CN106018296A - 蓝莓中总黄酮含量的测定 - Google Patents

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Abstract

本发公开了一种蓝莓果实中总黄酮含量测定的一种方法。其技术要点主要包括以下几个步骤：1)蓝莓中总黄酮的提取方法；2)测定总黄酮显色剂的制备；3)对照品溶液的配制；4)对照品最大吸收波长的确定；5)标准曲线的建立；6)样品总黄酮含量测定。本发明方法操作简便，成本较低，检测时间较短，精密度较高，重现性良好，稳定性较强。

Description

蓝莓中总黄酮含量的测定
技术领域
本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种蓝莓果实中总黄酮含量测定的方法。
背景技术
蓝莓是当今最流行的五大健康食品之一，其果实的品质优劣是由风味和营养价值来综合体现。风味主要与含有的有机酸及糖的量及其比例有关，决定着口感。而营养价值主要体现在蓝莓中总黄酮及总酚的含量方面。蓝莓的茎、枝叶及果实中含有大量的多酚类物质，主要包括黄酮醇类、花色素类和酚酸类成分。
黄酮类化合物是一大类天然产物，是许多中草药的有效成分。它的存在形式有两种，一种是游离的苷元，另一种是与糖等结合的苷。许多研究已表明黄酮类化合物安全、无毒，其功效是多方面的，它是大多数氧自由基的清除剂，具有很强的抗氧化作用，能改善血液循环、降低胆固醇。能降低心肌耗氧量，增加冠脉、脑血管血流量，明显缓解心绞痛、抗心律失常等，对防治心肌梗塞、心律失常等也有重要疗效等诸多功效，还具有抗癌、防癌的作用，已列为保健食品的一类功能因子。
发明内容
本发明提供了一种蓝莓中总黄酮含量的测定，采用NaNO2-Al(NO3)3比色法测定了总黄酮的含量，具有分析速度快,准确度高,重现性好,精密度高,显色稳定性好等优点。通过对蓝莓果实中总黄酮含量的测定，为蓝莓科学食用、品种选育及优良品种推广奠定理论基础。具体实施方案包括以下几个步骤：
种蓝莓中总黄酮含量的测定，其特征在于，包括以下几个步骤：
(1)蓝莓中总黄酮的提取方法
精密称取蓝莓鲜果，组织破碎后按料液比1:10-15比例加入含有体积分数0.1％盐酸80％(V/V)甲醇溶液，40℃超声提取30-40min，过滤，滤渣按上述方法再提取一次，合并滤液；取滤液用旋转蒸发仪浓缩后加入5倍体积乙酸乙酯进行萃取，萃取3-5次，合并乙酸乙酯层萃取液，回收乙酸乙酯，浓缩物用80％(V/V)甲醇定容，保存备用；
(2)测定总黄酮显色剂的制备
配制5wt％的亚硝酸钠溶液；配制10wt％的硝酸铝溶液；配制4wt％的氢氧化钠溶液；
(3)对照品溶液的配制
精密称取芦丁对照品，用纯水定容，配制成浓度为0.2mg/mL溶液；
(4)最大吸收波长的确定
吸取步骤(3)中所配制芦丁溶液，按照显色方法显色，用紫外-可见分光光度计在400～600nm范围内扫描，确定最大吸收波长为500nm；
(5)芦丁标准曲线的建立
分别量取步骤(3)制备的芦丁对照品溶液0、0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL于10mL容量瓶中，上述溶液分别按照显色方法显色后，于最大波长处测定吸光度，以未加对照品的一组做空白对照；以芦丁对照品浓度为横坐标x，吸光度为纵坐标y，建立标准曲线；
(6)蓝莓样品中总黄酮的测定
精确量取步骤(1)中得到的蓝莓样品提取溶液2.0mL于10ml刻度试管中，按照显色方法显色后，以未加芦丁试管为空白对照，于最大波长处测定吸光度；重复测定三次，所得数据计算平均值，对照标准曲线(图2)可得各品种蓝莓样品中总黄酮的浓度，计算当量mg芦丁/g果实；
所述步骤(4)、步骤(5)、步骤(6)中，显色方法为：在待测溶液中加入0.5mL 5％NaNO2溶液，混匀放置6min，加入0.5mL 10％Al(NO3)3溶液，混匀放置6min；加入4.0mL 4％NaOH溶液，混匀后用80％甲醇溶液稀释至刻度，混匀放置15min。
进一步地，在上述技术方案中，步骤(1)中，蓝莓鲜果质量与定容体积的比例为3～5g:10mL。
进一步地，在上述技术方案中，步骤(3)中，对照品溶液的配制：精密称取10.0mg芦丁对照品，用纯水定容至50mL容量瓶中。
进一步地，在上述技术方案中，步骤(5)中，标准曲线的线性回归方程为：y＝10.82x-0.0038，R2＝0.9995，线性浓度范围为0.01-0.05mg/mL。
进一步地，在上述技术方案中，步骤(2)中，测定总黄酮显色剂的制备：精密称取2.5000g亚硝酸钠NaNO2(分析纯)，用纯水定容至50mL容量瓶中，配制成5％亚硝酸钠溶液；精密称取8.8207g硝酸铝Al(NO3)3·9H2O(分析纯)，用纯水定容至50mL容量瓶中，配制成10％硝酸铝溶液；精密称取4.0000g氢氧化钠NaOH(分析纯)，用纯水定容至100mL容量瓶中，配制成4％氢氧化钠溶液；
发明有益效果
