CN103760289B - 红肉桃果实中花色苷的提取和高效液相测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种红肉桃果实花色苷提取和高效液相测定方法，红肉桃果肉在果胶酶和纤维素酶的作用下，用提取液甲醇:水:磷酸:三氟乙酸=70:27:2:1(V/V)提取，色谱条件为：色谱柱：C18反相柱；流动相A：甲醇:磷酸:三氟乙酸=97:2:1(V/V)；流动相B：水:磷酸:三氟乙酸=97:2:1(V/V)；流速：1.0 ml/min；波长：525 nm；柱温：25℃；梯度冲洗：0~17 min，流动相B从95-44%；17~20 min，流动相B从44-95%。本发明的红肉桃果实花色苷的提取和高效液相色谱测定方法，能提取完全，有效分离红肉桃果实中的花色苷，操作简单，测定结果重复性好，精密度高, 整个样品检测分离过程仅需20 min即可完成。
Description
技术领域
本发明涉及红肉桃果实中花色苷的提取和高效液相测定方法，属于化学工业中的化学分析及仪器分析技术领域。
背景技术
桃果实具有很好的营养价值、药用价值和保健价值，富含大量对人类健康有益的化学物质和色素，包括维生素、花色苷等。
红肉桃果肉内含有大量花色苷，果实颜色鲜艳特殊，具有眼球效应，提高市场占有份额的潜力；同时抗氧化能力强，对人体健康非常有益。美国、意大利、西班牙、智利等国已开始重视富含有益健康成分的红肉桃品种选育，国内学者也开始对红肉桃资源进行评价和挖掘。从花色苷视角进行以有益健康为选育目标的红肉桃种质评价和创新研究工作已经开展，而明确花色苷的组分及含量是对红肉桃资源进行开发和利用的前提。
已有研究报道红肉桃（包括DBF基因型和bf基因型）中的花色苷成分为矢车菊素 3-葡萄糖苷和矢车菊素 3-芸香糖苷。其中DBF基因型红肉桃仅含矢车菊素 3-葡萄糖苷，bf基因型含矢车菊素 3-葡萄糖苷和矢车菊素 3-芸香糖苷两种花色苷。国内外对桃花色苷的组分分析均采用HPLC法，但是目前HPLC检测花色苷还存在很大不足，主要问题是流动相集中选择乙腈和甲酸等高毒高价格的试剂，还存在流动相组成复杂和梯度条件繁琐，检测时间长等问题。而在其它食品的花色苷测定中也存在同样的问题。
授权公告号 CN 101701945 B的中国发明专利授权了一种利用HPLC测定黑大豆种质种皮中花色苷构成谱及含量的方法，其流动相由流动相A和流动相B组成，所述流动相A 为10％ (V/V) 甲酸的水溶液；所述流动相B为乙腈:甲醇:水:甲酸＝ 25:25:40:10(V/V) 的混合溶液）组成复杂，价格昂贵。
公开(公告)号101776659A的中国发明专利公开了一种萝卜红色素中花色苷的高效液相色谱检测方法。其流动相为高毒高价格的乙腈甲酸（乙腈:5%甲酸=24:76）；所测定花色苷为天竺葵 3-葡萄糖苷。
而且目前对花色苷的提取多单纯地用甲醇或乙醇，提取效率不高，导致花色苷含量测量结果不准确。
发明内容
本发明的目的是提供一种能有效提取和准确测定红肉桃果实中花色苷的方法。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：一种红肉桃果实中花色苷提取和高效液相测定的方法，其步骤包括：
a 、配制花色苷的混合标准溶液，在色谱条件下高效液相色谱分析绘制标准溶液曲线；
其中色谱条件为：
色谱柱：C18反相柱；
流动相A：甲醇:磷酸:三氟乙酸=97:2:1(V/V)；
流动相B：水:磷酸:三氟乙酸=97:2:1(V/V)；
流速：1.0 ml/min；
波长：525 nm；
柱温：25℃；
梯度冲洗：0~17 min，流动相B从95-44%；17~20 min，流动相B从44-95%；
b、称取1g桃果肉，加入5mg果胶酶和5mg纤维素酶，同时加入2 ml提取液，避光超声波提取10 min，4℃下10000 rpm离心10 min，取上清液经0.22 mm有机滤头过滤，即配制成样品溶液，其中提取液的配比为甲醇:水:磷酸:三氟乙酸=70:27:2:1(V/V)；
c、在色谱条件下对样品溶液进行高效液相色谱分析，色谱条件同步骤a；
d、将样品溶液的分析结果与标准曲线做比对，得出样品溶液中的花色苷含量。
