CN104391072B - 一种治疗骨质疏松症的中药复方制剂的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种治疗骨质疏松症中药复方制剂的检测方法，包括以下步骤：1)以杜仲为对照药材，以松脂醇二葡萄糖苷、京尼平苷酸为对照品，采用薄层色谱法对该中药复方制剂中的杜仲进行定性鉴别；2)以牛膝为对照药材，β‑蜕皮甾酮为对照品，采用薄层色谱法对该中药复方制剂中的牛膝进行定性鉴别；3)以枸杞子为对照药材，采用薄层色谱法对该中药复方制剂中的枸杞子进行定性鉴别；4)采用高效液相色谱法对该中药复方制剂中的淫羊藿苷、龙胆苦苷、马钱苷酸三个活性成分(或指标成分)进行含量测定。本发明能够很好地控制这种中药复方制剂的质量，监控产品生产工艺的稳定性，保证其质量的稳定、均一、可控。

Description

一种治疗骨质疏松症的中药复方制剂的检测方法

技术领域

本发明涉及一种中药复方制剂的检测方法，具体涉及一种治疗骨质疏松症中药复方制剂的检测方法，属于药物分析技术领域。

背景技术

益骨方由淫羊藿、秦艽、杜仲、牛膝、枸杞子等药材组成，其功能主治为补骨生髓，活血止痛，用于肝肾不足，瘀血阻络所致骨质疏松症，症见腰膝酸软，疼痛，临床上主要用于预防和治疗骨质疏松症。方中以淫羊藿为君药，温补肾阳、祛风通络。杜仲补肝肾、强筋骨，秦艽通络止痛以为臣。佐药选用枸杞子补肾益精，养肝补血，加强君臣药物补肝肾，养精血，活血脉，止痹痛的功效。使药选用牛膝，具有补肝肾、强筋骨兼活血化瘀功效，对因虚而致瘀阻者，发挥治标之用。以益骨方制成治疗骨质疏松症的中药复方制剂其药味多、成分复杂，产品质量较难控制。

目前，《中国药典》2010年版一部虽有收载方中淫羊藿药材中淫羊藿苷的含量测定方法和秦艽药材中龙胆苦苷、马钱苷酸的含量测定方法，但这些方法仅限于单味药材的含量测定，不适用于以益骨方制成的中药复方制剂中活性成分(或指标成分)的含量测定。薄层色谱鉴别方面，《中国药典》2010年版一部收载的杜仲药材质量标准中未有薄层色谱鉴别项，牛膝和枸杞子质量标准中虽有薄层色谱鉴别项，但也是仅限于单味药材的鉴别，不适用于以益骨方制成的中药复方制剂的薄层色谱鉴别。此外，通过相关文献检索，虽也有报道含淫羊藿或秦艽药材的中药复方制剂中相关成分的含量测定，以及一些中药复方制剂中关于杜仲、牛膝或枸杞子的薄层色谱鉴别，但这些方法也均不适用于以益骨方制成的中药复方制剂的质量控制。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的旨在提供一种治疗骨质疏松症中药复方制剂的检测方法，通过上述检测方法能够很好地控制这种中药复方制剂的质量，监控产品生产工艺的稳定性，保证其质量的稳定、均一、可控。此外，该质量控制方法还具有简便、专属性和可操作性强、重复性好等优点。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种治疗骨质疏松症中药复方制剂的检测方法，所述治疗骨质疏松症中药复方制剂是指益骨方提取物或以益骨方提取物制成的中药复方制剂，其特征在于包括以下步骤：

1)杜仲的薄层色谱鉴别方法：以杜仲为对照药材，以松脂醇二葡萄糖苷、京尼平苷酸为对照品，采用薄层色谱法对该中药复方制剂中的杜仲进行定性鉴别；

2)牛膝的薄层色谱鉴别方法：以牛膝为对照药材，β-蜕皮甾酮为对照品，采用薄层色谱法对该中药复方制剂中的牛膝进行定性鉴别；

3)枸杞子的薄层色谱鉴别方法为：以枸杞子为对照药材，采用薄层色谱法对该中药复方制剂中的枸杞子进行定性鉴别；

4)淫羊藿苷、龙胆苦苷、马钱苷酸的含量测定方法：采用高效液相色谱法对该中药复方制剂中的淫羊藿苷、龙胆苦苷、马钱苷酸三个活性成分(或指标成分)进行含量测定。

实现本发明的目的还可以通过采取如下技术方案达到：

作为优选，所述治疗骨质疏松症中药复方制剂的检测方法，包括以下步骤：

1)杜仲的薄层色谱鉴别方法,其具体步骤如下：

1-1)供试品溶液的制备：取益骨方提取物或以益骨方提取物制成的固体制剂粉末，加入提取溶剂，提取溶剂的加入量与益骨方提取物或以益骨方提取物制成的固体制剂粉末取样量的体积质量比，以ml/g计为25:1,超声处理0.5～2小时或加热回流0.5～1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水30ml使溶解，用乙酸乙酯振摇提取2～3次，每次20ml，弃去乙酸乙酯液，水溶液用以水饱和的正丁醇振摇提取2～3次，每次20ml，合并正丁醇提取液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；

1-2)对照药材溶液的制备：取杜仲对照药材，按步骤1-1)所述的供试品溶液的制备方法制成对照药材溶液；

1-3)对照品溶液的制备：取松脂醇二葡萄糖苷对照品、京尼平苷酸对照品，加甲醇分别制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；

