CN110174366A - 一种枸杞中甜菜碱的提取检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种枸杞中甜菜碱的提取检测方法，其原理为：经沸水浴提取枸杞中甜菜碱，用活性炭、亚铁氰化钾、硫酸锌去除色素、蛋白质、脂肪等干扰性成分，在酸性条件下，甜菜碱盐酸盐能与雷氏盐生成红色沉淀，离心过滤弃去上清液后，用70％丙酮溶液溶解沉淀后呈淡粉色液体，反应液在波长为525nm处出现最大吸收峰。本发明所述的甜菜碱检测方法不仅能够有效提高设备的使用率，而且该方法简单易操作，使用仪器设备均为实验室基本配置，使用化学试剂毒性小，检验人员只需具备基本的化学检验基础就能操作，适合中小型企业及基层检验机构开展提取及检测实验。
Description
技术领域
本发明涉及甜菜碱检测领域，具体涉及一种枸杞中甜菜碱的提取检测方法。
背景技术
枸杞为“药食同源”物质，《中国药典》记载枸杞有滋补肝肾，益精明目的效用。近年来我国枸杞产业发展迅速，种植面积和产量逐年增长，因其具有极强的耐旱、耐盐碱和耐贫瘠性，主要产区分布在宁夏、甘肃、青海、新疆、内蒙等西北地区，逐渐已成为当地主要经济支柱，为精准扶贫提供助力。但枸杞加工尚处于初级阶段，当地企业生产模式单一、初级产品多、产品深加工少、产品附加值低，对枸杞的有效成分开发研究较少。枸杞作为一种经济作物全身是宝，有效成分主要有枸杞多糖、甜菜碱、枸杞色素等，目前针对枸杞有效成分的研究还主要集中于枸杞多糖，而对枸杞中甜菜碱的研究较少。
甜菜碱(betaine)学名三甲基胺乙内酯，化学式为C5H11NO2，许多枸杞属植物果实、根皮、叶中均含有甜菜碱，作为一种渗透调节物质在高等植物体内普遍存在，有许多优良的药理作用，在体内起甲基供体作用，是枸杞中对脂类代谢或抗脂肪肝的主要活性物质。甜菜碱具有渗透调节作用，在高同型半胱氨酸血症的治疗中安全而有效，对多种肝脏疾病有很好的治疗作用，而且大肠杆菌具有明显抑菌作用。
目前，甜菜碱的测定主要依托2项农业部推广标准，即：《枸杞中甜菜碱含量的测定高效液相色谱法》(NY/T 2947-2016)和《甜菜中甜菜碱的测定比色法》(NY/T 1746-2009)。其中，第一种测定方法是使用高效液相色谱法测定枸杞中的甜菜碱，枸杞中甜菜碱含量基本在1.0％～3.0％之间，采用液相色谱法，检出限为0.001g/100g，取样量需低于0.2g，降低了样品的代表性；使用此方法进行了多次测定实验可以发现：该测定方法的提取净化步骤仅将枸杞涡旋1min、均质2min、离心5min后上固相萃取柱，用有机试剂洗脱两次无法将甜菜碱有效分离出来，蛋白、脂肪、色素等杂质也去除不完全，上机后杂峰多，误差大，需实验人员自己摸索优化提取净化条件，试验难度较大；而且高效液相色谱价格较高，还必须配备固相萃取装置和氮吹仪，使用有机试剂也必须是色谱纯，实验人员也要具备大型精密仪器设备操作经验和优化试验方法的能力，不适合中小型企业和基层检验检测机构开展实验。第二种测定方法不适用于枸杞中甜菜碱的测定，其前处理时间过长，仅仅用水浸泡3h，无法对甜菜碱充分提取，枸杞中蛋白质含量在10～14％，粗脂肪含量在2～3％，必须要去除蛋白、脂肪、色素等干扰因素，否则最后的沉淀物为薄膜状，无法用有机试剂溶解检测；此方法是离心后弃去上清液，留存沉淀为目标物，可上清液无法准确移除，导致标准曲线线性较差，样品测量结果误差大，而且此标准计算式中稀释倍数错误，导致结果相差50％，此标准不能正常使用。
发明内容
