CN108913746A - 通过提高红法夫酵母生物量合成虾青素及测定的方法 - Google Patents

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CN108913746A CN201810795769.5A CN201810795769A CN108913746A CN 108913746 A CN108913746 A CN 108913746A CN 201810795769 A CN201810795769 A CN 201810795769A CN 108913746 A CN108913746 A CN 108913746A
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N5/00—Analysing materials by weighing, e.g. weighing small particles separated from a gas or liquid

Abstract

本发明公开了一种通过提高红法夫酵母生物量合成虾青素及测定的方法，合成方法的具体步骤如下：步骤一、摇瓶种子培养：取一环斜面保存的红法夫酵母菌苔培养，得到一代摇瓶种子培养液，再将其扩大培养3～4代，获得摇瓶种子培养液；步骤二、车间种子培养：将摇瓶种子培养液接继续接种、培养，得到车间种子培养液；步骤三、发酵生产：将车间种子培养液继续接种、发酵且发酵培养基添加有番茄粉，得到发酵液。测定方法的具体过程如下：红法夫酵母生物量测定；虾青素含量测定；虾青素产量测定。本发明所提供的方法既提高了虾青素的产量，又节约了生产成本，非常适合工业化发酵生产天然虾青素。

Description

通过提高红法夫酵母生物量合成虾青素及测定的方法
技术领域
本发明涉及一种方法，尤其涉及一种通过提高红法夫酵母生物量合成虾青 素的方法及其测定的方法。
背景技术
虾青素(astaxanthin)是一种酮式类胡萝卜素，分子式C40H52O4，摩尔质 量596.86g/mol，是自然界中广泛存在的天然色素。大多数甲壳类动物(虾、 螃蟹)和鲑鱼肉等呈现的红色都是由于虾青素积累的结果。在水产养殖中，虾 青素常用作饲料添加剂，改善水产品质量，弥补人类膳食中虾青素的缺乏。近 年随着虾青素生物功能研究和药理药效试验的不断深入，虾青素因其在心血管 疾病、癌症、代谢综合征、糖尿病、神经退行性疾病、眼科疾病、皮肤病等疾 病的预防和治疗中具有突出的效果而受到了科学界极大的关注，表明虾青素在 医药、保健品等领域中具有巨大的潜在应用价值和广阔开发前景。
虾青素可以通过红法夫酵母发酵生产。红法夫酵母是真菌界、真菌门、半 知菌亚门、隐球酵母科、红法夫酵母属的唯一种，繁殖方式为无性繁殖中的芽 殖，被认为是除雨生红球藻外最为适合生产虾青素的微生物。与雨生红球藻相 比，红法夫酵母具有细胞代谢繁殖快，可实现高密度培养；生产周期短，成本 低，天然无污染；细胞壁容易破碎，生产的虾青素为反式结构，破壁后可直接 作为饲料添加剂等优点。
番茄红素，是一种不含氧的链式类胡萝卜素，极性较小，易溶于正己烷、 苯、氯仿等弱极性有机溶剂。天然的番茄红素主要存在于番茄、西瓜、红心蜜 柚中，除具有抗氧化、调节机体免疫力、抗疲劳的功能外，在抗癌方面也具有 显著作用。番茄红素作为虾青素合成的前体物质，适量添加对虾青素合成起到 促进作用。番茄粉中含有大量的番茄红素，且干粉易储藏，可以作为番茄红素 的替代品；此外，番茄粉中还含有的一些其它营养物质，对红法夫酵母的生长 有一定的促进作用。这样既提高了虾青素的产量，又节约了生产成本，非常适 合工业化发酵生产天然虾青素。然而，目前已有的虾青素生产方法未能为将上 述优势充分利用起来，并且应用已有的方法所生产的虾青素产量一般，不能高 产量获得虾青素，且生产成本高，不适宜大规模推广应用。
发明内容
为了解决上述技术所存在的不足之处，本发明提供了一种通过提高红法夫 酵母生物量合成虾青素及测定的方法。
为了解决以上技术问题，本发明采用的技术方案是：一种通过提高红法夫 酵母生物量合成虾青素的方法，具体步骤如下：
步骤一、摇瓶种子培养：将实验室斜面保存的红法夫酵母菌株，取一环菌 苔接种于摇瓶种子培养基中，温度为20～22℃、pH为5.0～7.0的的条件下，培 养30～72h，得到一代摇瓶种子培养液；将一代摇瓶种子培养液扩大培养3～4 代，得摇瓶种子培养液；
步骤二、车间种子培养：按3～5％的比例将步骤一中所得的摇瓶种子培养 液接种于一级种子发酵罐，一级种子发酵罐预中预先装填了车间种子培养基， 在温度为20～22℃、转速100～200rpm、溶氧量不低于40～60％的条件下，培养 16～48h，得到车间种子培养液；
步骤三、发酵生产：将步骤二中所得的车间种子培养液按5～10％的比例接 种于发酵罐中，发酵罐中预先装填了6～7t发酵培养基，发酵培养基中添加有 番茄粉，在温度为20～22℃、转速为100～200rpm、溶氧量不低于40～60％、pH 为4.0～6.0的条件下，发酵66～80h，得到发酵液，其中，发酵20～30h后进入 补料期，补料期流加600g/L的葡萄糖，使发酵过程中葡萄糖浓度控制在15～ 35g/L。