1-4)鉴别：照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液与对照药材溶液各5～10μl，对照品溶液5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以展开剂展开，取出，晾干，喷以5％香草醛的10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；其中，所述的展开剂为体积比为7～5:1:0.1的乙酸乙酯-甲醇-甲酸；

其中，所述5％香草醛的10％硫酸乙醇溶液的制备方法：取10ml硫酸加乙醇稀释至100ml，摇匀备用，再取香草醛5g，加上述溶液至100ml，使溶解即得。

2)牛膝的薄层色谱鉴别方法，其具体步骤如下：

2-1)供试品溶液的制备：取益骨方提取物或以益骨方提取物制成的固体制剂粉末，加入提取溶剂，提取溶剂的加入量与益骨方提取物或以益骨方提取物制成的固体制剂粉末取样量的体积质量比，以ml/g计为25:1,超声处理1～3小时或加热回流0.5～2小时，滤过，滤液浓缩至1ml，加100～200目的中性氧化铝2g，拌匀，加在100～200目、10g、内径为1.5cm的中性氧化铝柱上，用100ml溶剂洗脱，收集洗脱液，浓缩至1ml，作为供试品溶液；

2-2)对照药材溶液的制备：取牛膝对照药材，按步骤2-1)所述的供试品溶液的制备方法制成对照药材溶液；

2-3)对照品溶液的制备：取β-蜕皮甾酮对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；

2-4)鉴别：照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液与对照药材溶液各5～10μl，对照品溶液5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以展开剂展开，取出，晾干，喷以5％香草醛的10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；其中，所述的展开剂为体积比为7～5:5:0.4:0.05的环己烷-乙酸乙酯-甲酸-水；

其中，所述5％香草醛的10％硫酸乙醇溶液的制备方法：取10ml硫酸加乙醇稀释至100ml，摇匀备用，再取香草醛5g，加上述溶液至100ml，使溶解即得。

3)枸杞子的薄层色谱鉴别方法，其具体步骤如下：

3-1)供试品溶液的制备：取益骨方提取物或以益骨方提取物制成的固体制剂粉末，加入提取溶剂，提取溶剂的加入量与益骨方提取物或以益骨方提取物制成的固体制剂粉末取样量的体积质量比，以ml/g计为20:1,超声处理30～90分钟或加热回流15～60分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，加100～200目的硅胶2g，在水浴上拌匀、干燥，加在100～200目、8g、内径为1cm的硅胶柱上，用体积比为8～6:6的石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯洗脱，弃去前洗液，收集续洗液，浓缩至1ml，作为供试品溶液；

3-2)对照药材溶液的制备：取枸杞子对照药材，加水，加热煮沸或加热超声，放冷，滤过，滤液用乙酸乙酯振摇提取，分取乙酸乙酯液，浓缩至1ml，作为对照药材溶液；

3-3)鉴别：照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液2～5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以展开剂展开，取出，晾干，置于365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；其中，所述的展开剂为体积比为8～6:6:1:0.1的石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯-甲醇-冰醋酸；

4)淫羊藿苷、龙胆苦苷、马钱苷酸的含量测定方法，其具体步骤如下：

4-1)供试品溶液的制备：取益骨方提取物或以益骨方提取物制成的固体制剂粉末适量，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入提取溶剂，提取溶剂的加入量与益骨方提取物或以益骨方提取物制成的固体制剂粉末取样量的体积质量比，以ml/g计为40:1,密塞，称定重量，超声处理0.5～2小时或加热回流0.5～1.5小时，放冷，再称定重量，用相应的提取溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

4-2)对照品溶液的制备：取淫羊藿苷对照品、龙胆苦苷对照品、马钱苷酸对照品适量，精密称定，加入溶剂制成淫羊藿苷浓度为4.072-101.8μg/ml、龙胆苦苷浓度为20.252-506.3μg/ml、马钱苷酸浓度为4.044-101.1μg/ml的混合溶液，即得；

4-3)色谱条件与系统适用性试验：色谱柱为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C18柱；采用梯度洗脱，流动相A为乙腈或甲醇，流动相B为水或酸水溶液；检测波长为205nm～300nm；柱温为25℃～35℃；理论板数按淫羊藿苷峰计算应不低于1500；

4-4)测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

作为优选，在步骤1-1)中所述的提取溶剂是甲醇或乙醇。

作为优选，在步骤1-4)中所述的展开剂为体积比为6:1:0.1的乙酸乙酯-甲醇-甲酸。

作为优选，在步骤2-1)中所述的提取溶剂是浓度为80％的甲醇或浓度为80％的乙醇；所述的洗脱溶剂是甲醇或乙醇。

作为优选，在步骤2-4)中所述的展开剂为体积比为6:5:0.4:0.05的环己烷-乙酸乙酯-甲酸-水。

作为优选，在步骤3-1)中所述的提取溶剂是浓度为80％～100％的甲醇；所述的洗脱液石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯的体积比为7:6。

作为优选，在步骤3-2)中加热煮沸的时间为15～60分钟或加热超声的时间为30～90分钟。

作为优选，在步骤3-3)中所述的展开剂为体积比为7:6:1:0.1的石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯-甲醇-冰醋酸。