本发明旨在提供一种操作简单，适合中小企业及基层检验机构的枸杞中甜菜碱的提取检测方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：一种枸杞中甜菜碱的提取检测方法，包括以下步骤：
(1)制备甜菜碱提取液
精确称取一定量的枸杞粉末置于具塞锥形瓶中，依次加入活性炭和适量蒸馏水，沸水浴提取1.0～2.0h，提取完毕后，冷却至室温后定量转移至容量瓶中，加入亚铁氰化钾溶液和硫酸锌溶液，充分混匀，加入蒸馏水定容、摇匀，放置5min后采用定量滤纸过滤上清液，即可得到甜菜碱提取液；
(2)制备甜菜碱待测液
吸取一定量的所述甜菜碱提取液置于刻度离心管中，加盖后置于冰箱中在4℃下存放15min，打开盖滴加一定量的雷氏盐溶液，加盖后置于冰箱中在4℃下存放1h；取出置于离心机中离心后，定量滤纸过滤弃去上清液，用少量冰水轻轻冲洗滤纸1—2次；小心取下滤纸后展开，用丙酮溶液分三次将滤纸上的少量滤渣小心洗入原离心管，即可得到甜菜碱待测液；
(3)绘制标准曲线
精确吸取甜菜碱标准品溶液，配制形成一系列具有相同体积、不同浓度的甜菜碱标准液，并将该系列甜菜碱标准液置于冰箱中，在4℃下存放15min，分别滴加一定量的雷氏盐溶液后，再次置于冰箱中在4℃下存放1h；取出置于离心机中离心后，定量滤纸过滤弃去上清液，用少量冰水轻轻冲洗滤纸1—2次；小心取下滤纸后展开，用丙酮溶液分三次将滤纸上的少量滤渣小心洗入原离心管后，分别置于紫外-可见分光光度计中测定525nm处的吸光度，并以质量浓度为横坐标、吸光度为纵坐标作图，获得甜菜碱的标准曲线和标准曲线方程；
(4)获取样品检测结果
将步骤(2)中制备的所述甜菜碱待测液置于紫外-可见分光光度计中测定525nm处的吸光度，并将检测结果带入步骤(3)所得标准曲线方程中，计算得出待测样品中甜菜碱的质量浓度，进而换算得到枸杞中甜菜碱的含量。
进一步，步骤(1)中，所述枸杞粉末的制备方法为：将枸杞样品置于冰箱中，在-18℃下持续冷冻18h后采用高速粉碎机粉碎。
进一步，步骤(1)中，所述枸杞粉末与所述活性炭的质量比为1.0:0.50。
进一步，步骤(1)中，所述亚铁氰化钾溶液的浓度为150g/L，所述硫酸锌溶液的浓度为300g/L，所述枸杞粉末与所述亚铁氰化钾溶液、硫酸锌溶液的添加比例为1g:2.0mL:2.0mL。
进一步，所述雷氏盐溶液的浓度为15g/L，步骤(2)中，所述甜菜碱提取液与所述雷氏盐溶液的体积比为1.0:5.0，步骤(3)中，所述甜菜碱标准液与所述雷氏盐溶液的体积比为1.0:5.0。
进一步，所述丙酮溶液的浓度为70％，步骤(2)、(3)中，所述丙酮溶液的用量相同。
进一步，步骤(3)中，所述甜菜碱标准品溶液的配制方法为：精确称取0.0180g的甜菜碱标准品置于10mL烧杯中，加入适量蒸馏水，搅拌使之溶解后，转移至10mL容量瓶中定容。
进一步，所述甜菜碱标准品为纯度＞92.0％的C5H11NO2。
进一步，步骤(2)、(3)中，离心条件为在10000r/min下持续15min。
本发明所述枸杞中甜菜碱的提取检测方法的原理为：
经沸水浴提取枸杞中甜菜碱，用活性炭、亚铁氰化钾、硫酸锌去除色素、蛋白质、脂肪等干扰性成分，在酸性条件下，甜菜碱盐酸盐能与雷氏盐生成红色沉淀，离心过滤弃去上清液后，用70％丙酮溶液溶解沉淀后呈淡粉色液体，反应液在波长为525nm处出现最大吸收峰。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