进一步地，摇瓶培养基、车间种子培养基、发酵培养基在接种前均经过 121℃、25min灭菌，达到无菌状态。
进一步地，步骤一中摇瓶培养基的配方为：葡萄糖2～10g/L，酵母浸粉3 ～8g/L，麦芽浸粉3～6g/L，蛋白胨5～10g/L。
进一步地，步骤二中车间种子培养基的配方为：葡萄糖20～25g/L，酵母 浸粉1～5g/L，蛋白胨2～10g/L。
进一步地，步骤三中发酵培养基的配方为：葡萄糖25～50g/L，酵母浸粉5 ～20g/L，蛋白胨2～5g/L，硫酸铵5～10g/L，尿素1～3g/L。
进一步地，步骤三中发酵培养基中番茄粉的添加量为10～30g/L。
进一步地，步骤三中发酵培养基PH的控制利用了柠檬酸和NaOH。
一种通过提高红法夫酵母生物量合成虾青素的测定方法，具体过程如下：
①红法夫酵母生物量的测定
取10mL的发酵液，于10000rpm离心5min得到细胞，细胞用去离子水清洗 两次，离心后转入称量瓶中，在烘箱中于105℃烘干至衡重，得到粉末，然后 称重，粉末的重量为m1，
利用公式Ⅰ计算生物量，公式Ⅰ如下所示：
其中，X表示样品中红法夫酵母的生物量，单位为g/L；m1表示样品烘干后 粉末及称量瓶的质量，单位为g；m0表示空称量瓶的质量，单位为g；V表示发 酵液样品的体积，单位为mL；1000表示单位换算系数；
每个样品取3个平行样进行测定，以其算术平均值为结果，结果保留小数 点后2位；
②虾青素含量的测定
首先，提取虾青素提取液，具体提取方法为：
准确称取0.1g的粉末加入50mL离心管中，用5mL移液枪向离心管中加入 10mL二甲基亚砜，使用漩涡混合器充分混合，将离心管放置在超声波清洗器 中，进行第一次浸提，浸提时间20min，浸提温度40℃，超声强度无要求，浸 提结束，漩涡混匀后，在10000rpm条件下离心5min，收集上清；向经过浸提、 离心后的残渣中加入10mL二甲基亚砜，漩涡混匀后放置在超声波清洗器中，进 行第二次浸提，浸提时间20min，浸提温度40℃，超声强度无要求。浸提结 束，漩涡混匀后，在10000rpm条件下离心5min，收集上清；继续向上一步离心 后的残渣中加入10mL二甲基亚砜，漩涡混匀后放置在超声波清洗器中，进行第 三次浸提，浸提时间20min，浸提温度40℃，超声强度无要求，浸提结束漩涡 混匀后在10000rpm条件下离心5min，收集上清，将前三次上清混合，在 10000rpm条件下离心5min，除去残留固体杂质，获得虾青素提取液；
其次，绘制标准曲线：
准确称取虾青素标准品0.002g精确到0.00001g，用二甲基亚砜完全溶解并 定容至100mL容量瓶中，得到20μg/mL标准液母液，对该母液按照1μg/mL、2 μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL、6μg/mL进行梯度稀释，各梯度标准液 在490nm处进行分光光度计测定，使用上述各浓度及所对应吸光值绘制标准曲 线，要求线性回归方程Y＝aX+b中的相关系数的平方R2>0.995；
然后，虾青素提取液的处理：
使用二甲基亚砜对虾青素提取液进行适当稀释，稀释倍数记为k，漩涡震 荡后在490nm处使用分光光度计测吸光值，记录所得吸光值A，要求吸光值在 0.2～0.9之间；
虾青素含量的计算如公式Ⅱ所示：
其中，C表示样品中的虾青素含量，单位为mg/g；A表示样品中虾青素的吸 光值；b表示线性回归方程标准曲线中的截距；V表示提取所用的溶剂体积，单 位为mL；a表示线性回归方程标准曲线中的斜率，单位为mL/μg；k表示样品稀 释倍数；m表示称取样品质量，单位为g；1000表示单位换算系数；
每个样品取3个平行样进行测定，以其算术平均值为结果，结果保留小数 点后2位；
③虾青素产量的测定
虾青素产量的计算如公式Ⅲ所示：
A＝C×X Ⅲ
其中，A表示样品中虾青素的产量，单位为mg/L；C表示样品中虾青素的含 量，单位为mg/g；X表示样品中的红法夫酵母生物量，g/L。
本发明提供了一种同时提高红法夫酵母生物量及虾青素合成方法，通过添 加干燥易储藏的番茄粉，明显提高了红法夫酵母的生物量及细胞内虾青素含 量，对虾青素合成起到明显促进作用。本发明所提供的方法操作简单，生产成 本低，既提高了虾青素的产量，又节约了生产成本，非常适合工业化发酵生产 天然虾青素，对于在工业上采用红法夫酵母高效生产天然虾青素具有重要的研 究价值及良好的应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
一种通过提高红法夫酵母生物量合成虾青素的方法，具体步骤如下：
步骤一、摇瓶种子培养：将实验室斜面保存的红法夫酵母菌株，取一环菌 苔接种于摇瓶种子培养基中，温度为20～22℃、pH为5.0～7.0的条件下，培养 30～72h，得到一代摇瓶种子培养液；将一代摇瓶种子培养液扩大培养3～4 代，得摇瓶种子培养液；
步骤二、车间种子培养：按3～5％的比例将步骤一中所得的摇瓶种子培养 液接种于一级种子发酵罐，一级种子发酵罐预中预先装填了车间种子培养基， 在温度为20～22℃、转速100～200rpm、溶氧量不低于40～60％的条件下，培养 16～48h，得到车间种子培养液；