作为优选，在步骤4-1)中所述的提取溶剂是浓度为50％～70％的甲醇或浓度为50％～70％的乙醇。

作为优选，在步骤4-2)中所述的溶剂为60％甲醇或甲醇。

作为优选，在步骤4-3)中所述的流动相B酸水溶液中的酸是冰醋酸、磷酸或甲酸，所述酸水溶液中酸与水的体积比为0.1～0.5:100。

作为优选，在步骤4-3中检测波长为254nm。

作为优选，在步骤4-3)中所述的梯度洗脱程序如下,其中流动相的比例均为体积百分比:

0～5分钟，流动相A为9％→11％，流动相B为91％→89％；

5～20分钟，流动相A为11％→25％，流动相B为89％→75％；

20～25分钟，流动相A为25％→30％，流动相B为75％→70％；

25～35分钟，流动相A为30％，流动相B为70％。

本发明的有益效果在于：

1、本发明在薄层色谱鉴别方面进行了改进，《中国药典》2010年版一部收载的杜仲药材质量标准中未有薄层色谱鉴别项，牛膝和枸杞子质量标准中虽有薄层色谱鉴别项，但也是仅限于单味药材的鉴别。此外，通过相关文献检索，虽也有报道一些中药复方制剂中关于杜仲、牛膝或枸杞子的薄层色谱鉴别，但这些方法均不适用于以益骨方制成的中药复方制剂的质量控制，且方法中使用到三氯甲烷、苯等毒性大的化学试剂，不符合中药质量标准研究制定技术要求中的绿色环保要求。本发明采用《中国药典》2010年版一部及文献中关于这几味药材的薄层色谱鉴别方法，但供试品色谱中在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，无相应的斑点或斑点不清晰或阴性对照有干扰。针对这些不足之处，本发明从供试品溶液制备、展开剂的选择上、阴性对照干扰的排除上通过大量创造性的劳动建立了治疗骨质疏松症的益骨方或用益骨方制成的颗粒剂、胶囊剂、片剂等剂型中的杜仲(包括指标成分或有效成分松脂醇二葡萄糖苷、京尼平苷酸)、牛膝(包括指标成分或有效成分β-蜕皮甾酮)、枸杞子的薄层色谱鉴别方法，使该复方制剂中的内含成分通过分离达到直观、可视化，且建立的方法承载信息大、专属性强、耐用性好，方法中未使用三氯甲烷、苯等毒性大的化学试剂，大大提高了操作过程中的安全性，也符合中药质量标准研究制定技术要求中的绿色环保要求。

2、本发明在含量测定方面进行了改进，由于现有技术都是采用高效液相色谱法分别单独对淫羊藿药材、秦艽药材及含淫羊藿或秦艽药材的中药复方制剂中的淫羊藿苷或龙胆苦苷进行含量测定，只涉及到单味药材或单个复方制剂中单一成分的含量测定，且方法中采用的流动相系统相对简单，而本发明中以益骨方制成的中药复方制剂中药味多，成分复杂，影响测定的干扰因素较多，采用现有技术无法使该中药复方制剂中的有效成分(或指标成分)淫羊藿苷、龙胆苦苷及马钱苷酸得到有效分离，因此更无法实现在同一色谱条件下同时对这三个成分进行定量测定。本发明克服了现有技术的不足，从供试品溶液制备、色谱条件、流动相系统的选择上通过大量创造性的劳动成功地实现了对方中淫羊藿中的淫羊藿苷、秦艽中的龙胆苦苷和马钱苷酸三个活性成分(或指标成分)在同一色谱条件下同时进行快速的定量测定。该HPLC法采用梯度洗脱程序使样品中这三个成分得到有效分离，成功地实现了在同一色谱条件下对中药复方制剂中三个成分同时进行快速的定量测定，大大提高了检测效率。此外，该含量测定方法对样品的预处理快速、方便、易操作。

通过上述检测方法能够很好地控制这种中药复方制剂的质量，监控产品生产工艺的稳定性，保证其质量的稳定、均一、可控。此外，该质量控制方法还具有简便、专属性和可操作性强、重复性好等优点，方法中设置的检测项目科学、建立的检测方法可靠、规定的判断标准合理，充分反映了该产品质量控制的关键点，既保证了产品质量，又提高了产品生产质量的可控性。

附图说明

图1是益骨方中杜仲的薄层色谱鉴别图谱，图中1～3为三批益骨方供试品，4为杜仲对照药材，5为松脂醇二葡萄糖苷对照品，6为京尼平苷酸对照品，7为杜仲阴性对照。

图2是益骨方中牛膝的薄层色谱鉴别图谱，图中1～3为三批益骨方供试品，4为牛膝对照药材，5为β-蜕皮甾酮对照品，6为牛膝阴性对照。

图3是益骨方中枸杞子的薄层色谱鉴别图谱，图中1～3为三批益骨方供试品，4为枸杞子对照药材，5为枸杞子阴性对照。

图4是淫羊藿苷、龙胆苦苷、马钱苷酸对照品HPLC色谱图。

图5是益骨方供试品HPLC色谱图。

图6是益骨方缺淫羊藿、秦艽阴性样品HPLC色谱图。

具体实施方式

本发明提供的质量控制方法中所用试剂均为市售，其中用于薄层色谱鉴别的试剂为分析纯，用于含量测定的乙腈和甲醇为色谱纯，益骨方提取物或用益骨方提取物制成的固体制剂由广州白云山敬修堂药业股份有限公司提供，对照药材及对照品均购自中国食品药品检定研究院。

实施例1：

一、杜仲的薄层色谱鉴别

供试品溶液的制备：取益骨方粉末1g，加甲醇25ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水30ml使溶解，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次20ml，弃去乙酸乙酯液，水溶液用以水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次20ml，合并正丁醇提取液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。

