CN104274727B - 清营口服液的质量检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于中药制剂的质量控制领域，特别涉及一种清营口服液的质量检测方法。本发明的清营口服液，是由水牛角138g，生地黄138g，玄参138g，竹叶68g，金银花138g，连翘104g，黄连70g，丹参104g，麦冬102g制备而成的。本发明的质量检测方法，包括对金银花、黄连、丹参、连翘、玄参和麦冬的鉴别，及对绿原酸和盐酸小檗碱含量的检测。而本发明的检测方法能够表达清营口服液的质量和疗效。另外，本发明通过具体限定对金银花、黄连、丹参、连翘、玄参、麦冬的鉴别方法和对绿原酸和盐酸小檗碱含量的检测方法，使得检测结果稳定性、重现性好，有利于对产品质量进行控制。

Description

清营口服液的质量检测方法
技术领域
本发明属于中药制剂的质量控制领域，特别涉及一种清营口服液的质量检测方法。
背景技术
随着生活水平的不断提高，人们对健康安全日益关注，更加崇尚“绿色药物”。尤其是进入新世纪后，全球兴起“绿色食品”和“绿色药物”的热潮，中药正成为人们日益关注的焦点。发展中医药，实现中药的现代化和科学化成为当前人们的迫切期望，并成为当前医药界和兽医界的研究热点和重点。
清营汤为《瘟病条辩》中中医清营凉血的著名经典验方，其组方为：犀角[水牛角代]30克、生地黄15克、元参9克、竹叶心3克、银花9克、连翘6克、黄连5克、黄连5克、麦冬9克、黄连5克，其功效为清营解毒、透热养阴，主治温热病邪传入营分证。证见高热，口渴或不渴，烦躁或时有神昏，舌绛而干，或见斑疹隐现，脉细数。许多败血症属营分热盛者，皆可由清营汤清营泄热，进行治疗。现代药理学研究表明，清营汤主要有抗炎、抗过敏、解热镇痛作用：采用动物静脉注射内毒素造成营血症来研究清营汤的治疗作用，结果表明可明显抑制内毒素引起的家兔炎性介质PGE2的5-HT的释放，提高体内IgG含量，降低全血粘度，配伍清热解毒药时，效果更为明显；且可促进体内内毒素的排泄，抑制毛细血管通透性增加，明显抑制大鼠的非特异性炎症反应。清营汤对大肠杆菌内毒素性家兔温病营分证模型还有明显的降低体温作用。
发明内容
本发明的第一个发明目的在于在清营汤的基础上调整配方、限定制备工艺，从而提供一种疗效更好的清营口服液。
技术方案一
一种清营口服液，是由水牛角138g，生地黄138g，玄参138g，竹叶68g，金银花138g，连翘104g，黄连70g，丹参104g，麦冬102g；采用下述方法制备而成：第一次加10倍量水浸泡1h，煎煮2h；第二次加5倍量水，煎煮0.5h，合并两次煎液，浓缩至相对密度1.15，滤过，加水定容至1000mL，加入0.3％苯甲酸钠，搅匀，静置，滤过，灌装封口，灭菌，即得。每瓶装250mL。所述相对密度是指20℃下的相对密度。所述“0.3％”是指质量百分数。
中药制剂成分复杂，药效成分的鉴别、含量检测方法的建立是新药研发的重要工作，是制剂质量控制的关键内容，在检测手段上从传统的光度法、滴定法、理化鉴别法转变为现在的薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法、指纹图谱法等。但是，现有技术中并没有关于清营口服液质量检测方法的相关报道。
本发明的第二个目的在于提供上述清营口服液的质量检测方法。
清营口服液作为一种由九味中药加工制备而成的中药制剂，其成分复杂；对其进行质量检测时不可能对其所含全部成分进行检测。而本发明通过研究发现，通过对金银花、黄连、丹参、连翘、玄参、麦冬的鉴别和对绿原酸和盐酸小檗碱含量的检测，能够表达清营口服液的质量和疗效。除此之外，本发明通过具体限定对金银花、黄连、丹参、连翘、玄参、麦冬的鉴别方法和对绿原酸和盐酸小檗碱含量的检测方法，使得检测结果稳定性、重现性好，有利于对产品质量进行控制。
技术方案二
一种上述清营口服液的质量检测方法，包括对金银花、黄连、丹参、连翘、玄参和麦冬的鉴别，及对绿原酸和盐酸小檗碱含量的检测。
其中，对金银花、黄连、丹参、连翘、玄参和麦冬的鉴别，均采用薄层色谱法。具体操作可以依照中国药典2010年版一部附录VIB。
其中，对绿原酸和盐酸小檗碱含量的检测，均采用高效液相色谱法。具体操作可以依照中国药典2010年版一部附录VI D。
上述方法中，对金银花的鉴别优先采用下述操作进行：
a、取绿原酸对照品，加甲醇配置成每1mL含1mg绿原酸的溶液作为对照品溶液；
b、取金银花对照药材0.4g，加水40mL煎煮，微沸30min，过滤，滤液蒸干后加甲醇1mL溶解，取上清液作为对照药材溶液；
c、取本品10mL，加甲醇10mL，超声处理30min，3500转/分离心30min，取上清液水浴蒸干后用甲醇2mL溶解，作为供试品溶液；
d、吸取对照品溶液、对照药材溶液各1μl，供试品溶液2μL，分别点于同一聚酰胺薄膜上，用展开剂展开，晾干，置254nm的紫外光下检视；所述展开剂由异丙醇、甲醇和甲酸按照9：1：1的体积比混合而成。
供试品色谱中，在与对照品色谱和对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的荧光斑点；则说明本品中含有金银花。
本鉴别方法对金银花对照药材的处理方法进行了改进，使其更接近本产品中所含成分，并对所用展开剂的溶剂体系进行了改进，针对本产品优化了比例；该方法检测结果斑点清晰，无其它成分干扰，更适用于清营口服液的检测。
上述方法中，对黄连的鉴别优先采用下述操作进行：
a、取盐酸小檗碱对照品，加甲醇配制成每1mL含0.5mg盐酸小檗碱的溶液，作为对照品溶液；
