CN104914186B - 坚杆火绒草或其炮制品中绿原酸等三种成分的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了坚杆火绒草或其炮制品中绿原酸、咖啡酸、木犀草素中的一种或多种成分的UPLC检测方法。上述检测方法，简单、准确、分析时间短、稳定性好，可以用于坚秆火绒草中上述三种成分的检测。

Description

坚杆火绒草或其炮制品中绿原酸等三种成分的检测方法

技术领域

本发明涉及坚杆火绒草或其炮制品中绿原酸等三种成分的检测方法。

背景技术

坚杆火绒草，别名莪药、山毛香，为菊科火绒草属植物坚杆火绒草Leontopodiumfranchetii Beauv.的干燥全草，是藏医火灸治疗中的重要原材料，其藏药名“扎托巴”^[1]，也叫“扎瓦”^[2]。据藏医学传统书籍《晶珠本草》记载：“扎瓦，治瘟病时疫，解矿石合毒，治肉瘤”^[3]。《四部医典》明确阐述：“但凡‘培根’与‘龙’型的寒性病、脉病、‘黄水’病等，临床皆可通过煮、烧、烤、熏等方式用灸草的药性和热能刺激穴位以治之”^[4]。藏药草灸疗法以其疗效显著、成本低廉、操作简便等优势，从古沿用至今。坚杆火绒草作为藏医临床施灸的原材料，以每年的7-8月正值其花开旺盛之时，择吉日采集全草，晒干，揉成圆锥状以备用，此时灸草的叶和花朵生长茂盛，无籽且叶不宜断残，是采集灸草的最佳时节^[5]。

发明人在研究中发现，坚杆火绒草中含有总黄酮和总酚酸类成分，现代研究表明，酚酸和黄酮类化合物是许多中草药的有效成分，某些酚酸类具有清除自由基、抗菌、抗炎、抗氧化和调节心血管疾病的作用^[6-8]，某些黄酮类化合物具有抗肿瘤、抗氧化、抗菌、抗炎、降血脂、降血压、镇痛、保肝护肝、调节免疫、保护心脑血管系统等药理作用^[9-11]；同时，通过对坚杆火绒草不同采收期、不同植物部位总黄酮和总酚酸含量的测定比较，发现花期采摘的药材中总黄酮和总酚酸含量明显高于果期，确定了其花期为最佳采收期，这一结论与藏医的“在秋季花开旺盛时择吉日采集全草”临床实践经验相一致。上述发现表明，总黄酮和总酚酸含量可以作为坚杆火绒草最佳采收期和药材品质的评价指标。

目前还未见对坚杆火绒草中具体化学成分的报道。

发明内容

发明人进一步对坚杆火绒草中的黄酮和酚酸类成分进行比对，首次在坚杆火绒草中发现了绿原酸、咖啡酸、木犀草素这三种化学成分，其中，绿原酸具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、保护心血管等功效，咖啡酸也具备抗菌抗病毒等功效，木犀草素具有多种药理活性，如消炎、抗过敏、抗肿瘤、抗菌、抗病毒等，前两者为典型的酚酸类成分代表，而后者则为重要的天然黄酮类成分。因此，在发现坚杆火绒草具有上述三种成分的基础上，研究其中各成分的检测方法，可以对该类药材的质量监测或控制提供可能。

本发明目的在于提供一种坚杆火绒草或其炮制品中绿原酸等三种成分UPLC检测方法。本发明的另一目的在于提供坚杆火绒草或其炮制品的质量控制方法，不限于对上述三种成分的检测。

超高效液相色谱(Ultra Performance Liquid Chromatography\UPLC)(又名超高压液相色谱、超高速液相色谱)是分离科学中的一个全新类别，UPLC借助于HPLC(高效液相色法)的理论及原理，涵盖了小颗粒填料、非常低系统体积及快速检测手段等全新技术，增加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容量。本发明正是采用UPLC进行检测的。