对照药材溶液的制备：取杜仲对照药材，按供试品溶液的制备方法制成对照药材溶液。

对照品溶液的制备：取松脂醇二葡萄糖苷对照品、京尼平苷酸对照品，加甲醇分别制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。

鉴别：照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液与对照药材溶液各10μl，对照品溶液5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-甲酸(6:1:0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛的10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

薄层色谱鉴别耐用性考察：分别考察了不同点样量、室温条件下(30℃)、低温条件下(4℃)、低湿条件下(相对湿度20％)、高湿条件下(相对湿度75％)以及预制板和手铺板的鉴别效果，试验结果显示，各条件下主斑点分离效果均好，表明该鉴别方法可操作性强、重复性好，具有良好的耐用性。

专属性考察：按处方称取除杜仲以外的药材，按制备工艺制成阴性样品。取阴性样品粉末，按上述供试品溶液的制备方法制成杜仲阴性对照溶液。吸取上述供试品溶液、对照药材溶液、对照品溶液以及杜仲阴性对照溶液，按上述薄层色谱鉴别方法进行鉴别。试验结果表明，阴性对照无干扰，说明该鉴别方法具有较好的专属性。结果见附图1。

实施例2：具体操作步骤同实施例1，不同的是供试品溶液的制备过程中，加热回流1小时。

实施例3：具体操作步骤同实施例1，不同的是供试品溶液的制备过程中，加乙醇25ml，超声处理2小时。

实施例4：具体操作步骤同实施例1，不同的是供试品溶液的制备过程中，用乙酸乙酯振摇提取3次，每次20ml，弃去乙酸乙酯液，水溶液用以水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20ml。

实施例5：具体操作步骤同实施例1，不同的是鉴别过程中以乙酸乙酯-甲醇-甲酸(7:1:0.1)为展开剂。

实施例6：具体操作步骤同实施例1，不同的是鉴别过程中以乙酸乙酯-甲醇-甲酸(5:1:0.1)为展开剂。

实施例7：具体操作步骤同实施例1，不同的是供试品溶液的制备过程中，供试品为用益骨方制成的颗粒剂、胶囊剂、片剂经粉碎后所得。

实施例8：

二、牛膝的薄层色谱鉴别

供试品溶液的制备：取益骨方粉末1g，加80％甲醇25ml，超声处理1小时，滤过，滤液浓缩至1ml，加中性氧化铝(100～200目)2g，拌匀，加在中性氧化铝柱(100～200目，10g，内径为1.5cm)上，用甲醇100ml洗脱，收集洗脱液，浓缩至1ml，作为供试品溶液。

对照药材溶液的制备：取牛膝对照药材，按供试品溶液的制备方法制成对照药材溶液。

对照品溶液的制备：取β-蜕皮甾酮对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。

鉴别：照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液10μl，对照药材溶液与对照品溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-甲酸-水(6:5:0.4:0.05)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛的10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

薄层色谱鉴别耐用性考察：分别考察了不同点样量、室温条件下(30℃)、低温条件下(4℃)、低湿条件下(相对湿度20％)、高湿条件下(相对湿度75％)以及预制板和手铺板的鉴别效果，试验结果显示，各条件下主斑点分离效果均好，表明该鉴别方法可操作性强、重复性好，具有良好的耐用性。

专属性考察：按处方称取除牛膝以外的药材，按制备工艺制成阴性样品。取阴性样品粉末，按上述供试品溶液的制备方法制成牛膝阴性对照溶液。吸取上述供试品溶液、对照药材溶液、对照品溶液以及牛膝阴性对照溶液，按上述薄层色谱鉴别方法进行鉴别。试验结果表明，阴性对照无干扰，说明该鉴别方法具有较好的专属性。结果见附图2。

实施例9：具体操作步骤同实施例8，不同的是供试品溶液的制备过程中，加热回流2小时。

实施例10：具体操作步骤同实施例8，不同的是供试品溶液的制备过程中，加80％乙醇25ml，超声处理3小时，洗脱溶剂用乙醇。

实施例11：具体操作步骤同实施例8，不同的是供试品溶液的制备过程中，加80％乙醇25ml，加热回流30分钟，洗脱溶剂用乙醇。

实施例12：具体操作步骤同实施例8，不同的是鉴别过程中以环己烷-乙酸乙酯-甲酸-水(7:5:0.4:0.05)为展开剂。

实施例13：具体操作步骤同实施例8，不同的是鉴别过程中以环己烷-乙酸乙酯-甲酸-水(5:5:0.4:0.05)为展开剂。

实施例14：具体操作步骤同实施例8，不同的是供试品溶液的制备过程中，供试品为用益骨方制成的颗粒剂、胶囊剂、片剂经粉碎后所得。

实施例15：

三、枸杞子的薄层色谱鉴别

供试品溶液的制备：取益骨方粉末1g，加80％甲醇20ml,超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，加硅胶(100～200目)2g，在水浴上拌匀、干燥，加在硅胶柱(100～200目，8g，内径为1cm)上，用体积比为7:6的石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯100ml洗脱，弃去前洗液30ml，收集续洗液，浓缩至1ml，作为供试品溶液。

对照药材溶液的制备：取枸杞子对照药材0.5g，加水35ml，加热煮沸15分钟，放冷，滤过，滤液用乙酸乙酯15ml振摇提取，分取乙酸乙酯液，浓缩至1ml，作为对照药材溶液。