b、按照0.25g：25mL的比例向黄连对照药材中加甲醇，超声处理30分钟，然后过滤，取续滤液作为对照药材溶液；
c、取本品10mL，加甲醇10mL，超声处理30min，3500转/分离心30min，取上清液水浴蒸干后用甲醇2mL溶解，作为供试品溶液；
d、吸取对照品溶液、对照药材溶液各1μL，供试品溶液2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，置于浓氨试液预饱和20分钟的展开缸内，用展开剂展开，取出，晾干，置365nm的紫外光下检视；
所述展开剂是由环己烷、乙酸乙酯、异丙醇、甲醇、水和三乙胺按照3：3.5：1：1.5：0.5：1的体积比混合而成；
供试品色谱中，在与对照品和对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；则说明本品中含有黄连。
上述方法中，对丹参的鉴别优先采用下述操作进行：
a、取丹酚酸B对照品，加75％甲醇配制成每1mL含2mg丹酚酸B的溶液，作为对照品溶液；
b、取丹参对照药材0.2g，加75％甲醇25mL，加热回流1小时，过滤，滤液浓缩至1mL，作为对照药材溶液；
c、取本品10mL，加甲醇10mL超声处理30min，3500转/分离心30min，取上清液水浴蒸干后用甲醇2mL溶解，作为供试品溶液；
d、吸取对照品溶液、对照药材溶液各1μl，供试品溶液2μL，分别点于同一聚酰胺薄膜上，用展开剂展开，晾干，用氨气蒸汽熏5min，置365nm紫外光365nm下检视；
所述展开剂由丙酮、36％乙酸和氨水按照10：25：1的体积比混合而成。
所述75％甲醇是指体积浓度为75％的甲醇水溶液；所述36％乙酸是指体积浓度为36％的乙酸水溶液。
供试品色谱中，在与对照品色谱和对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；则说明本品中含有丹参。
上述方法中，对玄参的鉴别优先采用下述操作进行：
a、取哈巴俄苷对照品，加甲醇配制成每1mL含1mg哈巴俄苷的溶液，作为对照品溶液；
b、取玄参对照药材2g，加甲醇25mL，浸泡1小时，超声处理30min，过滤，滤液蒸干；滤液蒸干后的残渣加25mL水溶解，再用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次用30mL正丁醇，合并提取液、蒸干，提取液蒸干后的残渣加甲醇5mL溶解，作为对照药材溶液；
c、取本品20mL，加甲醇30mL，超声处理30min，3500转/分离心30min，取上清液蒸干，上清液蒸干后的残渣加水25mL使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次用30mL正丁醇，合并提取液、蒸干，提取液蒸干后的残渣加甲醇2mL溶解，加2g、100～200目的中性氧化铝混匀，过中性氧化铝柱，用80％甲醇80mL洗脱，收集洗脱液，洗脱液蒸干后用2mL甲醇溶解，作为供试品溶液；所用中性氧化铝柱的内径为1-1.5cm，内置5g、100～200目的中性氧化铝；
d、吸取对照品溶液5μL、对照药材溶液5μL、供试品溶液8μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，置于展开剂预饱和15分钟的展开缸内，用展开剂展开，展距12cm，取出晾干，喷以5％香草醛的5％硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰；
所述展开剂是指三氯甲烷、甲醇、水按照12：4：1比例混合后的下层溶液。
供试品色谱中，在与对照品色谱和对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；则说明本品中含有玄参。
上述方法中，对连翘的鉴别优先采用下述操作进行：
a、取连翘对照药材0.4g，加水200mL煎煮，煮沸30分钟，过滤后滤液蒸干，用1mL甲醇溶解，作为对照药材溶液；
b、取连翘苷对照品，加甲醇制备成1mL含0.25mg连翘苷的溶液，作为对照品溶液；
c、取本品20mL，加甲醇30mL，超声处理30min，3500转/分离心30min，取上清液蒸干后加25mL水溶解，再用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次用30mL正丁醇，合并提取液，提取液蒸干后加甲醇2mL溶解，加2g、100～200目的中性氧化铝混匀，过中性氧化铝柱，用80％甲醇80mL洗脱，收集洗脱液，洗脱液蒸干后用2mL甲醇溶解，作为供试品溶液；所用中性氧化铝柱的内径为1-1.5cm，内置5g、100～200目的中性氧化铝；
d、取对照品溶液5μl，对照药材溶液2μl，供试品溶液和阴性对照溶液各4μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，用展开剂展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰；
所述展开剂是由三氯甲烷、甲醇按照8:1.5的体积比混合而成。
所述80％甲醇是指体积浓度为80％的甲醇水溶液。
供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的斑点；则说明本品中含有连翘。
本鉴别方法对连翘对照药材的处理方法进行了改进，使其更接近本产品中所含成分，该方法检测结果斑点清晰，无其它成分干扰，更适用于清营口服液的检测。