具体地，本发明提供了坚杆火绒草或其炮制品中绿原酸、咖啡酸、木犀草素中的一种或多种成分的UPLC检测方法，它包括如下操作步骤：

(1)取待检样品，加40～60％v/v甲醇提取，收集提取液，制备供试品溶液；

(2)取绿原酸、咖啡酸、木犀草素中的一种或两种以上的混合物，制备对照品溶液；

(3)将供试品溶液、对照品溶液分别注入超高效液相色谱仪中，采用外标法检测即可；其中，色谱条件如下：

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填料

检测波长和流动相条件如下：

本发明一个具体实施方式中，使用了50％v/v甲醇作为提取溶剂，考虑在提取溶剂配制过程中存在的误差，本发明亦可选择使用45～55％v/v甲醇。

进一步地，步骤(1)中，甲醇提取的方式为冷浸后超声提取。

更进一步地，步骤(1)中，冷浸时间为8～12h以上(如浸泡过夜)，超声提取时间为30～40min，超声提取时间优选为30min。

进一步地，步骤(2)中，对照品溶液的溶剂选自甲醇或甲醇水溶液。

其中，步骤(3)中，所述色谱柱填料的粒径为1.7～3.5μm，为1.7～1.8μm，更优选为1.7μm。

其中，所述色谱柱尺寸为：2.1×50mm；优选地，所述色谱柱的型号为：ACQUITYUPLC BEH C18色谱柱。

其中，所述流动相流速为0.2mL.min^-1；色谱柱柱温为35℃。

其中，所述待检样品为菊科火绒草属植物坚杆火绒草Leontopodium franchetiiBeauv.的根、茎、叶、花、种子或全草。

上述检测方法，简单、准确、分析时间短、稳定性好，可以用于坚杆火绒草中上述三种成分的检测。

本发明还提供了坚杆火绒草或其炮制品的质量控制方法，它是采用UPLC法进行检测的，包括如下操作步骤：

(1)取待检样品，加40～60％v/v甲醇提取，收集提取液，制备供试品溶液；

(2)将供试品溶液注入超高效液相色谱仪中，检测即可；其中，色谱条件如下：

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填料

检测波长和流动相条件如下：

本发明一个具体实施方式中，使用了50％v/v甲醇作为提取溶剂，考虑在提取溶剂配制过程中存在的误差，本发明亦可选择使用45～55％v/v甲醇。

进一步地，步骤(1)中，甲醇提取的方式为冷浸后超声提取。

更进一步地，步骤(1)中，冷浸时间为8～12h以上(如浸泡过夜)，超声提取时间为30～40min，超声提取时间优选为30min。

进一步地，步骤(2)中，对照品溶液的溶剂选自甲醇或甲醇水溶液。

其中，步骤(3)中，所述色谱柱填料的粒径为1.7～3.5μm，为1.7～1.8μm，更优选为1.7μm。

其中，所述色谱柱尺寸为：2.1×50mm；优选地，所述色谱柱的型号为：ACQUITYUPLC BEH C18色谱柱。

其中，所述流动相流速为0.2mL.min^-1；色谱柱柱温为35℃。

进一步地，该质量控制方法中采用指纹图谱技术进行检测。

从色谱图可以看出，坚杆火绒草在上述色谱条件下得出的色谱图中不仅仅含有本发明发现的绿原酸、咖啡酸、木犀草素这三种成分，其他未知或未探明成分较多(见图5)，因此，研究人员亦可采用上述色谱条件对坚杆火绒草的其他成分进行检测，或者，亦可对上述色谱条件得出的色谱图进行指纹图谱研究比对，均可实现对坚杆火绒草质量的综合研究。

附图说明

图1坚杆火绒草中总黄酮含量测定(mg.g^-1)

图2～图2续b不同流动相条件下的色谱图；其中，A乙腈-水，B甲醇-水，C甲醇-0.05％磷酸水，D甲醇-0.10％磷酸水，E甲醇-0.20％磷酸水，F甲醇-0.35％磷酸水，G甲醇-0.50％磷酸水