鉴别：照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液与对照药材溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯-甲醇-冰醋酸(7:6:1:0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

薄层色谱鉴别耐用性考察：分别考察了不同点样量、室温条件下(30℃)、低温条件下(4℃)、低湿条件下(相对湿度20％)、高湿条件下(相对湿度75％)以及预制板和手铺板的鉴别效果，试验结果显示，各条件下主斑点分离效果均好，表明该鉴别方法可操作性强、重复性好，具有良好的耐用性。

专属性考察：按处方称取除枸杞子以外的药材，按制备工艺制成阴性样品。取阴性样品粉末，按上述供试品溶液的制备方法制成枸杞子阴性对照溶液。吸取上述供试品溶液、对照药材溶液以及枸杞子阴性对照溶液，按上述薄层色谱鉴别方法进行鉴别。试验结果表明，阴性对照无干扰，说明该鉴别方法具有较好的专属性。结果见附图3。

实施例16：具体操作步骤同实施例15，不同的是供试品溶液的制备过程中，加甲醇20ml，加热回流1小时。

实施例17：具体操作步骤同实施例15，不同的是供试品溶液的制备过程中，加80％甲醇20ml，超声处理1.5小时，洗脱溶剂用体积比为4:3的石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯。

实施例18：具体操作步骤同实施例15，不同的是供试品溶液的制备过程中，加甲醇20ml，加热回流15分钟，洗脱溶剂用体积比为1:1的石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯。

实施例19：具体操作步骤同实施例15，不同的是对照药材溶液的制备过程中，加热超声30分钟。

实施例20：具体操作步骤同实施例15，不同的是鉴别过程中以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯-甲醇-冰醋酸(8:6:1:0.1)为展开剂。

实施例21：具体操作步骤同实施例15，不同的是鉴别过程中以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯-甲醇-冰醋酸(6:6:1:0.1)为展开剂。

实施例22：具体操作步骤同实施例15，不同的是供试品溶液的制备过程中，供试品为用益骨方制成的颗粒剂、胶囊剂、片剂经粉碎后所得。

实施例23：

四、淫羊藿苷、龙胆苦苷、马钱苷酸的含量测定

供试品溶液的制备：取益骨方粉末约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60％甲醇20ml，密塞，称定重量，超声处理1小时，放冷，再称定重量，用60％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

对照品溶液的制备：取淫羊藿苷对照品、龙胆苦苷对照品、马钱苷酸对照品适量，精密称定，加60％甲醇制成淫羊藿苷浓度为100.9μg/ml、龙胆苦苷浓度为493.7μg/ml、马钱苷酸浓度为96.0μg/ml的混合溶液，即得。

色谱条件与系统适用性试验：色谱柱为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C18柱；以乙腈为流动相A，以0.1％冰醋酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为254nm；柱温为25℃；理论板数按淫羊藿苷峰计算应不低于1500。

测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。梯度洗脱程序见表1。

表1梯度洗脱程序

时间(分钟)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0～5	9→11	91→89
5～20	11→25	89→75
			20～25	25→30	75→70
25～35	30	70

实施例24：具体操作步骤同实施例23，不同的是供试品溶液的制备过程中，以50％甲醇为提取溶剂，超声处理30分钟；色谱条件与系统适用性试验中，流动相B为0.1％磷酸溶液，检测波长为205nm，柱温为30℃。

实施例25：具体操作步骤同实施例23，不同的是供试品溶液的制备过程中，以70％甲醇为提取溶剂，超声处理2小时；色谱条件与系统适用性试验中，流动相B为0.1％甲酸溶液，检测波长为300nm，柱温为35℃。

实施例26：具体操作步骤同实施例23，不同的是供试品溶液的制备过程中，以50％乙醇为提取溶剂，加热回流30分钟；色谱条件与系统适用性试验中，流动相B为0.5％冰醋酸溶液。

实施例27：具体操作步骤同实施例23，不同的是供试品溶液的制备过程中，以70％乙醇为提取溶剂，加热回流1.5小时；色谱条件与系统适用性试验中，流动相B为0.5％磷酸溶液。

实施例28：具体操作步骤同实施例23，不同的是供试品溶液的制备过程中，以60％乙醇为提取溶剂，加热回流1小时；色谱条件与系统适用性试验中，流动相B为0.5％甲酸溶液。

实施例29：具体操作步骤同实施例23，不同的是供试品溶液的制备过程中，加热回流1小时；色谱条件与系统适用性试验中，流动相B为水。

实施例30：具体操作步骤同实施例23，不同的是供试品溶液的制备过程中，以60％乙醇为提取溶剂；色谱条件与系统适用性试验中，流动相A为甲醇，流动相B为水。

实施例31：具体操作步骤同实施例23，不同的是供试品溶液的制备过程中，超声处理30分钟；色谱条件与系统适用性试验中，流动相A为甲醇，流动相B为0.1％磷酸溶液。

实施例32：具体操作步骤同实施例23，不同的是供试品溶液的制备过程中，以70％甲醇为提取溶剂，超声处理30分钟；色谱条件与系统适用性试验中，流动相A为甲醇。

实施例33：具体操作步骤同实施例23，不同的是供试品溶液的制备过程中，以50％甲醇为提取溶剂，加热回流1.5小时；色谱条件与系统适用性试验中，流动相A为甲醇，流动相B为0.1％甲酸溶液。

实施例34：具体操作步骤同实施例23，不同的是供试品溶液的制备过程中，加热回流30分钟；色谱条件与系统适用性试验中，流动相A为甲醇，流动相B为0.5％冰醋酸溶液。