上述方法中，对麦冬的鉴别优先采用下述操作进行；
a、取麦冬对照药材2g，加水100mL，煎煮30min，过滤后滤液浓缩至10mL，加40mL甲醇，加热回流1h，滤过，滤液蒸干后的残渣加水10mL溶解，用氨试液碱化正丁醇的上层溶液振摇提取3次，每次15mL，取正丁醇层、蒸干后的残渣加甲醇2mL溶解，加中性氧化铝1g、100～200目混匀，过中性氧化铝柱，用80％甲醇80mL洗脱，收集洗脱液蒸干后用4mL甲醇溶解，作为对照药材溶液；所用中性氧化铝柱的内径为1-1.5cm，内置3g、100～200目的中性氧化铝；所用氨试液碱化正丁醇溶液，氨试液与正丁醇体积比为1:10；
b、取本品5mL，加甲醇40mL，加热回流1h，滤过，滤液蒸干，残渣加水10mL，趁热溶解，用氨试液碱化正丁醇的上层溶液振摇提取3次，每次15mL，分取正丁醇层，蒸干，残渣加甲醇2mL溶解，加1g、100～200目的中性氧化铝混匀，过中性氧化铝柱，用80％甲醇80mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，用4mL甲醇溶解，作为供试品溶液；所用中性氧化铝柱的内径为1-1.5cm，内置3g、100～200目的中性氧化铝；所用氨试液碱化正丁醇溶液，氨试液与正丁醇体积比为1:10；
c、吸取上对照药材溶液、供试品溶液各1μL分别点于同一硅胶G薄层板上，用展开剂展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰；
所述展开剂是由三氯甲烷、甲醇、水按照3:2:0.4的体积比混合而成。
所述80％甲醇是指体积浓度为80％的甲醇水溶液。
供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的斑点；则说明本品中含有麦冬。
本鉴别方法对麦冬对照药材的处理方法进行了改进，使其更接近本产品中所含成分，该方法检测结果斑点清晰，无其它成分干扰，更适用于清营口服液的检测。
上述方法中，对绿原酸含量的测定，优选采用下述操作；
a、色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，采用规格为5μm、4.6×250mm的C18柱，以体积比为13:87的乙腈－0.4％磷酸溶液为流动相；检测波长为327nm；理论板数按绿原酸峰计算应不低于1000；
b、对照品溶液的制备：称取绿原酸10mg，置25mL棕色量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀后吸取1mL置10mL棕色量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀，即得绿原酸含量为40μg/mL的对照品溶液；
c、供试品溶液的制备：量取本品5mL，置100mL棕色量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，所得续滤液即为供试品溶液；
d、测定：分别吸取对照品溶液、供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定即可。
上述方法中，对盐酸小檗碱含量的测定，优选采用下述操作；
a、色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，采用柱规格为5μm，4.6×250mm的C18柱，以体积比为32:68的乙腈－0.3％磷酸溶液为流动相；检测波长为348nm；理论板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于1000；
b、对照品溶液的制备：称取盐酸小檗碱对照品15mg，置50mL棕色量瓶中，加甲醇-盐酸混合溶液至刻度，摇匀后吸取1mL置10mL棕色量瓶中，加甲醇-盐酸混合溶液至刻度，摇匀，即得盐酸小檗碱含量为30μg/mL的对照品溶液；
c、供试品溶液的制备：量取本品2mL，置50mL棕色量瓶中，加甲醇-盐酸混合溶液稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，所得续滤液即为供试品溶液；
d、测定法：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定即可；
步骤b中，所用甲醇-盐酸混合溶液中甲醇和盐酸体积比为100：1。
本品含金银花以绿原酸(C16H18O9)计，每1mL不得少于0.8mg；含黄连以盐酸小檗碱(C20H17NO4﹒HCl)计，每1mL不得少于0.7mg。
上述的清营口服液的质量检测方法，其中还可设检查步骤：检测相对密度、检测pH；及其他应符合合剂项下有关的各项规定。
本品的相对密度应不低于1.08(中国药典2010年版一部附录VIIA)。
本品的pH值应为4.0～6.0(中国药典2010年版一部附录VIIG)。
所述其他应符合合剂项下有关的各项规定，可参照中国药典2010年版一部附录IJ。
本发明通过试验研究建立了薄层色谱法和高效液相色谱法测定制剂的药效成分，实现了对新药制剂清营口服液的定性及定量的产品检测，确保药效成分的稳定性，并有利于生产过程的质量控制。本发明的方法，采用薄层色谱法对金银花、黄连、丹参、连翘、玄参、麦冬的鉴别结果，及采用高效液相色谱法对绿原酸和盐酸小檗碱含量的检测结果，与清营口服液的质量之间寻在高度相关性，能够准确表达清营口服液的质量和疗效。