图3～图3续不同柱温条件下的色谱图；其中，A 25℃，B 30℃，C 35℃，D 40℃，E45℃

图4不同流速条件下的色谱图；其中，A 0.1mL.min^-1、B 0.2mL.min^-1、C 0.3mL.min^-1图5混合对照品(A)和样品(B)UPLC图(1.绿原酸2.咖啡酸3.木犀草素)

具体实施方式

实施例1 本发明UPLC检测方法的实验前研究——坚杆火绒草总黄酮的含量的测定

1材料与方法

1.1材料

试验用坚杆火绒草样本分别在2013年7月2和9月24日采收于西南民族大学青藏高原研究基地红原草地，并经于西南民族大学民族医药研究院刘圆教授鉴定。样品用超纯水洗净晒干，在60℃电热恒温鼓风干燥箱中烘干后，粉碎，过四号筛，得坚杆火绒草粉末。

1.1.2主要试剂

无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等均为国产分析纯；芦丁对照品,购自成都曼思特生物科技有限公司(批号MUST-12040302，含量≥98％)，试验用水为实验室自制超纯水。

1.1.3主要仪器

DHG-9246A型电热恒温鼓风干燥箱，购自上海精宏试验设备有限公司；JY-02多功能粉碎机，购自永康浩瀚工贸有限公司；METTLER TOLEDO TYPE AE240S电子分析天平，购自梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；德国 RV 10控制型旋转蒸发仪，购自德国IKA上海分公司；KQ5200E型超声波清洗器(40kHz、250W)，购自昆山超声仪器有限公司；HH-2型数显恒温水浴锅，购自国华电器有限公司；TU-1950系列紫外可见分光光度计，购自北京普析通用仪器有限责任公司；回流装置、抽滤装置、锥形瓶、量筒、移液枪、容量瓶、比色管等常用仪器。

1.2方法

1.2.1紫外分光光度法(UV)测定样品中总黄酮含量的测定方法与依据

芦丁和黄酮类化合物的基本母核结构均为2-苯基色原酮，具有相同的吸光度测试性质，于510nm附近均有最大吸收峰，以芦丁对照品计，测定坚杆火绒草中总黄酮的含量。黄酮类化合物主要包括黄酮苷和黄酮醇苷两大部分。在黄酮类化合物溶液中加入铝离子试剂，在碱性条件下黄酮类化合物中的酚羟基与铝盐形成稳定的络合物，在可见光区能获得稳定的特征吸收峰，其质量浓度与吸光度符合比耳定律，可以定量测定^[12]。而且研究表明NaNO₂-Al(NO₃)₃-NaOH显色法具有灵敏、稳定的特性，故而选之作为显色系统^[13]。

1.2.2对照品溶液的制备

精密称量芦丁对照品(105℃干燥至恒重)25.00mg，置50mL容量瓶中，加无水乙醇适量，溶解，放冷，加无水乙醇至刻度，摇匀，即得0.50mg.mL^-1的对照品储备液。

1.2.3供试品溶液的制备

精密称取坚杆火绒草粉末(过四号筛)1g，于150mL锥形瓶中，加体积分数为70％的乙醇50mL，先35℃超声处理0.5h，再转移至150mL圆底烧瓶中水浴回流提取1h，重复提取3次，合并所得滤液，加70％乙醇定容于250mL容量瓶中，摇匀，作为供试品溶液。

1.2.4检测波长的选择

准确吸取芦丁标准溶液和坚杆火绒草样品溶液适量，分别置于10mL比色管中，加纯净水至5mL；然后加5％亚硝酸钠溶液0.4mL，摇匀，放置5min；再加10％硝酸铝溶液0.4mL，摇匀，放置5min；再加4％氢氧化钠试液4.0mL，加水稀释至刻度，摇匀后室温放置15min，以提取溶剂为空白参比，在300～650nm之间测定吸光度，根据最大吸收峰选定检测波长。结果芦丁标准溶液和坚杆火绒草样品溶液显色后均在512nm处有最大吸收峰，故将512nm确定为检测波长。

