CN106802281A

CN106802281A - 一种快速测定雨生红球藻孢子破壁率的方法

Info

Publication number: CN106802281A
Application number: CN201510843135.9A
Authority: CN
Inventors: 骆野鸣
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2015-11-26
Filing date: 2015-11-26
Publication date: 2017-06-06

Abstract

本发明公开了一种快速测定雨生红球藻孢子破壁率的方法，其步骤是：A、丙酮提取、测定已知样品的虾青素吸光度，B、对已知样品研磨、匀浆使其破壁率达到100%后用丙酮提取、测定100%破壁样品的虾青素吸光度，丙酮提取、测定已知样品的虾青素吸光度（吸光值A1）和对已知样品研磨、匀浆使其破壁率达到100%后用丙酮提取、测定100%破壁样品的虾青素吸光度（吸光值A2）的比例，即孢子破壁率；本发明方法操作仅须三个步骤，操作简单、计算简便（不需要算出虾青素的实际含量，仅需将2个样品吸光度A1和A2相除得到对应的比例结果）、高效快捷（全过程约15-20分钟），非常适合雨生红球藻制品生产加工过程的实时监控和质量控制。

Description

一种快速测定雨生红球藻孢子破壁率的方法

技术领域

本发明属于微藻检测的生物技术领域，尤其是涉及一种快速测定雨生红球藻孢子破壁率的方法。

背景技术

虾青素（Astaxanthin），化学名称为3,3'-二羟基-β,β-胡萝卜素-4,4'-二酮，分子式为C40H52O4，是一种酮式类胡萝卜素，其天然产物多数以酯的形式存在，具有非水溶性和亲脂性，易溶于二硫化碳、丙酮、苯和氯仿等有机溶剂。雨生红球藻是世界上公认的最富含虾青素的原料，其虾青素含量可达细胞干重的5%以上，是天然抗氧化剂的浓缩品。此外，雨生红球藻含有丰富的蛋白质、多糖、维生素、微量元素和天然色素等营养成分，而在全球备受瞩目，其价值被广泛应用于医药、化妆品、健康食品，是目前科学界发现的继螺旋藻、小球藻之后，新一代藻类食品。根据《中华人民共和国食品安全法》和《新资源食品管理办法》的规定，2010年卫生部批准雨生红球藻为新资源食品（中华人民共和国卫生部第17号公告），允许作为普通食品生产和经营，同时可作为提取天然虾青素的原料。

雨生红球藻（Haematococcus pluvialis ) 属于团藻目，红球藻科，是一种广泛存在的淡水单细胞绿藻。雨生红球藻通常为有两根鞭毛可以自行游动的营养细胞(vegetative)，细胞周围有透明多糖类的凝胶状的柔软细胞壁。当它处在不利环境时（如强紫外线,或营养缺乏、温度变化等），细胞受到环境胁迫形成厚壁孢子（Cyst）并大量累积虾青素，形成对自我机体的保护。（Boussiba et aL 1992）。含有虾青素的雨生红球藻的厚壁孢子具有坚韧的细胞壁，若直接利用，其生物有效利用率低，且坚韧的细胞壁会阻碍有机溶剂进入细胞内提取虾青素[5]。因此在无论是直接食用，或者提取虾青素前必须对孢子态细胞进行破壁处理，破坏雨生红球藻的细胞壁结构，以促进虾青素的提取和生物利用率。雨生红球藻的破壁率是雨生红球藻产品生物利用率的一个重要指标；也是作为工业化提取虾青素的重要生产指标。目前，我国雨生红球藻行业是一个新兴的行业，尚无完善的检测方法和质量标准。建立完善和有效的检测方法，是促进雨生红球藻行业发展的基本要求。

雨生红球藻的破壁的原因有两种：（1）培养过程中由于物理、化学、生物污染等问题导致的雨生红球藻破壁，其结果为红球藻细胞死亡，细胞内的虾青素含量下降，并在一段时间内完全降解，此类细胞破坏的红球藻没有市场价值；（2）为了提取、加工雨生红球藻产品而设计的主动破壁工艺生产的破壁雨生红球藻细胞，此类工艺短暂停留后经过后加工处理，虾青素保留完整不损耗，是目前破壁雨生红球藻细胞的主要价值所在。