步骤三、发酵生产：将步骤二中所得的车间种子培养液按5～10％的比例接 种于发酵罐中，发酵罐中预先装填了6～7t发酵培养基，发酵培养基中添加有 番茄粉，在温度为20～22℃、转速为100～200rpm、溶氧量不低于40～60％、pH 为4.0～6.0的条件下，发酵时间为66～80h，得到发酵液；其中，发酵20～30h 后进入补料期，补料期流加600g/L的葡萄糖，使发酵过程中葡萄糖浓度控制 在15～35g/L。
其中，摇瓶培养基、车间种子培养基、发酵培养基在接种前均经过 121℃、25min灭菌，达到无菌状态。
步骤一中摇瓶培养基的配方为：葡萄糖2～10g/L，酵母浸粉3～8g/L，麦 芽浸粉3～6g/L，蛋白胨5～10g/L。
步骤二中车间种子培养基的配方为：葡萄糖20～25g/L，酵母浸粉1～ 5g/L，蛋白胨2～10g/L。
步骤三中发酵培养基的配方为：葡萄糖25～50g/L，酵母浸粉5～20g/L， 蛋白胨2～5g/L，硫酸铵5～10g/L，尿素1～3g/L。
步骤三中发酵培养基中番茄粉的添加量为0～30g/L。
步骤三中发酵培养基PH的控制利用了柠檬酸和NaOH。
本发明进一步检测了所得发酵液中红法夫酵母生物量和虾青素产量，本发 明所提供的实施例均采用此检测方法，具体检测方法如下：
①红法夫酵母生物量的测定(细胞干重法)
取10mL的发酵液，于10000rpm离心5min得到细胞，细胞用去离子水清洗 两次，离心后转入称量瓶中(称量瓶重量为m0)，在烘箱中于105℃烘干至衡 重，得到粉末，然后称重，粉末的重量为m1。
利用公式Ⅰ计算生物量，公式Ⅰ如下所示：
其中，X表示样品中的生物量，单位为g/L；m1表示样品烘干后粉末及称量 瓶的质量，单位为g；m0表示空称量瓶的质量，单位为g；V表示发酵液样品的 体积，单位为mL；1000表示单位换算系数。
每个样品取3个平行样进行测定，以其算术平均值为结果，结果保留小数 点后2位。
②虾青素含量的测定
1)首先，提取虾青素提取液，具体提取方法为：
准确称取0.1g(精确至0.0001g)的粉末加入50mL离心管中，用5mL移液枪 向离心管中加入10mL二甲基亚砜，使用漩涡混合器充分混合。将离心管放置在 超声波清洗器中，进行第一次浸提，浸提时间20min，浸提温度40℃，超声强 度无要求。浸提结束，漩涡混匀后，在10000rpm条件下离心5min，收集上清。 向经过浸提、离心后的残渣中加入10mL二甲基亚砜，漩涡混匀后放置在超声波 清洗器中，进行第二次浸提，浸提时间20min，浸提温度40℃，超声强度无要 求。浸提结束，漩涡混匀后，在10000rpm条件下离心5min，收集上清。继续向 上一步离心后的残渣中加入10mL二甲基亚砜，漩涡混匀后放置在超声波清洗器 中，进行第三次浸提，浸提时间20min，浸提温度40℃，超声强度无要求，浸 提结束漩涡混匀后在10000rpm条件下离心5min，收集上清。将前三次上清混 合，在10000rpm条件下离心5min，除去残留固体杂质，获得虾青素提取液。
2)绘制标准曲线
准确称取虾青素标准品0.002g(2mg)精确到0.00001g(0.01mg)，用二 甲基亚砜完全溶解并定容至100mL容量瓶中，得到20μg/mL标准液母液，对该 母液按照1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL、6μg/mL进行梯度 稀释，各梯度标准液在490nm处进行分光光度计测定，使用上述各浓度及所对 应吸光值绘制标准曲线，要求线性回归方程Y＝aX+b中的相关系数的平方 R2>0.995。
3)虾青素提取液的处理
使用二甲基亚砜对虾青素提取液进行适当稀释，稀释倍数记为k，漩涡震 荡后在490nm处使用分光光度计测吸光值，记录所得吸光值A，要求吸光值在 0.2～0.9之间。
虾青素含量的计算如公式Ⅱ所示：
其中，C表示样品中的虾青素含量，单位为mg/g；A表示样品中虾青素的吸 光值；b表示线性回归方程标准曲线中的截距；V表示提取所用的溶剂体积，单 位为mL；a表示线性回归方程标准曲线中的斜率，单位为mL/μg；k表示样品稀 释倍数；m表示称取样品质量，单位为g；1000表示单位换算系数。
每个样品取3个平行样进行测定，以其算术平均值为结果，结果保留小数 点后2位。
③虾青素产量的测定
虾青素产量的计算如公式Ⅲ所示：
A＝C×X Ⅲ
其中，A表示样品中虾青素的产量，单位为mg/L；C表示样品中虾青素的含 量，单位为mg/g；X表示样品中的红法夫酵母生物量，g/L。
下面通过具体实施例对本发明的技术方案做进一步展示：
【实施例一】
一种通过提高红法夫酵母生物量合成虾青素及测定的方法，具体步骤如 下：
步骤一、摇瓶种子培养：将实验室斜面保存的红法夫酵母菌株，取一环菌 苔接种于摇瓶种子培养基中，温度为21℃、pH为6.0的的条件下，培养58h，得 到一代摇瓶种子培养液；将一代摇瓶种子培养液扩大培养4代，得摇瓶种子培 养液；
步骤二、车间种子培养：按4％的比例将步骤一中所得的摇瓶种子培养液接 种于一级种子发酵罐，一级种子发酵罐预中预先装填了车间种子培养基，在温 度为21℃、转速200rpm、溶氧量50％的条件下，培养32h，得到车间种子培养 液；