另外，经多批样品实验证明：本发明的对清营口服液中金银花、黄连、丹参、连翘、玄参、麦冬鉴别的具体操作，及对绿原酸和盐酸小檗碱为含量测定方法的具体操作(色谱条件选择、供试品溶液的制备选择、系统适用性的选择)进行改进之后，使得测定结果呈现出稳定、重现性好，且阴性无干扰的优点。本发明的测定方法中，色谱条件选择、供试品溶液的制备选择、系统适用性、线性关系、精密度、样品稳定性、样品重现性、样品加样回收率、样品测定等试验选择绿原酸和盐酸小檗碱为含量测量成份、确定了含量测定方法，同时在检查项下还得其PH值进行检查，使得清营口服液质量更容易控制。
本发明的制备方法中，所述本品是指清营口服液。
本发明中的续滤液是指过滤时最初滤出的10滴滤液弃去后的剩余滤液。
具体实施方式
以下通过试验例来进一步说明本发明方法的有益效果。
实施例1
取水牛角138g，生地黄138g，玄参138g，竹叶68g，金银花138g，连翘104g，黄连70g，丹参104g，麦冬102g；加10倍量水浸泡1h，煎煮2h，过滤得第一次煎煮液和药渣；向药渣中加5倍量水，煎煮0.5h，过滤得第二次煎煮液；合并两次煎液，浓缩至相对密度1.15，滤过，加水定容至1000mL，向定容好的药液中加入药液质量的0.3％的苯甲酸钠防腐剂，搅匀，静置，滤过，灌装封口，灭菌，即得。每瓶装250mL。所述相对密度是指20℃下的相对密度。
一、鉴别
1、取绿原酸对照品，加甲醇制成每1mL含1mg绿原酸的溶液，作为对照品溶液。取金银花对照药材0.4g，加水40mL煎煮，微沸30min，过滤，滤液蒸干后加甲醇1mL溶解，取上清液作为对照药材溶液。再取本品10mL，加甲醇10mL，超声处理30min，3500转/分离心30min，取上清液置水浴上蒸干后再用甲醇2mL溶解，放置后取上清液作为供试品溶液。照薄层色谱法(附录32页)试验，吸取对照品溶液、对照药材溶液各1μl，供试品溶液2μL，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以异丙醇：甲醇：甲酸(体积比为9：1：1)的混合溶液为展开剂，展开晾干，置紫外光灯(254nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品和对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的荧光斑点；所以，本品中金银花药效成分绿原酸存在。
2、取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg盐酸小檗碱的溶液，作为对照品溶液。再取黄连对照药材0.25g，加甲醇25mL，超声处理30分钟，滤过，取滤液作为对照药材溶液。另取本品10mL，加甲醇10mL，超声处理30min，3500转/分离心30min，取上清液置水浴上蒸干后用甲醇2mL溶解，放置后取上清液作为供试品溶液。照薄层色谱法(附录32页)试验，吸取对照品溶液、对照药材溶液各1μL，吸取供试品溶液2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水-三乙胺混合液(体积比为：3：3.5：1：1.5：0.5：1)为展开剂，置浓氨试液预饱和20分钟的展开缸内，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品和对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；所以，本品中黄连药效成分盐酸小檗碱存在。
3、取丹酚酸B对照品，加75％甲醇(体积含量为75％的甲醇)制成每1mL含2mg丹酚酸B的溶液，作为对照品溶液。再取丹参对照药材0.2g，加75％甲醇(同上)25mL，加热回流1小时，滤过，滤液浓缩至1mL，作为对照药材溶液。另取本品10mL，加甲醇10mL超声处理30min，3500转/分离心30min，取上清液置水浴上蒸干后用甲醇2mL溶解，作为供试品溶液。照薄层色谱法(附录32页)试验，吸取对照品溶液、对照药材溶液1μL，供试品溶液2μL，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以丙酮：36％乙酸：氨水(体积比：10：25：1)为展开剂，展开晾干，用氨蒸汽熏5min，置紫外灯365nm下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱和对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；所以，本品中丹参药效成分丹酚酸B存在。
4、取哈巴俄苷对照品，加甲醇制成每1mL含1mg哈巴俄苷的溶液，作为对照品溶液。再取玄参对照药材2g，加甲醇25mL，浸泡1小时，超声处理30min，滤过，滤液蒸干后的残渣加水25mL溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次30mL，合并正丁醇液、蒸干，蒸干后残渣加甲醇5mL使溶解，作为对照药材溶液。取本品20mL，加甲醇30mL，超声处理30min，3500转/分离心30min，取上清液蒸干后的残渣加水25mL使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次30mL，合并正丁醇液，蒸干，蒸干后的残渣加甲醇2mL使溶解，加2g中性氧化铝(100～200目)混匀，过中性氧化铝柱(内径1-1.5cm，5g，100～200目)，用80％甲醇80mL洗脱，收集洗脱液、蒸干，用2mL甲醇溶解，作为供试品溶液。照薄层色谱法(附录32页)试验，吸取对照品溶液5μL、对照药材溶液5μL、供试品溶液8μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷：甲醇：水混合后的(体积比12：4：1)的下层溶液为展开剂，置用展开剂预饱和15分钟的展开缸内，展开，展距12cm，取出晾干，喷以5％香草醛的5％硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱和对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；所以，本品中玄参药效成分哈巴俄苷存在。