1.2.5标准曲线的绘制

精密吸取0.50mg.mL^-1的芦丁对照储备液0、0.40、0.80、1.20、1.60、2.00、2.40mL分别置于10mL比色管中，加纯净水至5mL；然后加5％亚硝酸钠溶液0.4mL，摇匀，放置5min；再加10％硝酸铝溶液0.4mL，摇匀，放置5min；再加4％氢氧化钠试液4.0mL，加水稀释至刻度，摇匀后室温放置15min，以溶解溶剂为空白参比。按照中国药典2010年版一部附录VA下的紫外-可见分光光度法，在波长512nm处测定吸光度，以吸光度对溶液浓度进行线性回归分析，结果表示，浓度在0～120μg.mL^-1范围内呈现良好线性关系，回归方程为Y＝0.0102X+0.0247，R²＝0.9998。

1.2.6方法学考察

①精密度试验。精密量取1.2.2项中对照品溶液1mL，6份，分别按1.2.5项下标准曲线的制备方法于512nm下测定吸光度值，RSD值为0.77％，表明本方法精密度良好。

②稳定性试验。取同一批坚杆火绒草粉末，按照1.2.3项下的方法制备供试品溶液，按1.2.5项下标准曲线的制备方法处理，分别于显色后15、30、60、90、120min时于512nm下测定吸光度值，RSD值为1.18％，表明样品溶液在120min内稳定性良好。

③重复性试验。精密称取坚杆火绒草粉末6份，按照1.2.3项下的方法制备供试品溶液，按1.2.5项下标准曲线的制备方法于512nm下测定吸光度值，RSD值为0.94％，表明本方法重复性较好。

④回收率试验。精密称取已知含量的坚杆火绒草粉末6份，每份1g，分别精密加入对照品溶液适量，按1.2.3项下供试品溶液的制备方法制备，按1.2.5项下标准曲线的制备方法于512nm下测定吸光度值，计算得芦丁的平均回收率为97.41％，RSD值为0.88％(n＝6)，说明该方法的准确度好、结果可靠，用此工艺提取坚杆火绒草中总黄酮是可取的。

1.2.7不同采收期坚杆火绒草不同植物部位总黄酮的含量测定

精密称取不同采收期坚杆火绒草不同部位的粉末各1g，分别各取3个样本，按1.2.3项下供试品溶液的制备方法制备，按1.2.5项下标准曲线的制备方法于512nm下测定吸光度值，再由标准曲线计算各样品中总黄酮的平均含量。

1.2.8单因素试验法优化坚杆火绒草总黄酮的提取工艺

①提取溶剂。精密称取坚杆火绒草粉末(过四号筛)1g，9份，分别于150mL锥形瓶中加入蒸馏水、浓度10％、30％、50％、60％、70％、80％、95％和无水乙醇各50mL，然后按1.2.3项下供试品溶液的制备方法制备，按1.2.5项下标准曲线的制备方法于512nm下测定吸光度值。

②料液比。精密称取坚杆火绒草粉末(过四号筛)1g，5份，分别于150mL锥形瓶中加入70％乙醇溶液30、40、50、60、70mL，然后按1.2.3项下供试品溶液的制备方法制备，按1.2.5项下标准曲线的制备方法于512nm下测定吸光度值。

③提取方式。精密称取坚杆火绒草粉末(过四号筛)1g，5份，分别于150mL锥形瓶中加入70％乙醇溶液50mL，依次进行直接水浴回流提取、超声提取、35℃超声辅助提取0.5h后再水浴回流提取、35℃超声辅助提取1h后再水浴回流提取、60℃超声辅助提取0.5h后再水浴回流提取，各重复3次，然后分别合并所得滤液，加浓度70％乙醇定容于250mL容量瓶中，摇匀，按1.2.5项下标准曲线的制备方法于512nm下测定吸光度值。