目前，雨生红球藻的破壁率测定方法包括：1、细胞计数法：利用“平板计数框”在显微镜下对破壁前后的细胞进行计数统计，再根据公式计算破壁率：R=（细胞总数-破壁后剩余细胞数）/细胞总数；由于是人工计数，计数单位较小且须在显微镜下进行，此法容易造成巨大误差，难于用作定量分析使用。2、专利《雨生红球藻孢子破壁率的测定方法》（公开号CN 101609039 A）中公开了一种溶剂法测定方法：此方法原理主要是利用了二氯甲烷-正己烷混合溶液和二甲基亚砜（DMSO）溶液对雨生红球藻破壁和未破壁细胞中的虾青素溶解度不同，从而进行2次测定进行结果比较计算雨生红球藻的破壁率；但存在以下问题：（1）上述专利的原理主要在于二甲基亚砜能提取出未破壁的雨生红球藻中的虾青素，其方法需要建立在准确测定虾青素的含量的基础上；但实际应用发现，二氯甲烷、正己烷、二甲基亚砜虽然都属于亲酯性有机溶剂，能够穿透未破壁的雨生红球藻孢子胞壁进入细胞，但细胞内的天然虾青素90%以上却以酯化形式存在（约70%的单酯、25%的双酯及5%的单体），酯化分子较大，而完整孢子壁厚而坚固，其内部的虾青素难以全部通过细胞壁被萃取出来，因此，上述专利方法在70℃下不能完全提取完整红球藻细胞中的虾青素，容易造成较大误差；（2）二甲基亚砜提取效率受雨生红球藻质量干扰较大，对于不同批次生产的雨生红球藻其测定结果不稳定，难以适应大规模生产时质量检测的可靠性；（3）雨生红球藻细胞中除虾青素外，还含有大量的叶绿素、黄色素等杂质，容易被二甲基亚砜等溶剂提取，而其测定时的吸光度与虾青素吸光度接近，其测定结果容易受到这些杂质的干扰造成测定误差；（4）上述专利采用了两种溶剂（二氯甲烷-正己烷混合溶液和二甲基亚砜），这两种溶剂对于虾青素的吸收波长有差异，但都以相同DMSO为对照在530nm测定的吸光度不匹配，易导致最终计算破壁率的误差，不利于质量控制过程的准确性和有效性；（5）有机溶剂能使天然虾青素异构化降解，而且在碱性条件下，易发生不可逆的变性；（6）正己烷-二氯甲烷属于非极性与水互不溶，如果样品原料中含水量高，就无法与样品充分接触，无法萃取出色素。而实际破壁加工过程含有大量水分，若干燥处理后再分析，增加处理成本，且散失了实时质量控制的意义。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种准确、高效、稳定、易操作的雨生红球藻孢子破壁率的检测方法，本方法能够定量有效地反映雨生红球藻产品在生产、加工、销售过程中的破壁效率，尤其为雨生红球藻制品提供了质量控制和监控的可靠的技术检测方法。

本发明的原理是：丙酮在常温常压下可以完全萃取雨生红球藻破壁孢子中的虾青素，而不能萃取出完整的红球藻孢子中的虾青素，用紫外分光光度计（最大吸收波长475nm）测定雨生红球藻虾青素的含量，丙酮在未完全破壁雨生红球藻孢子中萃取出的虾青素含量和雨生红球藻中总虾青素含量的比值，即为雨生红球藻孢子的破壁率。根据虾青素含量的计算公式，破壁率的计算为2个虾青素含量公式相除，实际操作中不需要计算虾青素的含量，只需要计算测定虾青素的吸光度，计算其比值即可。

一种快速测定雨生红球藻孢子破壁率的方法，其步骤是：包括丙酮提取、测定已知样品的虾青素吸光度（吸光值A1），对已知样品研磨、匀浆使其破壁率达到100%后用丙酮提取、测定100%破壁样品的虾青素吸光度（吸光值A2）两个测量步骤，和一个计算步骤；其特征在于：

A、丙酮提取、测定已知样品的虾青素吸光度：

雨生红球藻样品包括鲜藻、藻浆、藻粉及含藻浆或藻粉的雨生红球藻制品（如藻片、胶囊等），丙酮的分析纯≥99.5%；

精确称取定量雨生红球藻样品置于100ml容量瓶中，加入丙酮100ml定容至刻度，在室温（20-25℃）下萃取5-15分钟，充分振荡使虾青素充分析出，将上述溶液转移至离心管，用3500-5000rpm离心2-5分钟，使溶液和藻渣分离，取离心后上清液5ml转移至100ml容量品，丙酮定容至100ml（即稀释20倍），用紫外分光光度计（1cm光径比色杯，以丙酮为空白对照溶液）测量475nm波长光吸光度A1；

