，杀青5min，于60℃下干燥，粉碎后得到罗汉松叶粉。
罗汉松叶粉加入超纯水使料液比为1:18g/mL，pH为4.5，在酶解温度45℃的条件下加入果胶酶进行酶解，酶解时间3.0h，果胶酶用量为0.8g/L。
用四层纱布过滤酶解液，将滤液加热至90℃5min使酶失活，冷却后装入试剂瓶，密封，4℃保存。
经检测，酶解液中黄酮的提取率为1.41％，多糖的提取率为6.11％。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims (5)

1.一种响应面法优化的罗汉松叶抗氧化成分的提取方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
a、精确称取罗汉松叶粉，加入超纯水按固定的料液比在不同温度、酶解时间、果胶酶的添加量下进行酶解浸提，通过单因素试验以及响应面法确定最佳配比；
b、在单因素实验的基础上，由 Design-Expert 8.0.6 统计分析软件中的Box-Benhken试验设计，以加酶量（A）、酶解时间（B）、酶解温度（C）为自变量，DPPH的清除率（Y）作为响应值，建立三因素三水平的中心组合设计，利用实验设计软件进行非线性回归的二次多项式模型拟合，预测的模型如下：
Y=53.57+1.96A+3.817B+7.3C+5.1AB-0.68AC+2.72BC-8.46A2-4.76B2-10.98C2
c、根据回归方程得到响应面分析图，考察拟合之后的响应曲面形状，分析所选定的三个变量对考察的响应值的影响；通过对响应面等值线的分析寻求最优工艺参数，并且通过对3D曲面图的分析，直观地评价各因素间的交互作用，最后得到最优工艺参数。
2.根据权利要求1所述的响应面法优化的罗汉松叶抗氧化成分的提取方法，其特征在于：酶解温度为48-52℃。
3.根据权利要求1所述的响应面法优化的罗汉松叶抗氧化成分的提取方法，其特征在于：所述料液比为1:20 g/mL，果胶酶用量0.6 g/L、酶解温度50℃、酶解时间2.5 h。
4.根据权利要求1所述的响应面法优化的罗汉松叶抗氧化成分的提取方法，其特征在于：所述的统计分析软件为Design-Expert 8.0.6 。
5.根据权利要求1所述的响应面法优化的罗汉松叶抗氧化成分的提取方法，其特征在于：所述的罗汉松叶粉是由新鲜罗汉松叶洗净后，杀青5-8 min，于60±1℃下干燥，粉碎后得到。
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