实施例35：具体操作步骤同实施例23，不同的是供试品溶液的制备过程中，以70％乙醇为提取溶剂，超声处理30分钟；色谱条件与系统适用性试验中，流动相A为甲醇，流动相B为0.5％磷酸溶液。

实施例36：具体操作步骤同实施例23，不同的是供试品溶液的制备过程中，以60％乙醇为提取溶剂，超声处理2小时；色谱条件与系统适用性试验中，流动相A为甲醇，流动相B为0.5％甲酸溶液。

实施例37：具体操作步骤同实施例23，不同的是色谱条件与系统适用性试验中，梯度洗脱程序见表2。

表2梯度洗脱程序

时间(分钟)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0～5	9→15	91→85
5～10	15→25	85→75
			10～15	25→30	75→70
15～35	30	70

实施例38：具体操作步骤同实施例23，不同的是色谱条件与系统适用性试验中，梯度洗脱程序见表3。

表3梯度洗脱程序

时间(分钟)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0～5	9→11	91→89
5～15	11→25	89→75
			15～20	25→30	75→70
20～35	30	70

实施例39：具体操作步骤同实施例23，不同的是对照品溶液的制备过程中，以甲醇为溶剂。

实施例40：具体操作步骤同实施例23，不同的是供试品溶液的制备过程中，供试品为用益骨方制成的颗粒剂、胶囊剂、片剂经粉碎后所得。

含量测定方法学验证：

实验材料：益骨方及阴性对照样品均由广州白云山敬修堂药业股份有限公司提供。淫羊藿苷对照品由中国食品药品检定研究院提供，批号为110737-200405。龙胆苦苷对照品由中国食品药品检定研究院提供，批号为110770-201013，含量为96.9％。马钱苷酸对照品由中国食品药品检定研究院提供，批号为111865-201102，含量为93.8％。乙腈为色谱纯，LABSCIENCE公司生产，水为超纯水，其它试剂为分析纯。

仪器：Agilent 1100型高效液相色谱仪，光电二极管阵列检测器(DAD)，色谱柱为Agilent Eclipse Plus C₁₈柱(250mm×4.6mm,5μm)，Agilent ZORBAX SB-C₁₈柱(250mm×4.6mm,5μm)，Phenomenex Synergi 4μFusion-RP 80A柱(250mm×4.6mm,4μm)。KQ-600DE型数控超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)，Precisa 404A、92SM-202A型电子分析天平。

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1％冰醋酸溶液为流动相B，按下表4中的规定进行梯度洗脱；检测波长为254nm。理论板数按淫羊藿苷峰计算应不低于1500。

表4梯度洗脱程序

时间(分钟)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0～5	9→11	91→89

5～20	11→25	89→75
			20～25	25→30	75→70
25～35	30	70

供试品溶液的制备：取益骨方粉末约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60％甲醇20ml，密塞，称定重量，超声处理1小时，放冷，再称定重量，用60％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

对照品溶液的制备：取淫羊藿苷对照品、龙胆苦苷对照品、马钱苷酸对照品适量，精密称定，加60％甲醇制成每1ml含淫羊藿苷、马钱苷酸各0.1mg、龙胆苦苷0.5mg的混合溶液，即得。

测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

线性关系考察：精密称取淫羊藿苷对照品10.18mg和马钱苷酸对照品10.78mg，置100ml量瓶中，加60％甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液①。再精密称取龙胆苦苷对照品10.45mg，置20ml量瓶中，加对照品贮备液①使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液②(淫羊藿苷对照品浓度为101.8μg/ml，龙胆苦苷对照品浓度为506.3μg/ml，马钱苷酸对照品浓度为101.1μg/ml)。精密量取以上对照品贮备液②各1、2、5、10ml，分别置同一25ml量瓶中，加60％甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得淫羊藿苷浓度分别为4.072、8.144、20.36、40.72μg/ml，龙胆苦苷浓度分别为20.252、40.504、101.26、202.52μg/ml，马钱苷酸浓度分别为4.044、8.088、20.22、40.44μg/ml的对照品混合溶液。分别精密吸取上述对照品混合溶液各10μl，注入液相色谱仪，按含量测定方法测定，以峰面积(A)为纵坐标，对照品浓度(μg/ml)为横坐标，绘制标准曲线，得淫羊藿苷回归方程：Y＝13.318X+2.7107，r＝0.9999，龙胆苦苷回归方程：Y＝10.221X+4.6697，r＝0.9999，马钱苷酸回归方程：Y＝6.624X-0.2085，r＝0.9999。结果表明，淫羊藿苷对照品浓度在4.072μg/ml-101.8μg/ml之间，龙胆苦苷对照品浓度在20.252μg/ml-506.3μg/ml之间，马钱苷酸对照品浓度在4.044μg/ml-101.1μg/ml之间均与其峰面积呈良好的线性关系。见表5。

表5线性关系考察结果

精密度试验：精密吸取淫羊藿苷浓度为100.9μg/ml，龙胆苦苷浓度为493.7μg/ml，马钱苷酸浓度为96.0μg/ml的对照品混合溶液10μl，连续进样6次，测定其峰面积。结果淫羊藿苷峰面积的RSD＝0.24％，龙胆苦苷峰面积的RSD＝0.27％，马钱苷酸峰面积的RSD＝0.47％，表明仪器精密度良好，见表6。

