CN101609039B - 雨生红球藻孢子破壁率的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种雨生红球藻孢子破壁率的测定方法，其步骤是：A、二氯甲烷-正己烷提取样品虾青素是在室温下进行，重复提取，提取液合并后，用二甲基亚砜定容，530nm波长测定光吸收值A，根据DMSO溶解的虾青素溶液的光吸收系数A_1cm ^1％计算样品虾青素含量；B、二甲基亚砜提取样品虾青素是在70℃下进行，重复提取，提取液合并后，用二甲基亚砜定容，530nm波长测定光吸收值A，根据DMSO溶解的虾青素溶液的光吸收系数A_1cm ^1％计算样品虾青素含量；C、二氯甲烷-正己烷提取、测定的样品虾青素含量与二甲基亚砜提取、测定样品虾青素含量的比值，即孢子破壁率；本发明方法简便、快速、准确、可靠，为雨生红球藻孢子粉生产过程的质量控制和产品流通过程的质量监管提供了可靠的方法。

Description

雨生红球藻孢子破壁率的测定方法

技术领域

本发明属于微藻生物技术领域，更具体设及一种雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)孢子破壁率的测定方法，准确、定量地反映雨生红球藻孢子粉有效成分虾青素(Astaxanthin)的生物可利用性，为雨生红球藻孢子粉生产过程的质量控制和产品流通过程的质量监管提供可靠的技术方法。

背景技术

雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)的孢子(cyst)是自然界含虾青素(Astaxanthin)最丰富的细胞，含量一般可达干重的1.5-3％，规模化养殖雨生红球藻是天然虾青素的主要来源[魏东，戚晓南.中国海洋药物.2001，83：4-8]。虾青素是一种天然类胡萝卜素，也是用于珍贵水产动物饲料添加剂的主要类胡萝卜素，具有改善食用鱼肉色和观赏鱼外观色泽的作用，仅三文鱼养殖，全球每年就需要大约130吨虾青素[Bjerkeng B.In：George Britton，Synnove Liaaen-Jensen，Hanspeter Pfander(Eds)：Carotenoids，Volume 4：Natural Functions.2008，

Basel，P.237-254]。虾青素具有超强的抗氧化活性，抗氧化能力是天然β-胡萝卜和维生素E的数倍，具有极强的去除自由基的能力，保护细胞和组织免受脂质氧化的损伤，显著提高人体免疫力，具有抗疲劳、抗衰老作用[Guerin，M.et al.Trends Biotechnol.2003，21：210-216]。目前，天然虾青素已经被开发成为人类的保健食品。大规模培养雨生红球藻生产天然虾青素是二十一世纪国际上新兴的微藻生物技术产业。近年来，国内也开始批量生产雨生红球藻孢子粉。

无论作为水产动物的着色剂还是人类的保健食品，雨生红球藻孢子中虾青素能否发挥作用，首先取决于其生物可利用性，即能否被生物吸收利用[Castenmiller，M.；Waet，E.Pure appl.Chem.1997，69：1245-1250)。雨生红球藻的厚壁孢子非常坚韧，不易破碎，孢子壁虽然不能阻挡丙酮等小分子有机溶剂的渗透，但是可以完全阻挡虾青素分子的通过。所以，从红球藻孢子中提取虾青素需要首先破碎孢子的细胞壁。据报道，三文鱼缺乏消化红球藻孢子壁的酶，富含虾青素、但是孢子壁完整的雨生红球藻对三文鱼没有着色作用，只有将孢子壁破碎后，才能使三文鱼着色(Sommer，R.et al.Aquaculture.1991，94：79-88)。也就是说，无论动物还是人类，只能利用破壁的雨生红球藻孢子中的虾青素。所以，大规模培养雨生红球藻生产天然虾青素的一个关键步骤就是破碎孢子壁。