步骤三、发酵生产：将步骤二中所得的车间种子培养液按5～10％的比例接 种于发酵罐中，发酵罐中预先装填了6.5t发酵培养基，发酵培养基中添加有10 g/L番茄粉，在温度为21℃、转速为200rpm、溶氧量50％、pH为5.0(利用了柠 檬酸和NaOH调控PH)的条件下，发酵74h，得到发酵液；其中，发酵25h后进入 补料期，补料期流加600g/L的葡萄糖，使发酵过程中葡萄糖浓度控制在 25g/L。
摇瓶培养基、车间种子培养基、发酵培养基在接种前均经过121℃、25min 灭菌，达到无菌状态。
摇瓶培养基的配方为：葡萄糖6g/L，酵母浸粉5g/L，麦芽浸粉4.5g/L， 蛋白胨7g/L。
种子培养基的配方为：葡萄糖23g/L，酵母浸粉3g/L，蛋白胨6g/L。
发酵培养基的配方为：葡萄糖40g/L，酵母浸粉13g/L，蛋白胨4g/L，硫 酸铵7g/L，尿素2g/L。
基于红法夫酵母生物量和虾青素产量的检测方法，经测定红法夫酵母生物 量为39.90g/L，虾青素含量为0.48mg/g，虾青素产量19.15mg/L。
【实施例二】
一种通过提高红法夫酵母生物量合成虾青素及测定的方法，具体步骤如 下：
步骤一、摇瓶种子培养：将实验室斜面保存的红法夫酵母菌株，取一环菌 苔接种于摇瓶种子培养基中，温度为21℃、pH为6.0的的条件下，培养58h，得 到一代摇瓶种子培养液；将一代摇瓶种子培养液扩大培养4代，得摇瓶种子培 养液；
步骤二、车间种子培养：按4％的比例将步骤一中所得的摇瓶种子培养液接 种于一级种子发酵罐，一级种子发酵罐预中预先装填了车间种子培养基，在温 度为21℃、转速200rpm、溶氧量50％的条件下，培养32h，得到车间种子培养 液；
步骤三、发酵生产：将步骤二中所得的车间种子培养液按5～10％的比例接 种于发酵罐中，发酵罐中预先装填了6.5t发酵培养基，发酵培养基中添加有15 g/L番茄粉，在温度为21℃、转速为200rpm、溶氧量50％、pH为5.0(利用了柠 檬酸和NaOH调控PH)的条件下，发酵74h，得到发酵液；其中，发酵25h后进入 补料期，补料期流加600g/L的葡萄糖，使发酵过程中葡萄糖浓度控制在 25g/L。
摇瓶培养基、车间种子培养基、发酵培养基在接种前均经过121℃、25min 灭菌，达到无菌状态。
摇瓶培养基的配方为：葡萄糖6g/L，酵母浸粉5g/L，麦芽浸粉4.5g/L， 蛋白胨7g/L。
种子培养基的配方为：葡萄糖23g/L，酵母浸粉3g/L，蛋白胨6g/L。
发酵培养基的配方为：葡萄糖40g/L，酵母浸粉13g/L，蛋白胨4g/L，硫 酸铵7g/L，尿素2g/L。
与实施例一使用的红法夫酵母生物量和虾青素产量的检测方法相同，经测 定红法夫酵母生物量为58.60g/L，虾青素含量为0.88mg/g，虾青素产量 51.57mg/L。
【实施例三】
一种通过提高红法夫酵母生物量合成虾青素及测定的方法，具体步骤如 下：
步骤一、摇瓶种子培养：将实验室斜面保存的红法夫酵母菌株，取一环菌 苔接种于摇瓶种子培养基中，温度为21℃、pH为6.0的的条件下，培养58h，得 到一代摇瓶种子培养液；将一代摇瓶种子培养液扩大培养4代，得摇瓶种子培 养液；
步骤二、车间种子培养：按4％的比例将步骤一中所得的摇瓶种子培养液接 种于一级种子发酵罐，一级种子发酵罐预中预先装填了车间种子培养基，在温 度为21℃、转速200rpm、溶氧量50％的条件下，培养32h，得到车间种子培养 液；
步骤三、发酵生产：将步骤二中所得的车间种子培养液按5～10％的比例接 种于发酵罐中，发酵罐中预先装填了6.5t发酵培养基，发酵培养基中添加有20 g/L番茄粉，在温度为21℃、转速为200rpm、溶氧量50％、pH为5.0(利用了柠 檬酸和NaOH调控PH)的条件下，发酵74h，得到发酵液；其中，发酵25h后进入 补料期，补料期流加600g/L的葡萄糖，使发酵过程中葡萄糖浓度控制在 25g/L。
摇瓶培养基、车间种子培养基、发酵培养基在接种前均经过121℃、25min 灭菌，达到无菌状态。
摇瓶培养基的配方为：葡萄糖6g/L，酵母浸粉5g/L，麦芽浸粉4.5g/L， 蛋白胨7g/L。
种子培养基的配方为：葡萄糖23g/L，酵母浸粉3g/L，蛋白胨6g/L。
发酵培养基的配方为：葡萄糖40g/L，酵母浸粉13g/L，蛋白胨4g/L，硫 酸铵7g/L，尿素2g/L。
与实施例一使用的红法夫酵母生物量和虾青素产量的检测方法相同，经测 定红法夫酵母生物量为65.90g/L，虾青素含量为1.24mg/g，虾青素产量 81.76mg/L。
【实施例四】
一种通过提高红法夫酵母生物量合成虾青素及测定的方法，具体步骤如 下：
步骤一、摇瓶种子培养：将实验室斜面保存的红法夫酵母菌株，取一环菌 苔接种于摇瓶种子培养基中，温度为21℃、pH为6.0的的条件下，培养58h，得 到一代摇瓶种子培养液；将一代摇瓶种子培养液扩大培养4代，得摇瓶种子培 养液；
步骤二、车间种子培养：按4％的比例将步骤一中所得的摇瓶种子培养液接 种于一级种子发酵罐，一级种子发酵罐预中预先装填了车间种子培养基，在温 度为21℃、转速200rpm、溶氧量50％的条件下，培养32h，得到车间种子培养 液；