B、对已知样品研磨、匀浆使其破壁率达到100%后用丙酮提取、测定100%破壁样品的虾青素吸光度：

雨生红球藻样品包括鲜藻、藻浆、藻粉及含藻浆或藻粉的红球藻制品（如藻片、胶囊等），丙酮的分析纯≥99.5%；

精确称取定量雨生红球藻样品（上述相同样品）置于试管分散机中，加入少量丙酮（2-5ml），5000-10000rpm研磨5分钟（或组织匀浆机10000-15000转匀浆5分钟或充分研磨），将分散试管内的混合样品转移至100ml容量瓶中，用丙酮将附着的色素完全洗脱直至无色，并将全部液体转移到容量瓶中，加入丙酮100ml定容至刻度，在室温（20-25℃）下萃取5-15分钟，充分振荡使虾青素充分析出，将上述溶液转移至离心管，用3500-5000rpm钟离心2-5分钟，使溶液和藻渣分离，取离心后上清5ml转移至100ml容量品，丙酮定容至100ml（稀释20倍），用紫外分光光度计（1cm光径比色杯，以丙酮为空白对照溶液）测量475nm波长光吸光度A2；

C、计算孢子破壁率：

丙酮提取、测定已知样品的虾青素吸光度（吸光值A1）和对已知样品研磨、匀浆使其破壁率达到100%后用丙酮提取、测定100%破壁样品的虾青素吸光度（吸光值A2）的比例，即孢子破壁率，用公式计算孢子破壁率（A）：A = A1/A2×100%。

进一步的，本发明方法中所述的雨生红球藻样品包括鲜藻、藻浆、藻粉及含藻浆或藻粉的红球藻制品（如藻片、胶囊）。

进一步的，本发明方法中所述的丙酮的分析纯≥99.5%。

进一步的，本发明方法中所述的分析纯≥99.5%的丙酮试剂可替换为紫外吸收光谱分析常用的有机溶剂，如：甲醇、乙醇、己烷、四氯化碳、石油醚、二硫化碳、氯仿、二甲基亚砜中的一种或多种。

进一步的，本发明方法中所述的对已知样品研磨、匀浆使其破壁率达到100%是指：将已知样品研磨后随机取出一份在显微镜下观察是否达到100%破壁效果，如果未达到，继续研磨，直至100%完全破壁为止。

进一步的，本发明方法中使所述的已知样品破壁率达到100%的方法为包括研磨、组织匀浆、高压均质、球磨、试管分散在内的物理方法。

本发明与现有技术相比，具有以下效果和有点：

（1）本发明采取通过研磨红球藻孢子全部破壁后再测量的方法，可以避免细胞中的虾青素不完全被溶出的问题；

（2）本发明方法操作过程处于常温常压状态，不需加热，与对比专利文件中需要水浴加热比减少了操作步骤；

（3）本发明方法采用单一溶剂，对照试剂也为相同溶剂，该溶剂简单易得，最重要的是提高了仪器检测的稳定性和准确性；

（4）本发明方法采用了物理辅助手段，将未破壁的细胞物理进行100%破壁，保证了计算基数（总虾青素）的准确性，大大提高了结果的准确性；

（5）本发明方法不涉及高效液相色谱法（HPLC），免除了虾青素标准品，既降低分析测试成本，又减少了每次测试需要制作标准品的步骤，从而提高了效率；

（6）本发明方法操作仅须三个步骤，操作简单、计算简便（不需要算出虾青素的实际含量，仅需将2个样品吸光度A1和A2相除得到对应的比例结果）、高效快捷（全过程约15-20分钟），非常适合雨生红球藻制品生产加工过程的实时监控和质量控制。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施方式，对本发明做进一步详细说明。在此，本发明的示意性实施方式及其说明用于解释本发明，但并不作为对本发明的限定。

本发明所述雨生红球藻样品可选用鲜藻、藻浆、藻粉及含藻浆或藻粉的红球藻制品（如藻片、胶囊等），以下具体以鲜藻浆为例，进一步说明快速测定雨生红球藻孢子破壁率的方法。其步骤是：