5％香草醛的5％硫酸乙醇溶液：先配制体积比5％的硫酸乙醇溶液，再以5％的硫酸乙醇溶液为溶剂，配制质量分数5％的香草醛溶液。
5、取连翘对照药材0.4g，加水200mL煎煮，煮沸30分钟，过滤后滤液蒸干，用1mL甲醇溶解，作为对照药材溶液。另取连翘苷对照品，加甲醇制备成每1mL含0.25mg连翘苷的溶液，作为对照品溶液。再取本品20mL，加甲醇30mL，超声处理30分钟，3500转/分离心30分钟，取上清液蒸干后的残渣加水25mL使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次30mL，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇2mL使溶解，加2g中性氧化铝(100～200目)混匀，过中性氧化铝柱(内径1-1.5cm，5g，100～200目)，用80％甲醇80mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，用2mL甲醇溶解，作为供试品溶液。照薄层色谱法(附录32页)试验，吸取上述取对照品溶液5μl，对照药材溶液2μl，供试品溶液和阴性对照溶液各4μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇(体积比：8:1.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的斑点；所以，本品中连翘药材存在。
6、取麦冬对照药材2g，加水100mL，煎煮30min，过滤后滤液浓缩至10mL，加40mL甲醇，加热回流1h，滤过，滤液蒸干，残渣加水10mL，趁热溶解，用氨试液碱化正丁醇(体积比：1:10)的上层溶液振摇提取3次，每次15mL，分取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇2mL溶解，加1g中性氧化铝(100～200目)混匀，过中性氧化铝柱(内径1-1.5cm，3g，100～200目)，用80％甲醇80mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，用4mL甲醇溶解，作为对照药材溶液。取本品5mL，加甲醇40mL，加热回流1h，滤过，滤液蒸干，残渣加水10mL，趁热溶解，用氨试液碱化正丁醇(1:10)的上层溶液振摇提取3次，每次15mL，分取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇2mL溶解，加1g中性氧化铝(100～200目)混匀，过中性氧化铝柱(内径1-1.5cm，3g，100～200目)，用80％甲醇80mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，用4mL甲醇溶解，作为供试品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各1μL分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-水(体积比：3:2:0.4)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。结果，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，所以，本品中麦冬药材存在
综上所述，确定了正文的金银花、黄连、丹参、连翘、玄参、麦冬TLC检查方法，经多批样品实验，该方法稳定、重现性好，且阴性无干扰。
二、含量测定：照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录VI D)测定；
1.绿原酸的含量测定
a、色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱规格为5μm，4.6×250mm的C18柱，以乙腈－0.4％磷酸溶液(乙腈和磷酸溶液的体积比为13:87)为流动相；检测波长为327nm；理论板数按绿原酸峰计算应不低于1000；
b、对照品溶液的制备：精密称取绿原酸对照品10mg，置25mL棕色量瓶中，加50％甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀；精密吸取1mL置10mL棕色量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀，即得1mL含绿原酸40μg的对照品溶液；