④提取次数。精密称取坚杆火绒草粉末(过四号筛)1g，5份，分别于150mL锥形瓶中加入浓度70％乙醇溶液50mL，先35℃超声处理0.5h，再转移至150mL圆底烧瓶中水浴回流提取1h，分别重复提取1，2，3，4，5次，然后分别合并所得滤液，加70％乙醇定容于250mL容量瓶中，摇匀，按1.2.5项下标准曲线的制备方法于512nm下测定吸光度值。

2结果与分析

2.1单因素试验法优化坚杆火绒草总黄酮的提取工艺

2.1.1提取溶剂的选择

试验结果以体积分数70％乙醇溶液为提取溶剂时，坚杆火绒草总黄酮提取得率最高。因此，确定70％乙醇溶液提取效果最好。

2.1.2料液比的选择

试验结果表明：随着料液比的增加，总黄酮含量逐渐升高，当料液比超过1g:50mL后，总黄酮含量几乎不再增加。因此，确定适宜的料液比为1g:50mL(简写为1:50)。

2.1.3提取方式的选择

试验结果表明：以35℃超声辅助提取0.5h，再水浴回流的方式进行提取，坚杆火绒草总黄酮得率最高。因此，确定35℃超声提取0.5h后再水浴回流提取为最佳提取方式。

2.1.4提取次数的选择

在确定了超声后再回流的提取方式下，对回流次数进行了考察。试验结果表明：随着回流次数的增加，总黄酮含量先是逐渐升高，然后趋于平稳，当回流提取3次后总黄酮含量几乎不再增加。因此，确定适宜的提取次数为3次。

通过单因素试验法，最终确定了坚杆火绒草总黄酮的最佳提取工艺为：乙醇体积分数70％，料液比1g:50mL，35℃超声波(40kHz、250W)辅助处理0.5h后再水浴回流提取3次每次1h，优选工艺条件下，坚杆火绒草花期的叶中总黄酮提取率高达310.441mg.g^-1。

2.2不同采收期坚杆火绒草不同植物部位总黄酮的含量

如图1所示，坚杆火绒草总黄酮含量随采收期的不同而变化，花期总黄酮含量明显高于果期；同一植株不同部位总黄酮的含量差异较大，花期坚杆火绒草的叶总黄酮含量最高，平均高达310.441mg.g^-1，花部位次之。

三、结论与讨论

本发明提取方法总黄酮提取得率高、含量测定方法准确度高、操作简单，可作为一种高效便捷测定坚杆火绒草中总黄酮含量的方法。

本发明同时对坚杆火绒草不同采收期、不同植物部位中黄酮类化合物进行了提取和含量测定比较，实验结果均表明，花期的总黄酮含量均明显高于果期，同一植株不同部位总黄酮的含量差异均较大，花期采收的坚杆火绒草叶和花中总黄酮含量均明显高于其他部位。因此，试验确定了总黄酮可以作为坚杆火绒草最佳采收期及最佳药用部位的评价指标，为坚杆火绒草中的开发利用及质量控制提供了试验基础；同时试验也验证了“藏医临床火灸材料坚杆火绒草以花期为最佳采收期”的正确性，并进一步确定了其最佳药用部位应为叶和花，从而为藏医临床安全合理用药提供科学理论依据。

实施例2 本发明绿原酸、咖啡酸和木犀草素的UPLC检测方法

1、材料与试药

1.1仪器

Waters Acquity H-Class超高效液相色谱仪(美国Waters公司)；Milli-Q超纯水机(美国Millipore公司)；DHG-9246A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏试验设备有限公司)；JY-02多功能粉碎机(永康浩瀚工贸有限公司)；METTLER TOLEDO TYPE AE240S电子分析天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；KQ-5200E型超声波清洗器(40kHz、250W，昆山超声仪器有限公司)。

1.2试剂

绿原酸对照品(批号：MUST-14091701，成都曼思特生物科技有限公司)；咖啡酸对照品(批号：MUST-14100803，成都曼思特生物科技有限公司)；木犀草素对照品(批号：111520-201201，中国药品生物制品检定所)；乙腈为色谱纯(美国迪马公司)；水为超纯水；甲醇、无水乙醇、磷酸为分析纯(成都市科龙化工试剂厂)。