进一步的，步骤a中配制花色苷的混合标准溶液的步骤为：分别准确称取1 mg各种花色苷标准品，用1 ml提取液溶解，制得浓度为1000 mg/L的标准溶液；分别移取0.50ml各标准溶液，混合并用提取液逐级稀释，制得各级混合标准溶液，各级混合标准溶液浓度分别为500、100 、50、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01mg/L。
进一步的，所述花色苷包括矢车菊素 3-葡萄糖苷和矢车菊素 3-芸香糖苷。
本发明的红肉桃果实花色苷的提取和测定方法中，采用甲醇:水:磷酸:三氟乙酸混合溶液作为提取液，三氟乙酸的加入可有效保护花色苷羟基和防止脱氯反应，花色苷在提取液中的溶解性好，稳定性高，果胶酶和纤维素酶能将桃果肉细胞破壁，进一步提高花色苷的提取效率，使用该提取条件基本可实现花色苷的完全提取，提取效率比单用甲醇提取效率高一倍；确定的色谱条件特别适合于分离测定红肉桃果肉中的花色苷，选用的流动相成分简单，成本低廉，且灵敏度高，在DBF基因型红肉桃果肉中也能检测出微量的矢车菊素 3-芸香糖苷。本发明方法能有效完全的提取和分离果肉中的花色苷，操作简单，测定结果重复性好，精密度高, 整个样品检测分离过程仅需20 min即可完成。
附图说明
图1为2种花色苷混合标准溶液的HPLC图，其中1. 矢车菊素 3-葡萄糖苷；2.矢车菊素 3-芸香糖苷。
图2为DBF基因型红肉桃‘北京一线红’品种果肉样品中花色苷的HPLC图，其中1. 矢车菊素 3-葡萄糖苷；2.矢车菊素 3-芸香糖苷。
图3为bf基因型红肉桃‘黑油桃’品种果肉样品中花色苷的HPLC图，其中. 1.矢车菊素 3-葡萄糖苷；2.矢车菊素 3-芸香糖苷。
图4 为对比例1中‘黑油桃’的花色苷含量表。
下面结合附图对本发明的实施方式做进一步说明。
具体实施方式
试剂与设备：
2种花色苷标准品包括矢车菊素 3-葡萄糖苷和矢车菊素 3-芸香糖苷均购自Sigma公司，纯度≥98%；三氟乙酸、甲醇、磷酸试剂均为色谱纯。
超声波清洗器，离心机，Agilent高效液相色谱系统：1100系列，VWD紫外检测器，Agilent ZORBAX SB-C18色谱分析柱（4.6×250 mm，5μm）。
实施例1
a、配制2种花色苷的混合标准溶液：分别准确称取1 mg矢车菊素 3-葡萄糖苷标准品和1 mg矢车菊素 3-芸香糖苷标准品，用1 ml提取液溶解，制得浓度为1000 mg/L的标准溶液，其中提取液配比为甲醇:水:磷酸:三氟乙酸=70:27:2:1(V/V)；分别移取0.50 ml各标准溶液，混合并用提取液逐级稀释，制得各级别混合标准溶液；取浓度为100mg/L的标准溶液，经高效液相色谱分析得到标准溶液曲线，见图1，色谱条件为：
色谱柱：C18反相柱；
流动相A：甲醇:磷酸:三氟乙酸=97:2:1(V/V)；
流动相B：水:磷酸:三氟乙酸=97:2:1(V/V)；
流速：1.0 ml/min；
波长：525 nm；
柱温：25℃；
梯度冲洗：0~17 min，流动相B从95-44%；17~20 min，流动相B从44-95%；
b、准确称取1g‘北京一线红’红肉桃品种成熟果实果肉，加入5mg果胶酶和5mg纤维素酶，同时加入2 ml提取液，避光超声波提取10 min，4℃下10000 rpm离心10 min，取上清液经0.22 mm有机滤头过滤，即配制成样品溶液。花色苷提取过程应尽量快速和避光，防止花色苷损耗。
c、对样品溶液进行高效液相色谱分析，进样量为5μl，得到样品溶液的色谱图，见图2和图3，色谱条件同标准溶液曲线的色谱条件。
d、将样品溶液的色谱图与标准溶液曲线比对，得到红肉桃果肉中各种花色苷的含量，见表1，单位为mg/kg，即每kg果肉中含有的含量。
实施例2
准确称取1g‘黑油桃’品种成熟果实果肉，加入5mg果胶酶和5mg纤维素酶，同时加入2 ml提取液，避光超声波提取10 min，4℃下10000 rpm离心10 min，取上清液经0.22 mm有机滤头过滤，即配制成样品溶液。进色谱柱进样量为5μl，色谱条件同实施例1，所得样品溶液的色谱图见图3，桃果肉中花色苷的含量见表1。
对比例1