c、供试品溶液的制备：精密量取本品5mL，置100mL棕色量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，精密滤过，取续滤液，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得；
d、测定法：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，即可。
2.盐酸小檗碱的含量测定
a、色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱规格为5μm，4.6×250mm的C18柱，以乙腈－0.3％磷酸溶液(32:68)为流动相；检测波长为348nm；理论板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于1000；
b、对照品溶液的制备：精密称取盐酸小檗碱对照品15mg，置50mL棕色量瓶中，加甲醇-盐酸(100：1)的混合溶液使溶解并稀释至刻度，摇匀；精密吸取1mL置10mL棕色量瓶中，加甲醇-盐酸(100：1)的混合溶液至刻度，摇匀，即得1mL含盐酸小檗碱30μg的对照品溶液；
c、供试品溶液的制备：精密量取本品2mL，置50mL棕色量瓶中，加甲醇-盐酸(100：1)的混合溶液稀释至刻度，摇匀，精密滤过，取续滤液，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得；
d、测定法：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，即可。
效果试验
一、绿原酸含量测定方法
1、线性关系考察
采用实施例1中绿原酸的含量测定方法，分别进样绿原酸对照品溶液1μL、5μL、10μL、15μL、20μL，按建立的色谱条件依次进样，记录色谱图与峰面积，结果见表1；
表1不同进样量的绿原酸色谱峰面积结果
以绿原酸量为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制绿原酸标准曲线。将表1中的数据进行线性回归，得到线性回归方程：y＝2972.5×-2.4032。结果表明，绿原酸进样量在0.04-0.8μg范围内呈良好的线性关系。
2.精密度试验
采用实施例1中绿原酸的含量测定方法，将对照品溶液进样5μL，重复进样测定6次，记录色谱图与峰面积，结果见表2；
表2绿原酸测定精密度试验结果
结果表明，本发明的检测方法的精密度好。
3.重现性试验
采用实施例1中绿原酸的含量测定方法，将同一批号的样品，按供试品溶液制备方法，平行制备成6份供试品溶液，按建立的色谱条件分别进行试验，记录色谱图与峰面积，结果见表3；
表3绿原酸测定重现性试验结果
结果表明，本发明的检测方法的重复性好。
4.日内稳定性试验
采用实施例1中绿原酸的含量测定方法，将制备的同一供试品溶液，按建立的色谱条件分别于0、2、4、6、8、10、12h进行试验测定，记录色谱图与峰面积，结果见表4；
表4绿原酸测定日内稳定性试验结果
结果表明，供试品溶液在12h内稳定。
5.加样回收率试验
采用实施例1中绿原酸的含量测定方法，平行精密量取已知含量的同批号的样品1mL，共6份，分别置50mL量瓶中，分别加入浓度为0.2mg/mL的绿原酸对照品溶液5mL、6mL、7mL，用50％甲醇稀释至刻度，摇匀，放置，滤过，取续滤液作为供试品溶液。按照建立的色谱条件进行试验，记录色谱图及峰面积。以峰面积计算，测定绿原酸含量，计算回收率。结果见表5；
表5绿原酸测定加样回收率试验结果
结果表明，本发明的检测方法的准确性好。
二、盐酸小檗碱含量测定方法
1、性关系考察
按照实施例1的盐酸小檗碱含量测定方法，分别配制不同浓度的盐酸小檗碱对照品溶液，按建立的色谱条件依次测定，记录色谱图与峰面积，结果见表6；
表6不同进样量的盐酸小檗碱色谱峰面积结果
盐酸小檗碱浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制盐酸小檗碱标准曲线。将表6中的数据进行线性回归，得到线性回归方程：y＝23.35×+0.7037，(r2＝0.999)。结果表明，盐酸小檗碱进样浓度在8.16-48.96μg/mL范围内呈良好的线性关系。
2、精密度试验
按照实施例1的盐酸小檗碱含量测定方法，对照品溶液进样量为5μl，重复进样测定6次，记录色谱图与峰面积，结果见表7；
表7盐酸小檗碱测定精密度试验结果
试验表明，本发明的测量方法的精密度好。
3、重复性试验
按照实施例1的盐酸小檗碱含量测定方法，将同一批号的样品，按供试品溶液制备方法，平行制备成6份供试品溶液，按建立的色谱条件分别进行试验，记录色谱图、峰面积并计算盐酸小檗碱含量，结果见表8；
表8盐酸小檗碱测定重复性试验结果
试验表明，本发明的测量方法的重复性好。
4、盐酸小檗碱加样回收率试验
按照实施例1的盐酸小檗碱含量测定方法，精密量取样品1mL，共6份，分别置50mL量瓶中，分别加入盐酸小檗碱对照品0.862mg，用甲醇-盐酸(100：1)的混合溶液定容至50mL，摇匀，放置，取上清液作为供试品溶液。按照建立的色谱条件进行试验，记录色谱图及峰面积。以峰面积计算，测定盐酸小檗碱含量，计算回收率。结果见表9；
表9盐酸小檗碱加样回收率试验结果
结果表明，本发明的测量方法的准确性好。
5、日内稳定性试验
按照实施例1的盐酸小檗碱含量测定方法，将同一批号的样品，按供试品溶液制备方法制备成供试品溶液，按建立的色谱条件分别于0、1、2、4、8、12h进行试验，记录色谱图与峰面积，结果见表10；
表10盐酸小檗碱测定日内稳定性试验结果