1.3药材来源

试验用12批坚杆火绒草原药材分别于2013～2014年间采收于海拔3000～5000米的青藏高原地区，并经西南民族大学民族医药研究院刘圆教授鉴定为菊科植物坚杆火绒草L.franchetii Beauv.；5批灸绒炮制品分别来自全国藏区各大藏医院及民间收集；3批灸柱均来自阿坝州马尔康藏医院，分别为坚杆火绒草绒制作的灸柱、坚杆火绒草绒水煮后晒干制作的灸柱、中药艾叶制作的灸柱，具体来源信息见表1。12批原药材样品用水洗净晒干，在60℃电热恒温鼓风干燥箱中烘干后，粉碎后过四号筛，得坚杆火绒草粉末。

表1坚杆火绒草采样来源

2、色谱条件

2.1检测波长的选择

利用PDA检测器对样品和对照品中的绿原酸、咖啡酸和木犀草素在200～400nm扫描，基于绿原酸在217.7nm和325.8nm，咖啡酸在217.7nm和323.5nm，木犀草素在254.4nm和349.2nm处都有最大吸收，综合考虑，故选用分段多波长测定法，见表2。

2.2流动相的选择

实验过程中考察了①乙腈-水；②甲醇-水；③甲醇-0.05％磷酸水；④甲醇-0.10％磷酸水；⑤甲醇-0.20％磷酸水；⑥甲醇-0.35％磷酸水；⑦甲醇-0.50％磷酸水，结果发现以甲醇-0.10％磷酸水作为流动相分离效果较好，故选择④甲醇-0.10％磷酸水作为流动相系统。如图2及图2续。

2.3柱温的选择

分别考察柱温25℃、30℃、35℃、40℃、45℃的色谱图，发现柱温为35℃整体分离效果较好，分析时间合适，如图3及图3续。

2.4流速的选择

考察了流速为0.1mL.min^-1、0.2mL.min^-1、0.3mL.min^-1的色谱图，结果发现0.2mL.min^-1的流速分离效果最好，如图4。

通过实验确定色谱条件为：ACQUITY BEH C18色谱柱(2.1mm×50mm，1.7μm)；流动相：A为甲醇，B为0.1％磷酸水；柱温35℃；流速：0.2mL.min^-1；进样量：1μL。分段检测波长及梯度洗脱程序见表2，样品和混合对照品UPLC图见图5。

表2分段检测波长及梯度洗脱程序

3、对照品溶液的制备

分别精密称取绿原酸、咖啡酸、木犀草素对照品适量，置25mL容量瓶中，加甲醇溶解，制成质量浓度分别为0.46mg.mL^-1绿原酸对照品储备液、质量浓度为1.00mg.mL^-1咖啡酸对照品储备液和质量浓度分别为0.09mg.mL^-1木犀草素对照品储备液。

4、标准曲线的绘制

精密吸取绿原酸、咖啡酸和木犀草素对照品储备液适量，加甲醇稀释、定容，得混合对照品储备液。分别取上述溶液0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、1.5、2.0mL，分别置于10mL量瓶中，用甲醇稀释成标准系列溶液。按色谱条件测定各色谱峰峰面积，以进样量(μg)为横坐标(X)、色谱峰峰面积A为纵坐标(Y)绘制标准曲线，并计算回归方程和线性范围，结果见表3。

表3 3种成分的回归方程、线性范围及检出限

5、方法学考察

5.1精密度试验

精密吸取同一混合对照品溶液，按选定色谱条件测定，重复进样6次，测定绿原酸、咖啡酸和木犀草素的峰面积，峰面积的RSD分别为0.82％、1.67％和0.90％，即均小于2％，表明仪器精密度良好。

5.2重复性试验

取同一批次坚杆火绒草粉末(过四号筛)1.0g，精密称定，按供试品溶液制备方法制备，按选定色谱条件测定峰面积，绿原酸、咖啡酸和木犀草素含量的RSD分别为0.24％、1.32％、1.21％，即均小于2％，表明样品重复性良好。