Mendes-Pinto等研究了高温(121℃)、酸(0.1M HCl)、碱(0.1M NaHO)、酶解(蛋白酶和崩溃酶)、喷雾干燥和高压均质对雨生红球藻虾青素提取的影响，研究表明，不同处理方法，提取效果悬殊很大。此研究仅利用扫描电子显微镜对红球藻孢子破碎情况进行了观察，未对孢子破壁率进行定量分析[Mendes-Pinto，M.et al.J.Appl.Phycol.2001，13：19-24]。周湘池等采用匀浆法、冻融法、超声破碎法、常温研磨法和低温研磨法五种破壁方法，从实验室培养的雨生红球藻鲜孢子中提取虾青素。结果表明，不同破壁方法，虾青素提取率差异很大。这项工作仅测定了虾青素的提取率，未涉及孢子破壁率的测定[周湘池等.海洋与湖沼，2006，37(5)：424-429]。欧阳琴等以实验室培养的雨生红球藻为材料，研究了高压均质法、超声破碎法和冻融法对雨生红球藻虾青素提取率的影响，同时测定了虾青素提取率和细胞破壁率。测定破壁率的方法是：利用“浮游生物计数框”，在显微镜下对破壁处理前的细胞进行计数，破壁处理后，再对剩余的完整细胞计数，用公式计算细胞破壁率：R＝(破壁前细胞数目-破壁后完整细胞数目)/破壁前细胞数目[欧阳琴等.福州大学学报(自然科学版)，2005，30(1)：111-114]。

计数法测定细胞破壁率，需要对比破壁处理前后完整细胞的数目，仅适用于在破壁处理的同时测定细胞破壁率。雨生红球藻孢子粉产品离开工厂生产线进入市场后，其破壁率的测定，细胞计数法就不适用了，因为不可能获得未破壁处理前孢子数目的信息。另一方面，在显微镜下观察，有时很难判断某些细胞是否完整，给细胞计数法测定破壁率带来困难。测定孢子破壁率，目的是为了定量反映红球藻孢子粉中虾青素的生物可利用性，所以，破壁率的测定方法需要建立在准确测定虾青素含量的基础上。

随着国际上红球藻产业的发展，特别是国内红球藻产业的兴起和红球藻产品的批量生产，准确地测定红球藻的孢子破壁率，无论对于生产厂家控制产品质量，还是市场上规范红球藻产品质量都是非常重要的，孢子破壁率应该作为一项重要的产品质量指标。但是，适合于红球藻孢子粉破壁率的测定方法国内外都未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种雨生红球藻孢子破壁率的测定方法，方法易行，操作简便，测定快速，结果准确可靠，定量反映雨生红球藻孢子粉有效成分虾青素的生物可利用性，为雨生红球藻孢子粉生产过程的质量控制和产品流通过程的质量监管提供可靠的技术方法。

本发明的原理是：

(1)二氯甲烷-正己烷(3∶1)只提取破壁孢子的虾青素，DMSO既提取破壁孢子也提取完整孢子中的虾青素

二氯甲烷-正己烷(3∶1)(二氯甲烷与正己烷按体积比3∶1混合)在室温(20-25℃)下可以完全提取破壁孢子的虾青素，但是不能提取完整孢子的虾青素，即使加温到50℃也不能提取完整孢子的虾青素。二甲基亚砜(DMSO)在70℃下可以将破壁孢子和完整孢子中的虾青素提取完全(表1)。用这两种方法分别提取、测定同一个样品的虾青素含量，测定结果的比值反映破壁孢子与全部孢子的比例，即孢子破壁率。

表1二氯甲烷-正己烷(3∶11)和二甲基亚砜(DMSO)提取红球藻虾青素的相对提取率

¹实验室培养雨生红球藻，离心采收红色孢子，冷冻真空干燥后获得完整孢子。

²完整孢子放入瓷研钵中，加入适量石英砂和液氮，充分研磨，制成完全破壁孢子粉。

³以二甲基亚砜相对提取率为100％计算二氯甲烷-正己烷(3∶1)的相对提取率，即二氯甲烷-正己烷(3∶1)提取、测定的虾青素含量与二甲基亚砜提取、测定的虾青素含量的比值。