准确称取1g‘黑油桃’品种成熟果实果肉9份，其中3份加入2ml甲醇；3份加入2ml提取液;另3份加入5mg果胶酶和5mg纤维素酶,再加入2ml提取液。全部样品避光超声波提取10 min，4℃下10000 rpm离心10 min，取上清液经0.22 mm有机滤头过滤后进色谱柱，进样量为5μl，色谱条件同实施例1，测得果肉中花色苷的平均含量见图4。
表1：各种品种红肉桃果肉中花色苷含量表
表2：实施例1的标准溶液曲线线性回归方程、相关系数、最低检出限、相对标准偏差和回收率的结果表。
提取液和流动相的选择：红肉桃果实中花色苷的提取需要在酸性条件下进行，且需要保证细胞壁破裂，花色苷提出完全，同时保护花色苷羟基和防止脱氯反应，所以选择加入5mg果胶酶和5mg纤维素酶，再加入甲醇:水:磷酸:三氟乙酸=70:27:2:1(V/V)为提取液，提取完全程度显著增加。
流动相为了保证与提取液条件一致，用 2%磷酸和1%三氟乙酸（体积比）调节甲醇和水的PH，能很好地对两种花色苷进行分离。
波长的选择：对每种花色苷标准溶液的吸光度通过VWD检测器进行扫描，确定能同时检测上述花色苷的最佳波长为525nm。
流速的选择： C18柱的流速通常设为1.0 ml/min左右，本发明考察了1.0 ml/min的流速，发现出峰效果很好，可正常使用。
温度的选择：为了保证花色苷稳定，本实验选择在室温25℃，已完全达到要求。
经测定，2种花色苷的线性回归方程、相关系数、最低检出限、相对标准偏差和回收率的结果见表2。在相应的线性范围内，各种花色苷线性关系好，相关系数均达0.9999以上；本发明的RSD在1.21~2.33% 以内，回收率为92~96%，精密度较高，结果准确。
据研究报道(SHEN Zhi–jun, CONFOLENT C, LAMBERT P, POESSEL, QUILOT–TURION B, YU Ming–liang, MA Rui–juan, PASCAL T. Characterization and genetic mapping of a new blood-flesh trait controlled by the single dominant locus DBF in peach[J]. Tree Genetics & Genomes, 2013, 9:1435–1446.)， DBF基因型红肉桃仅含矢车菊素 3-葡萄糖苷，从本发明的图2可以看出，DBF基因型红肉桃‘北京一线红’能检测出微量的矢车菊素 3-芸香糖苷，说明本方法灵敏度非常高，非常适用于红肉桃果实中花色苷组分的提取和检测。
Claims (2)
1.一种红肉桃果实中花色苷的提取和高效液相测定方法，其步骤包括：
a 、配制花色苷的混合标准溶液，在色谱条件下高效液相色谱分析绘制标准溶液曲线，
其中色谱条件为：
色谱柱：C18反相柱；
流动相A：体积比甲醇:磷酸:三氟乙酸=97:2:1；
流动相B：体积比水:磷酸:三氟乙酸=97:2:1；
流速：1.0 ml/min；
波长：525 nm；
柱温：25℃；
梯度冲洗：0~17 min，流动相B从95-44%；17~20 min，流动相B从44-95%；
b、称取1g桃果肉，加入5mg果胶酶和5mg纤维素酶，同时加入2 ml提取液，避光超声波提取10 min，4℃下10000 rpm离心10 min，取上清液经0.22 mm有机滤头过滤，即配制成样品溶液，其中提取液的配比为体积比甲醇:水:磷酸:三氟乙酸=70:27:2:1；
c、在色谱条件下对样品溶液进行高效液相色谱分析，色谱条件同步骤a；
d、将样品溶液的分析结果与标准溶液曲线做比对，得出样品溶液中的花色苷含量；
所述花色苷为矢车菊素 3-葡萄糖苷和矢车菊素 3-芸香糖苷。
2.根据权利要求1所述的红肉桃果实中花色苷的提取和高效液相测定方法，其特征在于：步骤a中配制花色苷的混合标准溶液的步骤为：分别准确称取1 mg各种花色苷标准品，用1 ml提取液溶解，制得浓度为1000 mg/L的标准溶液；分别移取0.50 ml各标准溶液，混合并用提取液逐级稀释，制得各级混合标准溶液，各级混合标准溶液浓度分别为500、100 、50、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01mg/L。
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