5.3稳定性试验

精密吸取坚杆火绒草样品溶液，按选定色谱条件测定，分别于1、3、5、7、12、24h进样测定峰面积，绿原酸、咖啡酸和木犀草素含量的RSD分别为0.38％、1.44％、1.35％，即均小于2％，表明样品稳定性良好。

5.4加样回收率试验

取已知含量的坚杆火绒草粉末(过四号筛)0.5g，精密称定9份，加入为已知含量样品中绿原酸、咖啡酸和木犀草素含量80％、100％、120％的对照品，按供试品溶液制备方法制备，按选定色谱方法测定，计算加样回收率。结果绿原酸、咖啡酸和木犀草素的平均回收率分别为99.8％、97.6％和98.3％，RSD分别为1.22％、1.90％、1.69％。

6、提取工艺筛选

6.1提取溶剂的选择

根据绿原酸、咖啡酸和木犀草素的溶解性考虑，结合文献分析，确定甲醇(含5％甲酸)、体积分数50％甲醇、体积分数50％乙醇和水为提取溶剂考察对象。取坚杆火绒草粉末(过四号筛)1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别加入上述4种溶剂各50mL，称定重量，浸泡过夜后超声处理30min，冷却，再称定重量，补足减失重量，摇匀，过滤，得供试品溶液。按选定色谱条件进行测定，结果见表4。

表4不同提取溶剂考察结果

从结果可以看出，综合3种成分的提取量，以体积分数50％甲醇提取效果较好，故选择提取溶剂为体积分数50％甲醇。

6.2提取方法的选择

超声提取：取坚杆火绒草粉末(过四号筛)1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加体积分数50％甲醇50mL，称定重量，超声处理30min，冷却，再称定重量，补足减失重量，摇匀，过滤，得供试品溶液。

回流提取：取坚杆火绒草粉末(过四号筛)1.0g，精密称定，置圆底烧瓶中，加体积分数50％甲醇50mL，称定重量，水浴回流30min，冷却，再称定重量，补足减失重量，摇匀，过滤，得供试品溶液。

冷浸提取：取坚杆火绒草粉末(过四号筛)1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加体积分数50％甲醇50mL，称定重量，于室温中浸泡48h，称定重量，补足减失重量，摇匀，过滤，得供试品溶液。

冷浸后超声提取：取坚杆火绒草粉末(过四号筛)1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加体积分数50％甲醇50mL，称定重量，浸泡过夜后超声处理30min，冷却，再称定重量，补足减失重量，摇匀，过滤，得供试品溶液。

上述样品按选定色谱条件测定，结果见表5。

表5不同提取方法考察结果

从结果可以看出，综合3种成分的提取量，冷浸后超声提取法较其它几种方法好，故选择冷浸后超声提取法。

6.3超声时间的选择

取坚杆火绒草粉末(过四号筛)1.0g，6份，精密称定，置具塞锥形瓶中，加体积分数50％甲醇50mL，称定重量，浸泡过夜后分别超声处理10min、20min、30min、40min、50min、60min，冷却，再称定重量，补足减失重量，摇匀，过滤，得供试品溶液。按选定色谱条件测定，结果见表6。

表6不同超声时间考察结果

从结果可以看出，超声30min和40min提取效果没有明显差异，继续增加超声时间可能由于温度升高，不利于溶出，或成分可能发生改变，故选择超声时间30min。

供试品溶液制备方法为：取坚杆火绒草粉末(过四号筛)1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加体积分数50％甲醇50mL，称定重量，浸泡过夜后超声处理30min，冷却，再称定重量，补足减失重量，摇匀，过滤即得。

7、样品含量测定及结果

7.1坚杆火绒草药材的含量测定

精密称取坚杆火绒草不同产地、不同采收期、不同植物部位样品粉末(过四号筛)1.0g，按供试品溶液制备方法制备，按选定色谱条件测定，计算绿原酸、咖啡酸和木犀草素的含量，测定结果见表7。