步骤三、发酵生产：将步骤二中所得的车间种子培养液按5～10％的比例接 种于发酵罐中，发酵罐中预先装填了6.5t发酵培养基，发酵培养基中添加有30 g/L番茄粉，在温度为21℃、转速为200rpm、溶氧量50％、pH为5.0(利用了柠 檬酸和NaOH调控PH)的条件下，发酵74h，得到发酵液；其中，发酵25h后进入 补料期，补料期流加600g/L的葡萄糖，使发酵过程中葡萄糖浓度控制在 25g/L。
摇瓶培养基、车间种子培养基、发酵培养基在接种前均经过121℃、25min 灭菌，达到无菌状态。
摇瓶培养基的配方为：葡萄糖6g/L，酵母浸粉5g/L，麦芽浸粉4.5g/L， 蛋白胨7g/L。
种子培养基的配方为：葡萄糖23g/L，酵母浸粉3g/L，蛋白胨6g/L。
发酵培养基的配方为：葡萄糖40g/L，酵母浸粉13g/L，蛋白胨4g/L，硫 酸铵7g/L，尿素2g/L。
基于红法夫酵母生物量和虾青素产量的检测方法，经测定红法夫酵母生物 量为44.6g/L，虾青素含量为0.96mg/g，虾青素产量42.82mg/L。
【实施例五】
一种通过提高红法夫酵母生物量合成虾青素及测定的方法，具体步骤如 下：
步骤一、摇瓶种子培养：将实验室斜面保存的红法夫酵母菌株，取一环菌 苔接种于摇瓶种子培养基中，温度为20℃、pH为5.0的条件下，培养30h，得到 一代摇瓶种子培养液；将一代摇瓶种子培养液扩大培养3代，得摇瓶种子培养 液；
步骤二、车间种子培养：按3％的比例将步骤一中所得的摇瓶种子培养液接 种于一级种子发酵罐，一级种子发酵罐预中预先装填了车间种子培养基，在温 度为20℃、转速100rpm、溶氧量40％的条件下，培养16h，得到车间种子培养 液；
步骤三、发酵生产：将步骤二中所得的车间种子培养液按5％的比例接种于 发酵罐中，发酵罐中预先装填了6t发酵培养基，发酵培养基中添加有10g/L的 番茄粉，在温度为20℃、转速为100rpm、溶氧量40％、pH为4.0(利用了柠檬酸 和NaOH调控PH)的条件下，发酵时间为66h，得到发酵液；其中，发酵20h后进 入补料期，补料期流加600g/L的葡萄糖，使发酵过程中葡萄糖浓度控制在 15g/L。
其中，摇瓶培养基、车间种子培养基、发酵培养基在接种前均经过 121℃、25min灭菌，达到无菌状态。
摇瓶培养基的配方为：葡萄糖2g/L，酵母浸粉3g/L，麦芽浸粉3g/L，蛋 白胨5g/L。
车间种子培养基的配方为：葡萄糖20g/L，酵母浸粉1g/L，蛋白胨2g/L。
发酵培养基的配方为：葡萄糖25g/L，酵母浸粉5g/L，蛋白胨2g/L，硫酸 铵5g/L，尿素1g/L。
与实施例一使用相同的红法夫酵母生物量和虾青素产量的检测方法，经测 定红法夫酵母生物量为29.90g/L，虾青素含量为0.34mg/g，虾青素产量7.79 mg/L。
【实施例六】
一种通过提高红法夫酵母生物量合成虾青素及测定的方法，具体步骤如 下：
步骤一、摇瓶种子培养：将实验室斜面保存的红法夫酵母菌株，取一环菌 苔接种于摇瓶种子培养基中，温度为20℃、pH为5.5的条件下，培养32h，得到 一代摇瓶种子培养液；将一代摇瓶种子培养液扩大培养3代，得摇瓶种子培养 液；
步骤二、车间种子培养：按3.2％的比例将步骤一中所得的摇瓶种子培养液 接种于一级种子发酵罐，一级种子发酵罐预中预先装填了车间种子培养基，在 温度为20℃、转速120rpm、溶氧量44％的条件下，培养20h，得到车间种子培养 液；
步骤三、发酵生产：将步骤二中所得的车间种子培养液按4.5％的比例接种 于发酵罐中，发酵罐中预先装填了6.2t发酵培养基，发酵培养基中添加有 17g/L的番茄粉，在温度为20℃、转速为120rpm、溶氧量44％、pH为4.5(利用 了柠檬酸和NaOH调控PH)的条件下，发酵时间为68h，得到发酵液；其中，发 酵20h后进入补料期，补料期流加600g/L的葡萄糖，使发酵过程中葡萄糖浓度 控制在17g/L。
其中，摇瓶培养基、车间种子培养基、发酵培养基在接种前均经过 121℃、25min灭菌，达到无菌状态。
摇瓶培养基的配方为：葡萄糖4g/L，酵母浸粉4g/L，麦芽浸粉4g/L，蛋 白胨6g/L。
车间种子培养基的配方为：葡萄糖22g/L，酵母浸粉1g/L，蛋白胨4g/L。
发酵培养基的配方为：葡萄糖28g/L，酵母浸粉10g/L，蛋白胨4g/L，硫酸 铵6g/L，尿素1.5g/L。
与实施例一使用相同的红法夫酵母生物量和虾青素产量检测方法，经测定 红法夫酵母生物量为49.20g/L，虾青素含量为0.82mg/g，虾青素产量40.34 mg/L。
【实施例七】
一种通过提高红法夫酵母生物量合成虾青素及测定的方法，具体步骤如 下：
步骤一、摇瓶种子培养：将实验室斜面保存的红法夫酵母菌株，取一环菌 苔接种于摇瓶种子培养基中，温度为20℃、pH为5.0的条件下，培养40h，得到 一代摇瓶种子培养液；将一代摇瓶种子培养液扩大培养3代，得摇瓶种子培养 液；
步骤二、车间种子培养：按3％的比例将步骤一中所得的摇瓶种子培养液接 种于一级种子发酵罐，一级种子发酵罐预中预先装填了车间种子培养基，在温 度为20℃、转速100rpm、溶氧量40％的条件下，培养16h，得到车间种子培养 液；
步骤三、发酵生产：将步骤二中所得的车间种子培养液按5％的比例接种于 发酵罐中，发酵罐中预先装填了6t发酵培养基，发酵培养基中添加有20g/L的 番茄粉，在温度为20℃、转速为40rpm、溶氧量40％、pH为4.0(利用了柠檬酸 和NaOH调控PH)的条件下，发酵时间为66h，得到发酵液；其中，发酵20h后进 入补料期，补料期流加600g/L的葡萄糖，使发酵过程中葡萄糖浓度控制在 15g/L。