A、丙酮提取、测定已知样品的虾青素吸光度：

丙酮的分析纯≥99.5%，

1）使用天平精确称取0.1g雨生红球藻样品置于100ml容量瓶中，

2）加入丙酮100ml定容至刻度，在室温（20-25℃）下萃取5-15分钟，充分振荡使虾青素充分析出，

3）将上述溶液转移至离心管，在离心机中用3500rpm离心3分钟，使溶液和藻渣分离，

4）取离心后上清液5ml转移至100ml容量品，用丙酮定容至100ml（即稀释20倍），

5）用紫外分光光度计（1cm光径比色杯，以丙酮为空白对照溶液）测量475nm波长光吸光度A1；

丙酮的分析纯≥99.5%，

1）精确称取0.1g雨生红球藻样品（上述相同样品）置于试管分散机中，

2）加入少量丙酮（2-5ml），5000rpm研磨5分钟，将分散试管内的混合样品转移至100ml容量瓶中，用丙酮将附着的色素完全洗脱直至无色，并全部转移到容量瓶中，

3）加入丙酮100ml定容至刻度，在室温（20-25℃）下萃取5-15分钟，充分振荡使虾青素充分析出，

4）将上述溶液转移至离心管，用3500rpm钟离心3分钟，使溶液和藻渣分离，

5）取离心后上清5ml转移至100ml容量品，丙酮定容至100ml（稀释20倍），

6）用紫外分光光度计（1cm光径比色杯，以丙酮为空白对照溶液）测量475nm波长光吸光度A2；

C、计算孢子破壁率：

丙酮提取、测定已知样品的虾青素吸光度（吸光值A1）和对已知样品研磨、匀浆使其破壁率达到100%后用丙酮提取、测定100%破壁样品的虾青素吸光度（吸光值A2）的比例，即孢子破壁率。用公式计算孢子破壁率（A）：A = A1/A2×100%。

由于本发明方法所述的分析纯≥99.5%的丙酮试剂可替换为紫外吸收光谱分析常用的有机溶剂，如：甲醇、乙醇、己烷、四氯化碳、石油醚、二硫化碳、氯仿、二甲基亚砜；其操作原理和步骤以及测定效果与丙酮完全相同，故以下实施例仅以丙酮为试剂具体说明。

实施例1（破壁雨生红球藻浆），

范围：常用在雨生红球藻破壁加工过程中破壁率的检测和质量控制，

样品来源：培养成熟的雨生红球藻孢子细胞（含虾青素）经过滤、脱水后，用乙醇调整藻浆浓度至10-15%，经高压均质机（GEA Ariete NS2006，Italy）压力600bar细胞破壁，得到破壁雨生红球藻浆；

A、丙酮提取、测定已知样品的虾青素吸光度：

丙酮的分析纯≥99.5%，

1）天平精确称取样品藻浆0.105g、0.102g和0.101g（3个平行样品），分别置于100ml容量瓶中，2）在三个容量瓶中，分别加入丙酮100ml定容至刻度，在室温（20-25℃）下萃取10分钟，充分振荡使虾青素充分析出，提取过程间隔2-3分钟充分摇匀，3）将上述三个溶液分别移至三个离心管，用离心机5000rpm离心3分钟，4）用移液枪（或吸管）取离心后上清液5ml转移至100ml容量瓶，用丙酮定容至100ml，5）用紫外分光光度计，1cm光径比色杯，以丙酮为空白对照溶液，测量475nm波长光吸光度；分别为0.561,0.567,0.574，平均吸光度值A1为0.567；

丙酮的分析纯≥99.5%，

1）天平精确称取样品藻浆0.102g、0.103g和0.100g（3个平行样品），分别置于分散试管中，2）向试管中分别加入丙酮2ml，5000rpm研磨5分钟，将试管内液体全部转移至100ml容量瓶中，用丙酮将附着于试管内的色素完全洗脱直至无色，并全部转移到容量瓶中，3）加入丙酮100ml定容至刻度，在室温（20-25℃）下萃取10分钟，充分振荡使虾青素充分析出，提取过程间隔2-3分钟充分摇匀，4）将上述溶液分别转移至3个离心管，用离心机5000rpm离心3分钟，5）用移液枪（或吸管）取离心后上清5ml转移至100ml容量瓶，丙酮定容至100ml（稀释20倍），6）用紫外分光光度计，1cm光径比色杯，以丙酮为空白对照溶液，测量475nm波长光吸光度，分别为0.650,0.641,0.669，平均吸光度值A2为0.653；