表6精密度试验结果

稳定性试验：取同一份供试品溶液，自制备后，按含量测定方法，分别在0、2、4、8、12、24、48小时进样测定。结果供试品溶液自制备后48小时内测定基本稳定，淫羊藿苷峰面积的RSD＝0.37％，龙胆苦苷峰面积的RSD＝0.30％，马钱苷酸峰面积的RSD＝0.90％。见表7。

表7稳定性试验结果

重复性试验：取同一批供试品6份，按“供试品溶液的制备”项下进行处理并测定含量。结果淫羊藿苷含量的RSD＝0.25％，龙胆苦苷含量的RSD＝0.55％，马钱苷酸含量的RSD＝0.49％，表明此方法的重复性良好，见表8。

表8重复性试验结果

不同色谱柱的比较：取同一批供试品2份，按含量测定方法，分别用A柱(AgilentEclipse Plus C18柱，规格250mm×4.6mm,5μm)、B柱(Agilent ZORBAX SB-C18柱，规格250mm×4.6mm,5μm)、C柱(Phenomenex Synergi 4μ Fus ion-RP80A柱，规格250mm×4.6mm,4μm)三种型号的色谱柱测定。结果用三种型号的色谱柱测定，供试品含量无明显差别。见表9。

表9不同色谱柱的测定结果

加样回收率试验：取同一批已知含量的供试品6份(淫羊藿苷含量：5.82mg/g，龙胆苦苷含量：13.24mg/g，马钱苷酸含量：5.03mg/g)，每份取约0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入淫羊藿苷对照品溶液(103.2μg/ml)10ml、龙胆苦苷对照品溶液(502.4μg/ml)6ml和马钱苷酸对照品溶液(101.6μg/ml)10ml，余下按“供试品溶液的制备”项下进行处理并测定，计算淫羊藿苷、龙胆苦苷及马钱苷酸的回收率。结果淫羊藿苷平均回收率为99.38％，RSD＝0.54％，龙胆苦苷平均回收率为99.61％，RSD＝0.73％，马钱苷酸平均回收率为98.08％，RSD＝1.07％。见表10～表12。

表10淫羊藿苷加样回收率试验结果

表11龙胆苦苷加样回收率试验结果

表12马钱苷酸加样回收率试验结果

专属性试验：按处方称取除淫羊藿、秦艽以外的药材，按制备工艺制成淫羊藿、秦艽阴性样品。再按供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，按含量测定方法测定。结果在与淫羊藿苷对照品、龙胆苦苷对照品及马钱苷酸对照品色谱相应的位置上，阴性对照溶液无干扰，说明该测定方法具有较好的专属性。见附图4～6。

以上分析方法验证结果表明，该测定方法操作简便、可操作性强、结果准确、专属性及重现性好，适合作为质量控制方法，且在同一个HPLC方法条件下同时测定淫羊藿苷、龙胆苦苷及马钱苷酸三个成分的含量。

对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种治疗骨质疏松症中药复方制剂的检测方法，所述治疗骨质疏松症中药复方制剂是指益骨方提取物或以益骨方提取物制成的固体制剂，其特征在于包括以下步骤：

1)杜仲的薄层色谱鉴别方法：以杜仲为对照药材，以松脂醇二葡萄糖苷、京尼平苷酸为对照品，采用薄层色谱法对该中药复方制剂中的杜仲进行定性鉴别；

2)牛膝的薄层色谱鉴别方法：以牛膝为对照药材，β-蜕皮甾酮为对照品，采用薄层色谱法对该中药复方制剂中的牛膝进行定性鉴别；

3)枸杞子的薄层色谱鉴别方法为：以枸杞子为对照药材，采用薄层色谱法对该中药复方制剂中的枸杞子进行定性鉴别；

4)淫羊藿苷、龙胆苦苷、马钱苷酸的含量测定方法：采用高效液相色谱法对该中药复方制剂中的淫羊藿苷、龙胆苦苷、马钱苷酸三个活性成分进行含量测定；

所述1)杜仲的薄层色谱鉴别方法,其具体步骤如下：

1-1)供试品溶液的制备：取益骨方提取物或以益骨方提取物制成的固体制剂粉末，加入甲醇或乙醇进行提取，甲醇或乙醇的加入量与益骨方提取物或以益骨方提取物制成的固体制剂粉末取样量的体积质量比，以ml/g计为25:1,超声处理0.5～2小时或加热回流0.5～1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水30ml使溶解，用乙酸乙酯振摇提取2～3次，每次20ml，弃去乙酸乙酯液，水溶液用以水饱和的正丁醇振摇提取2～3次，每次20ml，合并正丁醇提取液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；

1-2)对照药材溶液的制备：取杜仲对照药材，按步骤1-1)所述的供试品溶液的制备方法制成对照药材溶液；

1-3)对照品溶液的制备：取松脂醇二葡萄糖苷对照品、京尼平苷酸对照品，加甲醇分别制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；

1-4)鉴别：照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液与对照药材溶液各5～10μl，对照品溶液5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以展开剂展开，取出，晾干，喷以5％香草醛的10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；其中，所述的展开剂为体积比为7～5:1:0.1的乙酸乙酯-甲醇-甲酸；