(1)本发明采用紫外可见分光光度法测定枸杞中甜菜碱的含量，该方法是《枸杞》(GB/T 18672-2014)中测定枸杞多糖的指定方法，方法成熟，而且紫外-可见分光光度计现已成为各检测机构和食品生产企业的必要配置设备之一，因此本发明所述的甜菜碱检测方法不仅能够有效提高设备的使用率，而且该方法简单易操作，使用仪器设备均为实验室基本配置，使用化学试剂毒性小，检验人员只需具备基本的化学检验基础就能操作，适合中小型企业及基层检验机构开展提取及检测实验。
(2)在枸杞中甜菜碱的提取方法中，本发明选取纯水作为提取剂，与现有技术中常用的甲醇、乙醇相比，不仅能够保证甜菜碱的溶解性，而且能够更加有利于甜菜碱产品在食品、化妆品中的添加；在加热提出过程中，为了去除色素对比色的影响，本发明采取一份样品中加入0.25～0.50份活性炭的方式，能够有效除去提取液原有的橙黄色；本发明选取浓度为150g/L的亚铁氰化钾溶液和浓度为300g/L的硫酸锌溶液的复合沉淀剂，巧妙地利用了乙酸锌与亚铁氰化钾反应生成能够有效吸附蛋白质、脂肪等干扰物质的氰亚铁酸锌沉淀，进而在极大程度上避免了干扰物质对后续检测结果的影响。
(3)在甜菜碱待测液的制备方法中，在一份提取液中加入5.0～10份浓度为15g/L的雷氏盐溶液，能够有效保证反应完全度，并且在冷藏反应1h后得到的甜菜碱沉淀，高速离心15min后，使沉淀附着在离心管壁上；此时，采用定量滤纸过滤后用少量冰水冲洗，可将多余雷氏盐红色去除，再将滤纸小心取下展开，用10mL浓度为70％的丙酮溶液分三次冲洗，既可以滤去上清液，又能最大程度保留甜菜碱沉淀；其中，采用定量滤纸过滤的方式，不仅能够有效避免直接倾倒法存在的少量沉淀易随上清液流失，造成测定结果偏低的问题，而且能够有效避免采用G4坩埚抽滤时，存在滤芯中的少量沉淀无法洗出的技术问题。
(4)本发明补全了枸杞中有效成分的提取和测定，鼓励企业优选枸杞品种，提取枸杞有效成分，提高深加工能力，增加产品附加值，对枸杞产品的保健成分作深入分析，有利于地方经济的发展。
附图说明
图1为样品A(特优枸杞)的甜菜碱测定谱图。
图2为样品B(优级枸杞)的甜菜碱测定谱图。
图3为样品C(冻干枸杞)的甜菜碱测定谱图。
图4为样品A2的甜菜碱加标回收测定谱图。
图5为样品B2的甜菜碱加标回收测定谱图。
图6为样品C2的甜菜碱加标回收测定谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进行进一步描述，但本发明的保护范围并不限于此。
本发明实施例所用紫外-可见分光光度计为上海光谱SP-756P型紫外可见分光光度计，波长范围为190～800nm。
本发明实施例所用离心机为TG16型台式高低速离心机，转速＞10000r/min。
本发明实施例所用pH计为梅特勒FE20型酸度计，分度值＞0.1pH。
本发明实施例所用分析天平为赛多利斯SQP型电子天平，精度值为0.0001g。
本发明所用粉碎机为DFT-100型手提式高速粉碎机，10000r/min。
本发明所用丙酮(CH3COCH3)、亚铁氰化钾〔K4Fe(CN)6·3H2O〕、硫酸锌(ZnSO4·7H2O)、雷氏盐[NH4Cr(NH3)2(SCN)4H2O]的纯度均为分析纯，所用甜菜碱标准品(C5H11NO2)的纯度＞92.0％，所用活性炭为粉状，所用水为蒸馏水。
实施例1：枸杞样品中甜菜碱的提取检测方法
(1)制备甜菜碱提取液