优化的方法具有分析速度快，准确度高，重现性好，精密度高，显色稳定性好等优点，是一种测定蓝莓果实中黄酮含量的理想方法，并可为其他原料中总黄酮含量的测定提供参考依据。
附图说明
图1是对照品芦丁标准溶液在400～600nm范围内扫描所得的吸光度值曲线。
图2是芦丁的标准曲线。
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述实施例中所用试剂，如无特殊说明，均为商业途径获得；下述实施例中所用试验方法，如无特殊说明，均为本领域技术人员熟知的常规实验方法。
实施例1
一种测定蓝莓中总黄酮含量的方法，具体实施方案如下：
1.主要仪器
紫外可见分光光度计(756MC)，上海菁华科技仪器有限公司；超声波清洗机(SB-5200DTD)，宁波新芝生物科技股份有限公司；旋转蒸发仪(EYELA N-1100)，上海爱朗仪器有限公司；低温冷却液循环泵(DLSB-5/20)，郑州长城科工贸有限公司；电子天平(ME204/02)，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。
2.方法
(1)蓝莓中总黄酮的提取方法精密称取蓝金蓝莓鲜果5.0g，组织破碎后按料液比1:15比例加入含有体积分数0.1％盐酸的80％(V/V)甲醇溶液，40℃超声提取30min，过滤，滤渣按上述方法再提取一次，合并滤液。取滤液用旋转蒸发仪浓缩后加入5倍体积乙酸乙酯进行萃取，萃取3次，合并乙酸乙酯层萃取液，回收乙酸乙酯，浓缩物用80％(V/V)甲醇定容至10mL容量瓶，保存备用。
(2)测定总黄酮显色剂的制备精密称取2.5000g分析纯亚硝酸钠(NaNO2)，用纯水定容至50mL容量瓶中，配制成5％亚硝酸钠溶液。精密称取8.8207g分析纯硝酸铝[Al(NO3)3·9H2O]，用纯水定容至50mL容量瓶中，配制成10％硝酸铝溶液。精密称取4.0000g分析纯氢氧化钠(NaOH)，用纯水定容至100mL容量瓶中，配制成4％氢氧化钠溶液。
(3)对照品溶液的配制精密称取10.0mg芦丁对照品，用纯水定容至50mL容量瓶中，配制成浓度为0.2mg/mL溶液。
(4)最大吸收波长的确定吸取步骤(3)中所配制的芦丁标准溶液2.5mL，加入0.5mL5％NaNO2溶液，混匀放置6min，加入0.5mL 10％Al(NO3)3溶液，混匀放置6min。加入4.0mL 4％NaOH溶液，混匀后用80％甲醇溶液稀释至刻度，混匀放置15min，用紫外-可见分光光度计在400～600nm范围内扫描，确定最大吸收波长为500nm(扫描结果见图1)。
(5)芦丁标准曲线的建立分别量取步骤(3)制备的芦丁对照品溶液0、0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL于10mL容量瓶中，分别在上述溶液加入0.5mL 5％NaNO2溶液，混匀放置6min，加入0.5mL 10％Al(NO3)3溶液，混匀放置6min。加入4.0mL 4％NaOH溶液，混匀后用80％甲醇溶液稀释至刻度，混匀放置15min，于最大波长处测定吸光度，以未加对照品的一组做空白对照。以芦丁对照品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，建立标准曲线，其线性回归方程为：y＝10.82x-0.0038，R2＝0.9995，线性浓度范围为0.01-0.05mg/mL(见图2)。
(6)蓝莓样品中总黄酮的测定精确量取蓝莓样品提取溶液2.0mL于10ml刻度试管中，加入0.5mL5％NaNO2溶液，混匀放置6min，加入0.5mL 10％Al(NO3)3溶液，混匀放置6min，加入4.0mL 4％NaOH溶液，混匀后用80％甲醇溶液稀释至刻度，混匀放置15min，以未加芦丁试管为空白对照，于最大波长处测定吸光度，重复测定三次，所得数据依次为0.283,0.280,0.285，计算平均值为0.283，对照标准曲线(图2)可得蓝金样品中总黄酮的浓度为0.054mg/mL，当量为1.082mg芦丁/g果实。
(7)根据上述实验步骤，所测得部分蓝莓品种其总黄酮含量如下表1：
表1新鲜成熟蓝莓果实中总黄酮的含量
2、测定方法学考察
(1)精密度实验
精密称取0.1mg/mL芦丁标准品溶液，按以上方法显色，分别测定其吸光度值，重复6次，测得RSD吸光度为0.54％。(见表2)。
表2精密度实验结果
(2)重现性实验
取蓝金果实按照上述提取方法重复提取6次，按以上方法显色，分别测定其吸光度值，求得吸光度RSD值为1.74％(见表3)。
表3总黄酮重现性实验结果
(3)稳定性实验
取蓝莓样品提取溶液，按以上方法显色，测定0，20，40，60，80min的吸光度，求得吸光度RSD值为2.89％(见表4)。
表4总黄酮稳定性实验结果
(4)加样回收率实验
取提取后的蓝莓样品溶液5份，分别加入相同体积已知浓度的芦丁标准品(0.2mg/mL)，混合后按以上方法显色，测定平均回收率为97.23％，RSD为2.96％(见表5)。
表5芦丁的加样回收率实验结果