C、计算孢子破壁率：

丙酮提取、测定已知样品的虾青素吸光度（吸光值A1）和对已知样品研磨、匀浆使其破壁率达到100%后用丙酮提取、测定100%破壁样品的虾青素吸光度（吸光值A2）的比例，即孢子破壁率。用公式计算孢子破壁率（A）：A = A1/A2×100%，则雨生红球藻浆的雨生红球孢子破壁率为86.83%。

实施例2 （破壁雨生红球藻粉），

范围：常用在破壁雨生红球藻粉质量检验，是破壁雨生红球藻粉产品的质量指标，

样品来源：培养成熟的雨生红球藻孢子细胞（含虾青素）经过滤、脱水后，用乙醇调整藻浆浓度至10-15%，经高压均质机（GEA Ariete NS2006，Italy）压力1200bar细胞破壁，得到破壁雨生红球藻浆；破壁藻浆经过烘箱干燥（喷雾、滚筒、微波、冻干等干燥方法，不同的干燥方法加工的产品，萃取时间不同约5-15分钟）脱水后，得到水分含量≤10%的破壁雨生红球藻粉；

A、丙酮提取、测定已知样品的虾青素吸光度：

丙酮的分析纯≥99.5%，

1）天平精确称取样品藻粉0.102g、0.101g（2个平行样品），分别置于100ml容量瓶中，2）在2个容量瓶中，分别加入丙酮100ml定容至刻度，在室温（20-25℃）下萃取5-15分钟，充分振荡使藻粉分散，并使虾青素充分析出，提取过程间隔2-3分钟摇匀，3）将上述2个溶液分别移至2个离心管，用离心机3500rpm离心3分钟，4）用移液枪（或吸管）取离心后上清液5ml转移至100ml容量瓶，用丙酮定容至100ml，5）用紫外分光光度计，1cm光径比色杯，以丙酮为空白对照溶液，测量475nm波长光吸光度；分别为0.457，0.434，平均吸光度值A1为0.446；

丙酮的分析纯≥99.5%，

1）天平精确称取样品藻粉0.101g和0.103g（2个平行样品），分别置于分散试管中，2）向试管中分别加入丙酮5ml，8000rpm研磨5分钟，将试管内液体全部转移至100ml容量瓶中，用丙酮将附着于试管内的色素完全洗脱直至无色，并全部转移到容量瓶中，3）加入丙酮100ml定容至刻度，在室温（20-25℃）下萃取5-15分钟，充分振荡使藻粉分散，并使虾青素充分析出，提取过程间隔2-3分钟充分摇匀，4）将上述溶液分别转移至3个离心管，用离心机3500rpm离心3分钟，5）用移液枪（或吸管）取离心后上清5ml转移至100ml容量瓶，丙酮定容至100ml（稀释20倍），6）用紫外分光光度计，1cm光径比色杯，以丙酮为空白对照溶液，测量475nm波长光吸光度，分别为0.57,8，0.591，平均吸光度值A2为0.585；

C、计算孢子破壁率

丙酮提取、测定已知样品的虾青素吸光度（吸光值A1）和对已知样品研磨、匀浆使其破壁率达到100%后用丙酮提取、测定100%破壁样品的虾青素吸光度（吸光值A2）的比例，即孢子破壁率。用公式计算孢子破壁率（A）：A = A1/A2×100%，则雨生红球藻粉的雨生红球孢子破壁率为76.22%。

实施例3（雨生红球藻片），

范围：常用在以破壁雨生红球藻粉为原料制成片剂产品的质量检验和鉴定，

样品来源：以经细胞破壁、干燥后的破壁雨生红球藻粉为原料，经研磨、过筛、配料、混合、压片、包装等工艺制成得到雨生红球藻片。本次使用的藻片规格0.5g/片，虾青素含量为0.6%；

补充说明：不同厂家生产的雨生红球藻片中虾青素的含量不同，因此在使用紫外分光光度计检测吸光度时，应根据藻片中所含虾青素的浓度调整稀释倍数，如果该测定的吸光值大于1.25那么需要对该溶液进行适量稀释，使其吸光值介于0.4-0.8之间为宜，以保证测量的准确性；