将100g枸杞样品置于冰箱中，在-18℃下持续冷冻18h后，采用DFT-100型手提式高速粉碎机粉碎，精确称取1.0000g的枸杞粉末置于200mL具塞锥形瓶中，依次加入0.5g活性炭和150mL蒸馏水，沸水浴提取1.0h，提取完毕后，取出冷却至室温后定量转移至200mL容量瓶中，加入2.0mL浓度为150g/L的亚铁氰化钾溶液和2.0mL浓度为300g/L的硫酸锌溶液，充分混匀后，加入蒸馏水定容、摇匀，放置5min后采用定量滤纸过滤，即可得到甜菜碱提取液；
(2)制备甜菜碱待测液
吸取2.00mL甜菜碱提取液置于20mL刻度离心管中，加盖后置于冰箱中在4℃下存放15min，打开盖滴加10mL浓度为15g/L雷氏盐溶液，加盖后置于冰箱中在4℃下存放1h；取出置于TG16型台式高低速离心机中用10000r/min离心15min，定量滤纸过滤弃去上清液，用少量冰水轻轻冲洗滤纸1—2次；小心取下滤纸后展开，用10mL浓度为70％的丙酮溶液分三次将滤纸上的少量滤渣小心洗入原离心管，即可得到甜菜碱待测液；
(3)绘制标准曲线
精确称取0.0180g的甜菜碱标准品置于10mL烧杯中，加入适量蒸馏水，搅拌使之溶解后，转移至10mL容量瓶中定容，得到浓度为1.8g/L的甜菜碱标准品溶液；取7支试管，依次编号为1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#，分别精确吸取0mL、0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL甜菜碱标准品溶液置于上述7支试管中，并依次加入2.0mL、1.9mL、1.8mL、1.6mL、1.4mL、1.2mL、1.0mL蒸馏水，使最后的总体积为2.0mL，得到浓度分别为0mg/mL、0.09mg/mL、0.18mg/mL、0.36mg/mL、0.54mg/mL、0.72mg/mL、0.90mg/mL的一系列具有相同体积、不同浓度的甜菜碱标准液，此时将该系列甜菜碱标准液置于冰箱中，在4℃下存放15min，分别滴加10mL浓度为15g/L的雷氏盐溶液后，再次置于冰箱中在4℃下存放1h；取出置于TG16型台式高低速离心机中用10000r/min离心15min，定量滤纸过滤弃去上清液，用少量冰水轻轻冲洗滤纸1—2次；小心取下滤纸后展开，用10mL浓度为70％的丙酮溶液分三次将滤纸上的少量滤渣小心洗入原离心管后，分别置于SP-756P型紫外-可见分光光度计中测定525nm处的吸光度，并以甜菜碱含量为横坐标、吸光度为纵坐标作图，测得甜菜碱的标准曲线后拟合数据获得标准曲线方程；
(4)获取样品检测结果
①将步骤(2)中制备的所述甜菜碱待测液置于SP-756P型紫外-可见分光光度计中测定525nm处的吸光度；
②将检测结果带入步骤(3)所得标准曲线方程中，计算得出待测样品中甜菜碱的含量；
③将②获得的待测样品中甜菜碱的含量代入式(1)，即可得到待测样品中甜菜碱的质量分数(ω)，数值以百分数(％)表示，计算结果保留到小数点后两位：
式(1)中：
m1—试样检测液中的甜菜碱含量，即由标准曲线方程计算得出的吸取待测液中的甜菜碱质量，同式(2)中的C，单位为毫克(mg)；
V—甜菜碱提取液的定容体积，单位为毫升(mL)，本实施例中为200mL；
V1—甜菜碱待测液的吸取体积，单位为毫升(mL)，本实施例中为2.0mL；
m—试样的质量，单位为克(g)，本实施例中为1.0000g；
计算结果保留到小数点后两位。
④精密度控制：在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10％。
实施例2：三个不同等级的枸杞样品中甜菜碱含量的检测