(2)利用虾青素的光吸收系数A_1cm ^1％计算虾青素浓度

用虾青素标准样品(Sigma公司生产，纯度＞98％)实际测得DMSO溶解的虾青素在530nm的光吸收系数 $A_{1\mathrm{cm}}^{1\%}=1556,$ 表示浓度是1％(重量/体积)的虾青素DMSO溶液，在1cm光径比色杯，530nm波长下的光吸收值是1556。实验数据表明，在530nm波长下，虾青素DMSO溶液的光吸收值A与虾青素浓度呈良好的线性关系(图1)。所以，通过测定虾青素溶液的光吸收值A，根据虾青素的光吸收系数 $A_{1\mathrm{cm}}^{1\%}=1556,$ 可以计算虾青素溶液的浓度。

一种雨生红球藻孢子破壁率的测定方法，其步骤是：包括二氯甲烷-正己烷(3∶1)混合溶剂提取、测定样品虾青素含量和二甲基亚砜(DMSO)提取、测定样品虾青素含量两个测定步骤和一个计算步骤，其特征在于：

A、二氯甲烷-正己烷(3∶1)提取、测定虾青素含量：

二氯甲烷与正己烷都是分析纯试剂，体积比是3∶1。二氯甲烷-正己烷(3∶1)提取虾青素在一般室内温度(20-25℃)下进行，如室内温度低于20℃，可在25℃恒温水浴中提取。室内温度超过25℃，可在室内提取，不影响提取效果。

取雨生红球藻孢子粉约20mg，准确称量，记为W₁mg，放入10mL离心管中，加入5ml二氯甲烷-正己烷(3∶1)提取液，盖紧离心管盖，摇动离心管，使藻粉在提取液中分散均匀，在室温(20-25℃)下提取10分钟，提取过程间隔2-3分钟摇动离心管，使藻粉与提取液混匀，促进虾青素的提取；5000转/分钟离心5分钟，收集上清液；向离心管中加入5ml二氯甲烷-正己烷(3∶1)提取液，按上述方法重复提取一次，2次提取液合并到25ml容量瓶中，用二甲基亚砜(DMSO，分析纯试剂)定容，充分混匀后取1mL，放入10mL容量瓶中，DMSO定容后，用分光光度计，1cm光径比色杯，以DMSO为空白溶液，测量530nm波长光吸收值(A₁)，根据光吸收系数 $A_{1\mathrm{cm}}^{1\%}=1556$ 计算样品虾青素百分含量(C₁)：

C₁＝100％×(A₁×10×250)/1556W₁

B.二甲基亚砜(DMSO)提取、测定虾青素含量：

取雨生红球藻孢子粉约20mg，准确称量，记为W₂mg，放入10ml离心管中，加入5ml二甲基亚砜(分析纯试剂)，盖紧离心管盖，摇动离心管，使藻粉在提取液中分散均匀，70℃恒温水浴中提取10分钟，提取过程间隔2-3分钟摇动离心管，使材料与溶剂混匀，促进虾青素的提取；5000转/分钟离心5分钟，收集上清液；向离心管中加入5mlDMSO，按上述方法重复提取一次，2次提取液合并到25ml容量瓶中，用DMSO定容，充分混匀后取1ml，放入10ml容量瓶中，DMSO定容后，用分光光度计，1cm光径比色杯，以DMSO为空白溶液，测量530nm光吸收值(A₂)，根据DMSO溶解的虾青素溶液的光吸收系数 $A_{1\mathrm{cm}}^{1\%}=1556$ 计算样品虾青素含量(C₂)：