所述2)牛膝的薄层色谱鉴别方法，其具体步骤如下：

2-1)供试品溶液的制备：取益骨方提取物或以益骨方提取物制成的固体制剂粉末，加入浓度为80％的甲醇或浓度为80％的乙醇进行提取，80％甲醇或80％乙醇的加入量与益骨方提取物或以益骨方提取物制成的固体制剂粉末取样量的体积质量比，以ml/g计为25:1,超声处理1～3小时或加热回流0.5～2小时，滤过，滤液浓缩至1ml，加100～200目的中性氧化铝2g，拌匀，加在100～200目、10g、内径为1.5cm的中性氧化铝柱上，用100ml洗脱溶剂洗脱，其中洗脱溶剂为甲醇或乙醇，收集洗脱液，浓缩至1ml，作为供试品溶液；

2-2)对照药材溶液的制备：取牛膝对照药材，按步骤2-1)所述的供试品溶液的制备方法制成对照药材溶液；

2-3)对照品溶液的制备：取β-蜕皮甾酮对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；

2-4)鉴别：照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液与对照药材溶液各5～10μl，对照品溶液5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以展开剂展开，取出，晾干，喷以5％香草醛的10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；其中，所述的展开剂为体积比为7～5:5:0.4:0.05的环己烷-乙酸乙酯-甲酸-水；

所述3)枸杞子的薄层色谱鉴别方法，其具体步骤如下：

3-1)供试品溶液的制备：取益骨方提取物或以益骨方提取物制成的固体制剂粉末，加入浓度为80％～100％的甲醇进行提取，80％～100％甲醇的加入量与益骨方提取物或以益骨方提取物制成的固体制剂粉末取样量的体积质量比，以ml/g计为20:1,超声处理30～90分钟或加热回流15～60分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，加100～200目的硅胶2g，在水浴上拌匀、干燥，加在100～200目、8g、内径为1cm的硅胶柱上，用体积比为8～6:6的石油醚60～90℃-乙酸乙酯洗脱，弃去前洗液，收集续洗液，浓缩至1ml，作为供试品溶液；

3-2)对照药材溶液的制备：取枸杞子对照药材，加水，加热煮沸或加热超声，放冷，滤过，滤液用乙酸乙酯振摇提取，分取乙酸乙酯液，浓缩至1ml，作为对照药材溶液；

3-3)鉴别：照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液2～5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以展开剂展开，取出，晾干，置于365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；其中，所述的展开剂为体积比为8～6:6:1:0.1的石油醚60～90℃-乙酸乙酯-甲醇-冰醋酸；

所述4)淫羊藿苷、龙胆苦苷、马钱苷酸的含量测定方法，其具体步骤如下：

4-1)供试品溶液的制备：取益骨方提取物或以益骨方提取物制成的固体制剂粉末，取适量，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入浓度为50％～70％的甲醇或浓度为50％～70％的乙醇进行提取，50％～70％甲醇或50％～70％乙醇的加入量与益骨方提取物或以益骨方提取物制成的固体制剂粉末取样量的体积质量比，以ml/g计为40:1,密塞，称定重量，超声处理0.5～2小时或加热回流0.5～1.5小时，放冷，再称定重量，用相应的提取溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

4-2)对照品溶液的制备：取淫羊藿苷对照品、龙胆苦苷对照品、马钱苷酸对照品适量，精密称定，加入溶剂制成淫羊藿苷浓度为4.072-101.8μg/ml、龙胆苦苷浓度为20.252-506.3μg/ml、马钱苷酸浓度为4.044-101.1μg/ml的混合溶液，即得；

4-3)色谱条件与系统适用性试验：色谱柱为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C18柱；采用梯度洗脱，流动相A为乙腈或甲醇，流动相B为水或酸水，酸水溶液中酸与水的体积比为0.1～0.5:100，酸水溶液中的酸为冰醋酸、磷酸或甲酸；检测波长为205nm～300nm；柱温为25℃～35℃；理论板数按淫羊藿苷峰计算应不低于1500；

所述步骤4-3)中的梯度洗脱程序如下,其中流动相的比例均为体积百分比:

0～5分钟，流动相A为9％→11％，流动相B为91％→89％；

5～20分钟，流动相A为11％→25％，流动相B为89％→75％；

20～25分钟，流动相A为25％→30％，流动相B为75％→70％；

25～35分钟，流动相A为30％，流动相B为70％；

4-4)测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

2.根据权利要求1所述的治疗骨质疏松症中药复方制剂的检测方法，其特征在于：所述步骤1-4)中的展开剂为体积比为6:1:0.1的乙酸乙酯-甲醇-甲酸。

3.根据权利要求1所述的治疗骨质疏松症中药复方制剂的检测方法，其特征在于：所述步骤2-4)中的展开剂为体积比为6:5:0.4:0.05的环己烷-乙酸乙酯-甲酸-水。

4.根据权利要求1所述的治疗骨质疏松症中药复方制剂的检测方法，其特征在于：所述步骤3-1)中的洗脱液石油醚60～90℃-乙酸乙酯的体积比为7:6。

5.根据权利要求1所述的治疗骨质疏松症中药复方制剂的检测方法，其特征在于：所述步骤3-2)中加热煮沸的时间为15～60分钟或加热超声的时间为30～90分钟；所述步骤3-3)中的展开剂为体积比为7:6:1:0.1的石油醚60～90℃-乙酸乙酯-甲醇-冰醋酸。

6.根据权利要求1所述的治疗骨质疏松症中药复方制剂的检测方法，其特征在于：所述步骤4-2)中的溶剂为60％甲醇或甲醇。

7.根据权利要求1所述的治疗骨质疏松症中药复方制剂的检测方法，其特征在于：所述步骤4-3)中的检测波长为254nm。