选取特优、优级的烘干枸杞样品，分别编号为样品A、B，同时选取普通冻干枸杞样品编号为样品C，每个样品按照实施例1所述的方法中步骤(1)、(2)制备2个平行样，共得6个样品，即：A1、A2、B1、B2、C1、C2，测定各样品中甜菜碱的含量，结果如图1、2、3所示。其中，样品A(A1、A2)的甜菜碱测定谱图如图1所示，样品B(B1、B2)的甜菜碱测定谱图如图2所示，样品C(C1、C2)的甜菜碱测定谱图如图3所示。
由图1、2、3可以看出，甜菜碱标准溶液的吸光度拟合曲线方程如式(2)所示，线性相关性如式(3)所示：
A＝0.1644C+0.0037 (2)
R＝0.99973 (3)
式(2)、(3)中：
A-吸光度；
C-试样检测液中的甜菜碱含量，同式(1)中的m1，单位为毫克(mg)；
R-线性相关系数。
由式(2)、(3)可以看出，数据线性相关性好。结合式(2)计算得出的样品A、B、C中甜菜碱浓度的相关测定结果见表1所示，结合式(1)计算的出的样品A、B、C中甜菜碱含量的测定值见表2所示。
表1样品A、B、C甜菜碱浓度的相关测定结果
表2样品A、B、C甜菜碱含量的测定值
由以上测定结果可以看出：烘干的特优枸杞(样品A)和特级枸杞(样品B)的甜菜碱含量均＞3.0％，而冻干枸杞(样品C)的甜菜碱含量＞9.0％，说明与烘干工艺相比，冻干工艺能够更大程度地保留枸杞的有效成分，而甜菜碱是枸杞中的主要有效成分之一，其含量高低也可以作为枸杞品质等级划分的重要参考指标。
实施例3：检测方法准确度验证
为了验证检测的准确度，采用甜菜碱标准品进行加标回收实验，实验方法为：精确称取样品A、B、C各1.0000g，分别加入10mL浓度为3.0mg/mL的甜菜碱标准溶液后，分别严格按照A2、B2、C2的制备条件、试验条件和处理方式，获得三个加标液，即A2加标、B2加标和C2加标，分别置于SP-756P型紫外-可见分光光度计中测定525nm处的吸光度，计算回收率，回收率(P)的计算公式如式(4)所示：
式(4)中：
P—回收率，数值以百分数(％)表示；
m1—试样检测液中的甜菜碱含量，单位为毫克(mg)；
m2—加标试样甜菜碱质量，单位为毫克(mg)；
m3—甜菜碱加标量，单位为毫克(mg)。
样品A2、B2、C2的甜菜碱加标回收测定谱图如图4、5、6所示，其中，样品A2的甜菜碱加标回收测定谱图如图4所示，样品B2的甜菜碱加标回收测定谱图如图5所示，样品C2的甜菜碱加标回收测定谱图如图6所示。
由图4、5、6可以看出，甜菜碱标准溶液的吸光度拟合曲线方程如式(2)所示，线性相关性如式(3)所示，样品A2、B2、C2甜菜碱加标回收相关测定结果见表3所示，样品A、B、C甜菜碱加标回收率测定值见表4所示。
表3样品A、B、C甜菜碱加标回收相关测定结果
表4样品A、B、C甜菜碱加标回收率测定值
表4中的回收率计算结果表明：样品A2、B2、C2的加标回收率分别为85.00％、94.67％和85.33％，回收率高，表明在本发明的提取条件和测定条件下枸杞中甜菜碱可以被有效分离和高效回收，甜菜碱测试结果准确度高。
需要说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制。尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，都不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (9)