Claims (5)

1.一种蓝莓中总黄酮含量的测定，其特征在于，包括以下几个步骤：
(1)蓝莓中总黄酮的提取方法
精密称取蓝莓鲜果，组织破碎后按料液比1:10-15比例加入含有体积分数0.1％盐酸的80％甲醇溶液，40℃超声提取30-40min，过滤，滤渣按上述方法再提取一次，合并滤液；取滤液用旋转蒸发仪浓缩后加入5倍体积乙酸乙酯进行萃取，萃取3-5次，合并乙酸乙酯层萃取液，回收乙酸乙酯，浓缩物用80％甲醇定容，保存备用；
(2)测定总黄酮显色剂的制备
配制5wt％的亚硝酸钠溶液；配制10wt％的硝酸铝溶液；配制4wt％的氢氧化钠溶液；(3)对照品溶液的配制
精密称取芦丁对照品，用纯水定容，配制成浓度为0.2mg/mL溶液；
(4)最大吸收波长的确定
吸取步骤(3)中所配制芦丁溶液，按照显色方法显色，用紫外-可见分光光度计在400～600nm范围内扫描，确定最大吸收波长为500nm；
(5)芦丁标准曲线的建立
分别量取步骤(3)制备的芦丁对照品溶液0、0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL于10mL容量瓶中，上述溶液分别按照显色方法显色后，于最大波长处测定吸光度，以未加对照品的一组做空白对照；以芦丁对照品浓度为横坐标x，吸光度为纵坐标y，建立标准曲线；(6)蓝莓样品中总黄酮的测定
精确量取步骤(1)中得到的蓝莓样品提取溶液2.0mL于10ml刻度试管中，按照显色方法显色后，以未加芦丁试管为空白对照，于最大波长处测定吸光度；重复测定三次，所得数据计算平均值，对照标准曲线可得各品种蓝莓样品中总黄酮的浓度，计算当量mg芦丁/g果实；
所述步骤(4)、步骤(5)、步骤(6)中，显色方法为：在待测溶液中加入0.5mL 5％NaNO2溶液，混匀放置6min，加入0.5mL 10％Al(NO3)3溶液，混匀放置6min；加入4.0mL 4％NaOH溶液，混匀后用80％甲醇溶液稀释至刻度，混匀放置15min。
2.根据权利要求1所述蓝莓中总酚含量的测定，其特征在于：步骤(1)中，蓝莓鲜果质量与定容体积的比例为3～5g:10mL。
3.根据权利要求1所述蓝莓中总酚含量的测定，其特征在于：步骤(3)中，对照品溶液的配制：精密称取10.0mg芦丁对照品，用纯水定容至50mL容量瓶中。
4.根据权利要求1所述蓝莓中总酚含量的测定，其特征在于：步骤(5)中，标准曲线的线性回归方程为：y＝10.82x-0.0038，R2＝0.9995，线性浓度范围为0.01-0.05mg/mL。
5.根据权利要求1所述蓝莓中总酚含量的测定，其特征在于：步骤(2)中，测定总黄酮显色剂的制备：精密称取2.5000g亚硝酸钠NaNO2分析纯，用纯水定容至50mL容量瓶中，配制成5％亚硝酸钠溶液；精密称取8.8207g硝酸铝Al(NO3)3·9H2O分析纯，用纯水定容至50mL容量瓶中，配制成10％硝酸铝溶液；精密称取4.0000g氢氧化钠NaOH分析纯，用纯水定容至100mL容量瓶中，配制成4％氢氧化钠溶液。
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Application publication date: 20161012

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