其中，摇瓶培养基、车间种子培养基、发酵培养基在接种前均经过 121℃、25min灭菌，达到无菌状态。
摇瓶培养基的配方为：葡萄糖2g/L，酵母浸粉3g/L，麦芽浸粉3g/L，蛋 白胨5g/L，
车间种子培养基的配方为：葡萄糖20g/L，酵母浸粉15g/L，蛋白胨2 g/L。
发酵培养基的配方为：葡萄糖25g/L，酵母浸粉5g/L，蛋白胨2g/L，硫酸 铵5g/L，尿素1.8g/L。
与实施例一使用相同的红法夫酵母生物量和虾青素产量检测方法，经测定 红法夫酵母生物量为61.70g/L，虾青素含量为1.12mg/g，虾青素产量69.1 mg/L。
【实施例八】
一种通过提高红法夫酵母生物量合成虾青素及测定的方法，具体步骤如 下：
步骤一、摇瓶种子培养：将实验室斜面保存的红法夫酵母菌株，取一环菌 苔接种于摇瓶种子培养基中，温度为20℃、pH为5.0的条件下，培养42h，得到 一代摇瓶种子培养液；将一代摇瓶种子培养液扩大培养3代，得摇瓶种子培养 液；
步骤二、车间种子培养：按3％的比例将步骤一中所得的摇瓶种子培养液接 种于一级种子发酵罐，一级种子发酵罐预中预先装填了车间种子培养基，在温 度为20℃、转速160rpm、溶氧量55％的条件下，培养22h，得到车间种子培养 液；
步骤三、发酵生产：将步骤二中所得的车间种子培养液按5％的比例接种于 发酵罐中，发酵罐中预先装填了6.7t发酵培养基，发酵培养基中添加有30g/L 的番茄粉，在温度为20℃、转速为160rpm、溶氧量55％、pH为5.5(利用了柠檬 酸和NaOH调控PH)的条件下，发酵时间为66h，得到发酵液；其中，发酵20h后 进入补料期，补料期流加600g/L的葡萄糖，使发酵过程中葡萄糖浓度控制在 20g/L。
其中，摇瓶培养基、车间种子培养基、发酵培养基在接种前均经过 121℃、25min灭菌，达到无菌状态。
摇瓶培养基的配方为：葡萄糖6g/L，酵母浸粉6g/L，麦芽浸粉5g/L，蛋白 胨8g/L，
车间种子培养基的配方为：葡萄糖24g/L，酵母浸粉3g/L，蛋白胨8g/L。
发酵培养基的配方为：葡萄糖35g/L，酵母浸粉17g/L，蛋白胨2.5g/L，硫 酸铵7g/L，尿素1.5g/L。
与实施例一使用相同的红法夫酵母生物量和虾青素产量检测方法，经测定 红法夫酵母生物量为58.70g/L，虾青素含量为0.91mg/g，虾青素产量 53.42mg/L。
【实施例九】
一种通过提高红法夫酵母生物量合成虾青素及测定的方法，具体步骤如 下：
步骤一、摇瓶种子培养：将实验室斜面保存的红法夫酵母菌株，取一环菌 苔接种于摇瓶种子培养基中，温度为22℃、pH为7.0的条件下，培养72h，得到 一代摇瓶种子培养液；将一代摇瓶种子培养液扩大培养3代，得摇瓶种子培养 液；
步骤二、车间种子培养：按5％的比例将步骤一中所得的摇瓶种子培养液接 种于一级种子发酵罐，一级种子发酵罐预中预先装填了车间种子培养基，在温 度为22℃、转速150rpm、溶氧量60％的条件下，培养48h，得到车间种子培养 液；
步骤三、发酵生产：将步骤二中所得的车间种子培养液按5％的比例接种于 发酵罐中，发酵罐中预先装填了7t发酵培养基，发酵培养基中添加有10g/L的 番茄粉，在温度为20℃、转速为150rpm、溶氧量60％、pH为6.0(利用了柠檬酸 和NaOH调控PH)的条件下，发酵时间为80h，得到发酵液；其中，发酵30h后进 入补料期，补料期流加600g/L的葡萄糖，使发酵过程中葡萄糖浓度控制在 35g/L。
其中，摇瓶培养基、车间种子培养基、发酵培养基在接种前均经过 121℃、25min灭菌，达到无菌状态。
摇瓶培养基的配方为：葡萄糖10g/L，酵母浸粉8g/L，麦芽浸粉6g/L，蛋 白胨10g/L。
车间种子培养基的配方为：葡萄糖25g/L，酵母浸粉5g/L，蛋白胨10 g/L。
发酵培养基的配方为：葡萄糖50g/L，酵母浸粉20g/L，蛋白胨5g/L，硫酸 铵10g/L，尿素3g/L。
与实施例一使用相同的红法夫酵母生物量和虾青素产量检测方法，经测定 红法夫酵母生物量为48.70g/L，虾青素含量为0.39mg/g，虾青素产量 18.99mg/L。
【实施例十】
一种通过提高红法夫酵母生物量合成虾青素及测定的方法，具体步骤如 下：
步骤一、摇瓶种子培养：将实验室斜面保存的红法夫酵母菌株，取一环菌 苔接种于摇瓶种子培养基中，温度为22℃、pH为7.0的条件下，培养72h，得到 一代摇瓶种子培养液；将一代摇瓶种子培养液扩大培养3代，得摇瓶种子培养 液；
步骤二、车间种子培养：按5％的比例将步骤一中所得的摇瓶种子培养液接 种于一级种子发酵罐，一级种子发酵罐预中预先装填了车间种子培养基，在温 度为22℃、转速150rpm、溶氧量60％的条件下，培养48h，得到车间种子培养 液；
步骤三、发酵生产：将步骤二中所得的车间种子培养液按5％的比例接种于 发酵罐中，发酵罐中预先装填了7t发酵培养基，发酵培养基中添加有18g/L的 番茄粉，在温度为20℃、转速为150rpm、溶氧量60％、pH为6.0(利用了柠檬酸 和NaOH调控PH)的条件下，发酵时间为80h，得到发酵液；其中，发酵30h后进 入补料期，补料期流加600g/L的葡萄糖，使发酵过程中葡萄糖浓度控制在 35g/L。