C₂＝100％×(A₂×10×250)/1556W₂；

C.计算孢子破壁率：

二氯甲烷-正己烷(3∶1)提取、测定的样品虾青素含量与二甲基亚砜提取、测定的样品虾青素含量的比值反映样品中破壁孢子与孢子总数的比例，即孢子破壁率。用公式计算孢子破壁率(R)：R＝C₁/C₂×100％。

所述的二氯甲烷与正己烷的体积比是3∶1。

所述的二氯甲烷-正己烷体积比是3∶1提取虾青素。

本发明与现有技术相比，具有以下效果和优点：

实验室培养雨生红球藻，离心采收红色孢子，冷冻真空干燥后获得完整孢子。准确称量雨生红球藻完整孢子，放入瓷研钵中，加入适量石英砂和液氮，充分研磨，制成完全破壁孢子粉，显微镜下观察未见完整孢子。将制备好的完全破壁孢子仔细地从研钵中转移到离心管内，按比例准确称量雨生红球藻完整孢子，加入离心管，配成已知破壁率的孢子粉。对于每个设定的孢子破壁率，同时制备3个平行样。用本发明方法测定孢子破壁率，用3个平行样的平均值表示样品孢子破壁率，结果见表2。

表2雨生红球藻孢子破壁率测定值与实际值的比较

¹实验室培养雨生红球藻，离心采收红色孢子，冷冻真空干燥后获得完整孢子。

²将红球藻孢子粉放入瓷研钵中，加入适量石英砂和液氮，充分研磨，制成完全破壁孢子粉。显微镜观察，未见完整孢子。

结果表明，孢子破壁率测定值与实际值有着良好的对应关系。在制备完全破壁孢子过程中，将完全破壁孢子从研钵转移到离心管时，材料会有微量的损失，这是造成测定值略低于实际值的原因。当实际测定雨生红球藻孢子粉样品的孢子破壁率时，操作步骤不包括材料的转移，孢子破壁率测定值会更接近实际值。

目前，国内外都没有报道可以测定红球藻孢子粉破壁率的方法。本发明是首次公开的测定雨生红球藻孢子粉破壁率的方法，方法简便、测量快速、结果准确。定量反映雨生红球藻有效成分虾青素的生物可利用性，为雨生红球藻孢子粉生产过程的质量控制和产品流通过程的质量监管提供了可靠的技术方法。

附图说明

图1虾青素530nm标准曲线。待测溶液的虾青素浓度在0.4-7.0μg/ml范围内，光吸收值A与虾青素浓度呈良好的线性关系。

具体实施方式

以经过破壁处理、喷雾干燥的雨生红球藻孢子粉破壁率的实际测定为例，进一步说明雨生红球藻孢子破壁率的测定方法。其步骤是：

1.二氯甲烷-正己烷(3∶1)提取、测定虾青素含量：

准确称量雨生红球藻孢子粉20.5mg，20.3mg和20.6mg(三个平行样)，分别放入三只10ml离心管中，每只离心管中加入5ml二氯甲烷-正己烷(3∶1)提取液，盖紧离心管盖，摇动离心管，使藻粉在提取液中分散均匀，在室温下(25℃)提取10分钟，提取过程中每间隔2-3分钟摇动离心管，使藻粉与提取液混匀，促进虾青素的提取；5000转/分钟离心5分钟，收集上清液；重复提取一次，合并提取液，放入25ml容量瓶，用DMSO定容，充分混匀后取1ml，放入10ml容量瓶中，DMSO定容后，用752紫外-可见分光光度计，1cm光径比色杯，DMSO为空白溶液，测定530nm波长光吸收值A₁，分别是0.2370，0.241和0.235。