试验表明，供试品溶液在12h内稳定。
本发明的方法，通过对色谱条件的优选、供试品、对照品制备方法的试验，建立了制剂中主要药效成分绿原酸和盐酸小檗碱含量的高效液相色谱分析方法，通过方法学试验研究表明所建立的方法准确度高、专属性强、重现性良好，可以有效的控制最终制剂产品质量。

Claims (5)

1.一种清营口服液的质量检测方法，其特征在于，包括对金银花、黄连、丹参、连翘、玄参和麦冬的鉴别，及对绿原酸和盐酸小檗碱含量的检测；
还可设检查步骤：检测相对密度、检测 pH；及其他应符合合剂项下有关的各项规定；
对金银花、黄连、丹参、连翘、玄参和麦冬的鉴别，均采用薄层色谱法；
对绿原酸和盐酸小檗碱含量的检测，均采用高效液相色谱法；
所述清营口服液是由水牛角138g，生地黄138g，玄参138g，竹叶68g，金银花138g，连翘104g，黄连70g，丹参104g，麦冬102g采用下述方法制备而成：第一次加10倍量水浸泡1h，煎煮2h；第二次加5倍量水，煎煮0.5h，合并两次煎液，浓缩至相对密度1.15，滤过，加水定容至1000mL，加入0.3%苯甲酸钠，搅匀，静置，滤过，灌装封口，灭菌，即得；
对丹参的鉴别采用下述操作进行：
a、取丹酚酸B对照品，加75％甲醇配制成每1mL含2mg丹酚酸B的溶液，作为对照品溶液；
b、取丹参对照药材0.2g，加75%甲醇25mL，加热回流1小时，过滤，滤液浓缩至1mL，作为对照药材溶液；
c、取清营口服液10mL，加甲醇10mL超声处理30min，3500转/分离心30min，取上清液水浴蒸干后用甲醇2mL溶解，作为供试品溶液；
d、吸取对照品溶液、对照药材溶液各1μL，供试品溶液2μL，分别点于同一聚酰胺薄膜上，用展开剂展开，晾干，用氨气蒸汽熏5min，置365nm紫外光365nm下检视；
所述展开剂由丙酮、36%乙酸和氨水按照10：25：1的体积比混合而成；
对玄参的鉴别采用下述操作进行：
a、取哈巴俄苷对照品，加甲醇配制成每1mL含1mg哈巴俄苷的溶液，作为对照品溶液；
b、取玄参对照药材2g，加甲醇25mL，浸泡1小时，超声处理30min，过滤，滤液蒸干；滤液蒸干后的残渣加25mL水溶解，再用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次用30mL正丁醇，合并提取液、蒸干，提取液蒸干后的残渣加甲醇5mL溶解，作为对照药材溶液；
c、取清营口服液20mL，加甲醇30mL，超声处理30min，3500转/分离心30min，取上清液蒸干，上清液蒸干后的残渣加水25mL使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次用30mL正丁醇，合并提取液、蒸干，提取液蒸干后的残渣加甲醇2mL溶解，加2g、100～200目的中性氧化铝混匀，过中性氧化铝柱，用80%甲醇80mL洗脱，收集洗脱液，洗脱液蒸干后用2mL甲醇溶解，作为供试品溶液；所用中性氧化铝柱的内径为1-1.5cm，内置5g、100～200目的中性氧化铝；
d、吸取对照品溶液5μL、对照药材溶液5μL、供试品溶液8μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，置于展开剂预饱和15分钟的展开缸内，用展开剂展开，展距12cm，取出晾干，喷以5%香草醛的5%硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰；
所述展开剂是指三氯甲烷、甲醇、水按照12：4：1比例混合后的下层溶液；
对连翘的鉴别采用下述操作进行：
a、取连翘对照药材0.4g，加水200mL煎煮，煮沸30分钟，过滤后滤液蒸干，用1mL甲醇溶解，作为对照药材溶液；
b、取连翘苷对照品，加甲醇制备成1mL含0.25mg连翘苷的溶液，作为对照品溶液；
c、取清营口服液20mL，加甲醇30mL，超声处理30min，3500转/分离心30min，取上清液蒸干后加25mL水溶解，再用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次用30mL正丁醇，合并提取液，提取液蒸干后加甲醇2mL溶解，加2g、100～200目的中性氧化铝混匀，过中性氧化铝柱，用80%甲醇80mL洗脱，收集洗脱液，洗脱液蒸干后用2mL甲醇溶解，作为供试品溶液；所用中性氧化铝柱的内径为1-1.5cm，内置5g、100～200目的中性氧化铝；
d、取对照品溶液5μL，对照药材溶液2μL，供试品溶液和阴性对照溶液各4μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，用展开剂展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰；
所述展开剂是由三氯甲烷、甲醇按照8:1.5的体积比混合而成；
对麦冬的鉴别采用下述操作进行：
a、取麦冬对照药材2g，加水100mL，煎煮30min，过滤后滤液浓缩至10mL，加40mL甲醇，加热回流1h，滤过，滤液蒸干后的残渣加水10mL溶解，用氨试液碱化正丁醇的上层溶液振摇提取3次，每次15mL，取正丁醇层、蒸干后的残渣加甲醇2mL溶解，加中性氧化铝1g、100～200目混匀，过中性氧化铝柱，用80%甲醇80mL洗脱，收集洗脱液蒸干后用4mL甲醇溶解，作为对照药材溶液；所用中性氧化铝柱的内径为1-1.5cm，内置3g、100～200目的中性氧化铝；所用氨试液碱化正丁醇溶液，氨试液与正丁醇体积比为1:10；