其中，摇瓶培养基、车间种子培养基、发酵培养基在接种前均经过 121℃、25min灭菌，达到无菌状态。
摇瓶培养基的配方为：葡萄糖10g/L，酵母浸粉8g/L，麦芽浸粉6g/L，蛋 白胨10g/L。
车间种子培养基的配方为：葡萄糖25g/L，酵母浸粉5g/L，蛋白胨10 g/L。
发酵培养基的配方为：葡萄糖50g/L，酵母浸粉20g/L，蛋白胨5g/L，硫酸 铵10g/L，尿素3g/L。
与实施例一使用相同的红法夫酵母生物量和虾青素产量检测方法，经测定 红法夫酵母生物量为52.70g/L，虾青素含量为0.66mg/g，虾青素产量 34.78mg/L。
【实施例十一】
一种通过提高红法夫酵母生物量合成虾青素及测定的方法，具体步骤如 下：
步骤一、摇瓶种子培养：将实验室斜面保存的红法夫酵母菌株，取一环菌 苔接种于摇瓶种子培养基中，温度为22℃、pH为7.0的条件下，培养72h，得到 一代摇瓶种子培养液；将一代摇瓶种子培养液扩大培养3代，得摇瓶种子培养 液；
步骤二、车间种子培养：按5％的比例将步骤一中所得的摇瓶种子培养液接 种于一级种子发酵罐，一级种子发酵罐预中预先装填了车间种子培养基，在温 度为22℃、转速170rpm、溶氧量60％的条件下，培养46h，得到车间种子培养 液；
步骤三、发酵生产：将步骤二中所得的车间种子培养液按5％的比例接种于 发酵罐中，发酵罐中预先装填了7t发酵培养基，发酵培养基中添加有26g/L的 番茄粉，在温度为20℃、转速为170rpm、溶氧量60％、pH为6.0(利用了柠檬酸 和NaOH调控PH)的条件下，发酵时间为78h，得到发酵液；其中，发酵28h后进 入补料期，补料期流加600g/L的葡萄糖，使发酵过程中葡萄糖浓度控制在 32g/L。
其中，摇瓶培养基、车间种子培养基、发酵培养基在接种前均经过 121℃、25min灭菌，达到无菌状态。
摇瓶培养基的配方为：葡萄糖9g/L，酵母浸粉7g/L，麦芽浸粉5g/L，蛋白 胨9g/L。
车间种子培养基的配方为：葡萄糖24g/L，酵母浸粉4g/L，蛋白胨9g/L。
发酵培养基的配方为：葡萄糖48g/L，酵母浸粉18g/L，蛋白胨4g/L，硫酸 铵9g/L，尿素2.5g/L。
与实施例一使用相同的红法夫酵母生物量和虾青素产量检测方法，经测定 红法夫酵母生物量为68.90g/L，虾青素含量为1.03mg/g，虾青素产量 70.97mg/L。
【实施例十二】
一种通过提高红法夫酵母生物量合成虾青素及测定的方法，具体步骤如 下：
步骤一、摇瓶种子培养：将实验室斜面保存的红法夫酵母菌株，取一环菌 苔接种于摇瓶种子培养基中，温度为22℃、pH为6.5的条件下，培养68h，得到 一代摇瓶种子培养液；将一代摇瓶种子培养液扩大培养3代，得摇瓶种子培养 液；
步骤二、车间种子培养：按5％的比例将步骤一中所得的摇瓶种子培养液接 种于一级种子发酵罐，一级种子发酵罐预中预先装填了车间种子培养基，在温 度为22℃、转速190rpm、溶氧量52％的条件下，培养44h，得到车间种子培养 液；
步骤三、发酵生产：将步骤二中所得的车间种子培养液按5％的比例接种于 发酵罐中，发酵罐中预先装填了7t发酵培养基，发酵培养基中添加有30g/L的 番茄粉，在温度为20℃、转速为190rpm、溶氧量52％、pH为6.0(利用了柠檬酸 和NaOH调控PH)的条件下，发酵时间为74h，得到发酵液；其中，发酵25h后进 入补料期，补料期流加600g/L的葡萄糖，使发酵过程中葡萄糖浓度控制在 30g/L。
其中，摇瓶培养基、车间种子培养基、发酵培养基在接种前均经过 121℃、25min灭菌，达到无菌状态。
摇瓶培养基的配方为：葡萄糖8g/L，酵母浸粉6g/L，麦芽浸粉4g/L，蛋白 胨8g/L。
车间种子培养基的配方为：葡萄糖21g/L，酵母浸粉3.5g/L，蛋白胨 6g/L。
发酵培养基的配方为：葡萄糖44g/L，酵母浸粉14g/L，蛋白胨3.5g/L，硫 酸铵7g/L，尿素2g/L。
与实施例一使用相同的红法夫酵母生物量和虾青素产量检测方法，经测定 红法夫酵母生物量为56.20g/L，虾青素含量为0.79mg/g，虾青素产量 44.40mg/L。
本发明提供了一种同时提高红法夫酵母生物量及虾青素合成方法，通过添 加干燥易储藏的番茄粉，实验结果表明，番茄粉的添加能明显提高红法夫酵母 的生物量及细胞内虾青素含量，对虾青素合成起到明显促进作用。本发明所提 供的方法操作简单，生产成本低，既提高了虾青素的产量，又节约了生产成 本，非常适合工业化发酵生产天然虾青素，对于在工业上采用红法夫酵母高效 生产天然虾青素具有重要的研究价值及良好的应用前景。
上述实施方式并非是对本发明的限制，本发明也并不仅限于上述举例，本 技术领域的技术人员在本发明的技术方案范围内所做出的变化、改型、添加或 替换，也均属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种通过提高红法夫酵母生物量合成虾青素的方法，其特征在于：所述通过提高红法夫酵母生物量合成虾青素的方法其具体步骤如下：