表71坚杆火绒草不同产地、不同采收期、不同植物部位绿原酸、咖啡酸和木犀草素的含量测定结果(M±SD，n＝3)

注：“/”指含量值小于LOQ

7.2坚杆火绒草不同炮制品的含量测定

精密称取坚杆火绒草不同灸绒炮制品及不同灸柱样品各1.0g，按供试品溶液制备方法制备，按前述色谱条件测定，计算绿原酸、咖啡酸和木犀草素的含量，结果见表8。

表8坚杆火绒草不同灸绒炮制品及不同灸柱样品中绿原酸、咖啡酸和木犀草素的含量测定结果(M±SD，n＝3)

小结

本发明中首次发现了坚杆火绒草中含有绿原酸、咖啡酸和木犀草素这三个化学成分，并对坚杆火绒草不同产地、不同采收期、不同植物部位中绿原酸、咖啡酸和木犀草素含量进行同时测定：

①由试验结果可以看出，坚杆火绒草不同产地、不同采收期、不同植物部位中绿原酸、咖啡酸和木犀草素的含量存在很大差异性。

②坚杆火绒草同一植株叶、花和种部位中绿原酸和咖啡酸的含量明显高于根和茎。

③坚杆火绒草的根和茎部位均未检测到有木犀草素，而花和种部位均含有木犀草素，同时，在7、8月份采收的坚杆火绒草的叶子部位也检测到了较低含量的木犀草素，9月份采收的则未检测到。

④5种灸绒炮制品中，绿原酸和咖啡酸含量以甘肃省藏医院的最高，以甘孜州藏医院的最低；而木犀草素的含量则以甘孜州藏医院的最高，民间收集的最低。

⑤藏药坚杆火绒草做的灸柱中绿原酸、咖啡酸和木犀草素的含量明显高于中药艾叶；灸绒水煮后晒干的过程中严重破坏了药材中的有效成分，含量很低。

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Claims (15)

1.坚杆火绒草或其炮制品中绿原酸、咖啡酸、木犀草素三种成分的UPLC检测方法，其特征在于：它包括如下操作步骤：

(1)取待检样品，加40～60％v/v甲醇提取，收集提取液，制备供试品溶液；

(2)取绿原酸、咖啡酸、木犀草素三种的混合物，制备对照品溶液；

(3)将供试品溶液、对照品溶液分别注入超高效液相色谱仪中，采用外标法检测即可；其中，色谱条件如下：

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填料

检测波长和流动相条件如下：

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(1)中，甲醇浓度为45～55％v/v。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：甲醇浓度为50％v/v。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(1)中，甲醇提取的方式为冷浸后超声提取。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：步骤(1)中，冷浸时间为8h以上，超声提取时间为30～40min。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：冷浸时间为8～12h。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(2)中，对照品溶液的溶剂选自甲醇或甲醇水溶液。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(3)中，所述色谱柱填料的粒径为1.7～3.5μm。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于：所述色谱柱填料的粒径为1.7～1.8μm。

10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于：所述色谱柱填料的粒径为1.7μm。

11.根据权利要求1或8所述的检测方法，其特征在于：所述色谱柱尺寸为：2.1×50mm。

12.根据权利要求11所述的检测方法，其特征在于：所述色谱柱的型号为：ACQUITYUPLC BEH C18色谱柱。

13.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述流动相流速为0.2mL.min^-1；色谱柱柱温为35℃。

14.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述待检样品为菊科火绒草属植物坚杆火绒草Leontopodium franchetii Beauv.的根、茎、叶、花、种子或全草。

15.坚杆火绒草或其炮制品的质量检测方法，其特征在于：它是采用UPLC法进行检测的，包括如下操作步骤：

(1)取待检样品，加40～60％v/v甲醇提取，收集提取液，制备供试品溶液；

(2)将供试品溶液注入超高效液相色谱仪中，检测即可；其中，色谱条件如下：

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填料

检测波长和流动相条件如下：