1.一种枸杞中甜菜碱的提取检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)制备甜菜碱提取液
精确称取一定量的枸杞粉末置于具塞锥形瓶中，依次加入活性炭和适量蒸馏水，沸水浴提取1.0～2.0h，提取完毕后，冷却至室温后定量转移至容量瓶中，加入亚铁氰化钾溶液和硫酸锌溶液，充分混匀，加入蒸馏水定容、摇匀，放置5min后采用定量滤纸过滤上清液，即可得到甜菜碱提取液；
(2)制备甜菜碱待测液
吸取一定量的所述甜菜碱提取液置于刻度离心管中，加盖后置于冰箱中在4℃下存放15min，打开盖滴加一定量的雷氏盐溶液，加盖后置于冰箱中在4℃下存放1h；取出置于离心机中离心后，定量滤纸过滤弃去上清液，用少量冰水轻轻冲洗滤纸1—2次；小心取下滤纸后展开，用丙酮溶液分三次将滤纸上的少量滤渣小心洗入原离心管，即可得到甜菜碱待测液；
(3)绘制标准曲线
精确吸取甜菜碱标准品溶液，配制形成一系列具有相同体积、不同浓度的甜菜碱标准液，并将该系列甜菜碱标准液置于冰箱中，在4℃下存放15min，分别滴加一定量的雷氏盐溶液后，再次置于冰箱中在4℃下存放1h；取出置于离心机中离心后，定量滤纸过滤弃去上清液，用少量冰水轻轻冲洗滤纸1—2次；小心取下滤纸后展开，用丙酮溶液分三次将滤纸上的少量滤渣小心洗入原离心管后，分别置于紫外-可见分光光度计中测定525nm处的吸光度，并以质量浓度为横坐标、吸光度为纵坐标作图，获得甜菜碱的标准曲线和标准曲线方程；
(4)获取样品检测结果
将步骤(2)中制备的所述甜菜碱待测液置于紫外-可见分光光度计中测定525nm处的吸光度，并将检测结果带入步骤(3)所得标准曲线方程中，计算得出待测样品中甜菜碱的质量浓度，进而换算得到枸杞中甜菜碱的含量。
2.根据权利要求1所述的一种枸杞中甜菜碱的提取检测方法，其特征在于：步骤(1)中，所述枸杞粉末的制备方法为：将枸杞样品置于冰箱中，在-18℃下持续冷冻18h后采用高速粉碎机粉碎。
3.根据权利要求1所述的一种枸杞中甜菜碱的提取检测方法，其特征在于：步骤(1)中，所述枸杞粉末与所述活性炭的质量比为1.0:0.50。
4.根据权利要求1所述的一种枸杞中甜菜碱的提取检测方法，其特征在于：步骤(1)中，所述亚铁氰化钾溶液的浓度为150g/L，所述硫酸锌溶液的浓度为300g/L，所述枸杞粉末与所述亚铁氰化钾溶液、硫酸锌溶液的添加比例为1g:2.0mL:2.0mL。
5.根据权利要求1所述的一种枸杞中甜菜碱的提取检测方法，其特征在于：所述雷氏盐溶液的浓度为15g/L，步骤(2)中，所述甜菜碱提取液与所述雷氏盐溶液的体积比为1.0:5.0，步骤(3)中，所述甜菜碱标准液与所述雷氏盐溶液的体积比为1.0:5.0。
6.根据权利要求1所述的一种枸杞中甜菜碱的提取检测方法，其特征在于：所述丙酮溶液的浓度为70％，步骤(2)、(3)中，所述丙酮溶液的用量相同。
7.根据权利要求1所述的一种枸杞中甜菜碱的提取检测方法，其特征在于：步骤(3)中，所述甜菜碱标准品溶液的配制方法为：精确称取0.0180g的甜菜碱标准品置于10mL烧杯中，加入适量蒸馏水，搅拌使之溶解后，转移至10mL容量瓶中定容。
8.根据权利要求7所述的一种枸杞中甜菜碱的提取检测方法，其特征在于：所述甜菜碱标准品为纯度＞92.0％的C5H11NO2。
9.根据权利要求1所述的一种枸杞中甜菜碱的提取检测方法，其特征在于：步骤(2)、(3)中，离心条件为在10000r/min下持续15min。
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