用公式C₁＝100％×(A₁×10×250)/1556W₁计算样品虾青素百分含量，分别是1.858％，1.907％和1.833％，求得平均值1.866％。

2.DMSO提取、测定虾青素含量：

准确称量雨生红球藻孢子粉20.5mg，20.4mg和20.6mg(三个平行样)，分别放入三只10ml离心管中，每只离心管中加入5mlDMSO，盖紧离心管盖，摇动离心管，使藻粉在提取液中分散均匀，70℃恒温水浴中提取10分钟，提取过程中每隔2-3分钟摇动离心管，使材料与溶剂混匀，促进虾青素的提取；5000转/分钟离心5分钟，收集上清液；重复提取一次，合并提取液，放入25ml容量瓶，用DMSO定容，充分混匀后取1ml，放入10ml容量瓶中，DMSO定容后，用752紫外-可见分光光度计，1cm光径比色杯，DMSO为空白溶液，测定530nm波长光吸收值A₂，分别为0.295，0.30和0.299。

用公式C₂＝100％×(A₂×10×250)/1556W₂计算样品虾青素百分含量，分别是2.312％，2.363％和2.332％，求得平均值2.336％。

3.计算孢子破壁率

用公式R＝C₁/C₂×100％计算出孢子破壁率是79.88％。R代表孢子破壁率，C₁代表用二氯甲烷-正己烷(3∶1)提取、测定的虾青素含量，C₂代表DMSO提取、测定的虾青素含量。

用相同的方法测定另外二个样品孢子破壁率，三个样品的测定结果见表3。

表3雨生红球藻孢子粉破壁率测定结果

Claims (1)

1.一种雨生红球藻孢子破壁率的测定方法，其步骤是：

A、二氯甲烷-正己烷提取、测定虾青素含量，二氯甲烷-正己烷提取虾青素在室内进行，取雨生红球藻孢子粉，记为W₁_mg，放入10mL离心管中，加入5ml二氯甲烷-正己烷提取液，盖紧离心管盖，摇动离心管，使藻粉在提取液中分散均匀，在室温20-25℃下提取，提取过程间隔2-3分钟摇动离心管，使藻粉与提取液混匀，促进虾青素的提取；5000转/分钟离心，收集上清液；向离心管中加入5ml二氯甲烷-正己烷提取液，按上述方法重复提取一次，2次提取液合并到25ml容量瓶中，用二甲基亚砜定容，混匀后取1mL，放入10mL容量瓶中，二甲基亚砜定容后，用分光光度计，1cm光径比色杯，以二甲基亚砜为空白溶液，测量530nm波长光吸收值A₁，根据光吸收系数

计算样品虾青素百分含量C₁：

C₁＝100％×(A₁×10×250)/1556 W₁；

B.二甲基亚砜提取、测定虾青素含量：取雨生红球藻孢子粉，记为W₂ mg，放入10ml离心管中，加入5ml二甲基亚砜，盖紧离心管盖，摇动离心管，使藻粉在提取液中分散均匀，70℃恒温水浴中提取，提取过程间隔2-3分钟摇动离心管，使材料与溶剂混匀，促进虾青素的提取；5000转/分钟离心，收集上清液；向离心管中加入5ml二甲基亚砜，按上述方法重复提取一次，2次提取液合并到25ml容量瓶中，用二甲基亚砜定容，混匀后取1ml，放入10ml容量瓶中，二甲基亚砜定容后，用分光光度计，1cm光径比色杯，以二甲基亚砜为空白溶液，测量530nm光吸收值A₂，根据二甲基亚砜溶解的虾青素溶液的光吸收系数

计算样品虾青素含量C₂：

C₂＝100％×(A₂×10×250)/1556 W₂；

C.计算孢子破壁率：二氯甲烷-正己烷提取、测定的样品虾青素含量与二甲基亚砜提取、测定的样品虾青素含量的比值反映样品中破壁孢子与孢子总数的比例，即孢子破壁率，用公式计算孢子破壁率R：R＝C1/C2×100％；

所述的二氯甲烷-正己烷体积比是3∶1提取虾青素。

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