A、丙酮提取、测定已知样品的虾青素吸光度：

丙酮的分析纯≥99.5%，

1）取成品藻片4片，分为2片一组对照，天平分别称量记录重量为1.015g和1.022g，2）称重后的藻片分次放入研钵中捣成小块（目的在于破坏片剂包衣，让内容物裸露出来即可，不需要磨碎），将2组碎片分别置于2个100ml容量瓶中，3）在容量瓶中分别加入丙酮100ml定容至刻度，在室温（20-25℃）下萃取5-15分钟，充分振荡使碎片溶解，并虾青素充分析出，提取过程间隔2-3分钟摇匀，4）将上述溶液移至离心管，用离心机5000rpm离心5分钟，4）用移液枪（或吸管）分别取离心后上清液2ml转移至10ml容量瓶，用丙酮定容至10ml（稀释5倍），5）用紫外分光光度计，1cm光径比色杯，以丙酮为空白对照溶液，测量475nm波长光吸光度，吸光度值A1为0.518和0.533，平均吸光度值为0.526；

丙酮的分析纯≥99.5%，

1）取成品藻片2片天平精确称量记录重量为1.035g和1.026，2）称重后的藻片放入研钵中充分研磨粉碎至细粉，置于分散试管中，3）向试管中加入丙酮5ml，7000rpm研磨5分钟，将试管内液体全部转移至100ml容量瓶中，用丙酮将附着于试管内的色素完全洗脱直至无色，并全部转移到容量瓶中，4）加入丙酮100ml定容至刻度，在室温（20-25℃）下萃取5-10分钟，充分振荡使粉末分散，并使虾青素充分析出至粉末无色，提取过程间隔2-3分钟充分摇匀，5）将上述溶液分别转移至离心管，用离心机5000rpm离心5分钟，6）用移液枪（或吸管）取离心后上清2ml转移至10ml容量瓶，丙酮定容至10ml（稀释5倍），6）用紫外分光光度计，1cm光径比色杯，以丙酮为空白对照溶液，测量475nm波长光吸光度，分别为0.613和0.596，平均吸光度值A2为0.605；

C、计算孢子破壁率：

丙酮提取、测定已知样品的虾青素吸光度（吸光值A1）和对已知样品研磨、匀浆使其破壁率达到100%后用丙酮提取、测定100%破壁样品的虾青素吸光度（吸光值A2）的比例，即孢子破壁率。用公式计算孢子破壁率（A）：A = A1/A2×100%，则雨生红球藻片中的雨生红球孢子破壁率为86.93%。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步的详细说明，所应理解的是，以上所述为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改，等同替换，改进等，均包含在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种快速测定雨生红球藻孢子破壁率的方法，其步骤是：

A、丙酮提取、测定已知样品的虾青素吸光度：

C、计算孢子破壁率

丙酮提取、测定已知样品的虾青素吸光度（吸光度值A1）和对已知样品研磨、匀浆使其破壁率达到100%后用丙酮提取、测定100%破壁样品的虾青素吸光度（吸光度值A2）的比例，即孢子破壁率；

用公式计算孢子破壁率（A）：A = A1/A2×100%。

2.根据权利要求1所述快速测定雨生红球藻孢子破壁率的方法，其特征在于：所述的雨生红球藻样品包括鲜藻、藻浆、藻粉及含藻浆或藻粉的红球藻制品（包括藻片或胶囊）。

3.根据权利要求1所述快速测定雨生红球藻孢子破壁率的方法，其特征在于：所述的丙酮为分析纯≥99.5%。

4.根据权利要求1所述快速测定雨生红球藻孢子破壁率的方法，其特征在于：所述的丙酮试剂可替换为紫外吸收光谱分析常用的有机溶剂，为甲醇、乙醇、己烷、四氯化碳、石油醚、二硫化碳、氯仿、二甲基亚砜中的一种或几种。

5.根据权利要求1所述快速测定雨生红球藻孢子破壁率的方法，其特征在于：所述的对已知样品研磨、匀浆使其破壁率达到100%是指：将已知样品研磨后随机取出一份在显微镜下观察是否达到100%破壁效果，如果未达到，继续研磨，直至100%完全破壁为止。

6.根据权利要求1所述快速测定雨生红球藻孢子破壁率的方法，其特征在于：使所述的已知样品破壁率达到100%的方法为包括研磨、组织匀浆、高压均质、球磨、试管分散在内的物理方法。