b、取清营口服液5mL，加甲醇40mL，加热回流1h，滤过，滤液蒸干，残渣加水10mL，趁热溶解，用氨试液碱化正丁醇的上层溶液振摇提取3次，每次15mL，分取正丁醇层，蒸干，残渣加甲醇2mL溶解，加1g、100～200目的中性氧化铝混匀，过中性氧化铝柱，用80%甲醇80mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，用4mL甲醇溶解，作为供试品溶液；所用中性氧化铝柱的内径为1-1.5cm，内置3g、100～200目的中性氧化铝；所用氨试液碱化正丁醇溶液，氨试液与正丁醇体积比为1:10；
c、吸取上对照药材溶液、供试品溶液各1μL分别点于同一硅胶G薄层板上，用展开剂展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰；
所述展开剂是由三氯甲烷、甲醇、水按照3:2:0.4的体积比混合而成。
2.根据权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于，对金银花的鉴别采用下述操作进行：
a、取绿原酸对照品，加甲醇配置成每1mL含1mg绿原酸的溶液作为对照品溶液；
b、取金银花对照药材0.4g，加水40mL煎煮，微沸30min，过滤，滤液蒸干后加甲醇1mL溶解，取上清液作为对照药材溶液；
c、取清营口服液10mL，加甲醇10mL，超声处理30min，3500转/分离心30min，取上清液水浴蒸干后用甲醇2mL溶解，作为供试品溶液；
d、吸取对照品溶液、对照药材溶液各1μL，供试品溶液2μL，分别点于同一聚酰胺薄膜上，用展开剂展开，晾干，置254nm的紫外光下检视；所述展开剂由异丙醇、甲醇和甲酸按照9：1：1的体积比混合而成。
3.根据权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于，对黄连的鉴别采用下述操作进行：
a、取盐酸小檗碱对照品，加甲醇配制成每1mL含0.5mg盐酸小檗碱的溶液，作为对照品溶液；
b、按照0.25g：25mL的比例向黄连对照药材中加甲醇，超声处理30分钟，然后过滤，取续滤液作为对照药材溶液；
c、取清营口服液10mL，加甲醇10mL，超声处理30min，3500转/分离心30min，取上清液水浴蒸干后用甲醇2mL溶解，作为供试品溶液；
d、吸取对照品溶液、对照药材溶液各1μL，供试品溶液2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，置于浓氨试液预饱和20分钟的展开缸内，用展开剂展开，取出，晾干，置365nm的紫外光下检视；
所述展开剂是由环己烷、乙酸乙酯、异丙醇、甲醇、水和三乙胺按照3：3.5：1：1.5：0.5：1的体积比混合而成。
4.根据权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于，对绿原酸含量的测定，采用下述操作；
a、色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，采用规格为5μm、4.6×250mm的C18柱，以体积比为13:87的乙腈－0.4%磷酸溶液为流动相；检测波长为327nm；理论板数按绿原酸峰计算应不低于1000；
b、对照品溶液的制备：称取绿原酸10mg，置25mL棕色量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀后吸取1mL置10mL棕色量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀，即得绿原酸含量为40μg/mL的对照品溶液；
c、供试品溶液的制备：量取清营口服液5mL，置100mL棕色量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，所得续滤液即为供试品溶液；
d、测定：分别吸取对照品溶液、供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定即可。
5.根据权利要求2所述的的质量检测方法，其特征在于，对盐酸小檗碱含量的测定，采用下述操作；
a、色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，采用柱规格为5μm，4.6×250mm的C18柱，以体积比为32:68的乙腈－0.3%磷酸溶液为流动相；检测波长为348nm；理论板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于1000；
b、对照品溶液的制备：称取盐酸小檗碱对照品15mg，置50mL棕色量瓶中，加甲醇-盐酸混合溶液至刻度，摇匀后吸取1mL置10mL棕色量瓶中，加甲醇-盐酸混合溶液至刻度，摇匀，即得盐酸小檗碱含量为30μg/mL的对照品溶液；
c、供试品溶液的制备：量取清营口服液2mL，置50mL棕色量瓶中，加甲醇-盐酸混合溶液稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，所得续滤液即为供试品溶液；
d、测定法：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定即可；
步骤b中，所用甲醇-盐酸混合溶液中甲醇和盐酸体积比为100：1。
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