步骤一、摇瓶种子培养：将实验室斜面保存的红法夫酵母菌株，取一环菌苔接种于摇瓶种子培养基中，温度为20～22℃、pH为5.0～7.0的条件下，培养30～72h，得到一代摇瓶种子培养液；将一代摇瓶种子培养液扩大培养3～4代，获得摇瓶种子培养液；
步骤二、车间种子培养：按3～5％的比例将步骤一中所得的摇瓶种子培养液接种于一级种子发酵罐，一级种子发酵罐预中预先装填了车间种子培养基，在温度为20～22℃、转速100～200rpm、溶氧量不低于40～60％的条件下，培养16～48h，得到车间种子培养液；
步骤三、发酵生产：将步骤二中所得的车间种子培养液按5～10％的比例接种于发酵罐中，发酵罐中预先装填了6～7t发酵培养基，发酵培养基添加有番茄粉，在温度为20～22℃、转速为100～200rpm、溶氧量不低于40～60％、pH为4.0～6.0的条件下，发酵66～80h，得到发酵液，其中，发酵20～30h后进入补料期，补料期流加600g/L的葡萄糖，使发酵过程中葡萄糖浓度控制在15～35g/L。
2.根据权利要求1所述的一种通过提高红法夫酵母生物量合成虾青素的方法，其特征在于：所述摇瓶培养基、车间种子培养基、发酵培养基在接种前均经过121℃、25min灭菌，达到无菌状态。
3.根据权利要求2所述的一种通过提高红法夫酵母生物量合成虾青素的方法，其特征在于：步骤一中所述摇瓶培养基的配方为：葡萄糖2～10g/L，酵母浸粉3～8g/L，麦芽浸粉3～6g/L，蛋白胨5～10g/L。
4.根据权利要求2所述的一种通过提高红法夫酵母生物量合成虾青素的方法，其特征在于：步骤二中所述车间种子培养基的配方为：葡萄糖20～25g/L，酵母浸粉1～5g/L，蛋白胨2～10g/L。
5.根据权利要求2所述的一种通过提高红法夫酵母生物量合成虾青素的方法，其特征在于：步骤三中所述发酵培养基的配方为：葡萄糖25～50g/L，酵母浸粉5～20g/L，蛋白胨2～5g/L，硫酸铵5～10g/L，尿素1～3g/L。
6.根据权利要求5所述的一种通过提高红法夫酵母生物量合成虾青素的方法，其特征在于：步骤三中所述发酵培养基中番茄粉的添加量为10～30g/L。
7.根据权利要求6所述的一种通过提高红法夫酵母生物量合成虾青素的方法，其特征在于：步骤三中发酵培养基PH的控制利用了柠檬酸和NaOH。
8.一种如权利要求1所述的通过提高红法夫酵母生物量合成虾青素的测定方法，其特征在于：所述测定方法的具体过程如下：
①红法夫酵母生物量的测定
取10mL的发酵液，于10000rpm离心5min得到细胞，细胞用去离子水清洗两次，离心后转入称量瓶中，在烘箱中于105℃烘干至衡重，得到粉末，然后称重，粉末的重量为m1，
利用公式Ⅰ计算生物量，公式Ⅰ如下所示：
其中，X表示样品中红法夫酵母的生物量，单位为g/L；m1表示样品烘干后粉末及称量瓶的质量，单位为g；m0表示空称量瓶的质量，单位为g；V表示发酵液样品的体积，单位为mL；1000表示单位换算系数；
每个样品取3个平行样进行测定，以其算术平均值为结果，结果保留小数点后2位；
②虾青素含量的测定
首先，提取虾青素提取液，具体提取方法为：
准确称取0.1g的粉末加入50mL离心管中，用5mL移液枪向离心管中加入10mL二甲基亚砜，使用漩涡混合器充分混合，将离心管放置在超声波清洗器中，进行第一次浸提，浸提时间20min，浸提温度40℃，超声强度无要求，浸提结束，漩涡混匀后，在10000rpm条件下离心5min，收集上清；向经过浸提、离心后的残渣中加入10mL二甲基亚砜，漩涡混匀后放置在超声波清洗器中，进行第二次浸提，浸提时间20min，浸提温度40℃，超声强度无要求。浸提结束，漩涡混匀后，在10000rpm条件下离心5min，收集上清；继续向上一步离心后的残渣中加入10mL二甲基亚砜，漩涡混匀后放置在超声波清洗器中，进行第三次浸提，浸提时间20min，浸提温度40℃，超声强度无要求，浸提结束漩涡混匀后在10000rpm条件下离心5min，收集上清，将前三次上清混合，在10000rpm条件下离心5min，除去残留固体杂质，获得虾青素提取液；
其次，绘制标准曲线：
准确称取虾青素标准品0.002g精确到0.00001g，用二甲基亚砜完全溶解并定容至100mL容量瓶中，得到20μg/mL标准液母液，对该母液按照1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL、6μg/mL进行梯度稀释，各梯度标准液在490nm处进行分光光度计测定，使用上述各浓度及所对应吸光值绘制标准曲线，要求线性回归方程Y＝aX+b中的相关系数的平方R2>0.995；
然后，虾青素提取液的处理：
使用二甲基亚砜对虾青素提取液进行适当稀释，稀释倍数记为k，漩涡震荡后在490nm处使用分光光度计测吸光值，记录所得吸光值A，要求吸光值在0.2～0.9之间；
虾青素含量的计算如公式Ⅱ所示：
其中，C表示样品中的虾青素含量，单位为mg/g；A表示样品中虾青素的吸光值；b表示线性回归方程标准曲线中的截距；V表示提取所用的溶剂体积，单位为mL；a表示线性回归方程标准曲线中的斜率，单位为mL/μg；k表示样品稀释倍数；m表示称取样品质量，单位为g；1000表示单位换算系数；
每个样品取3个平行样进行测定，以其算术平均值为结果，结果保留小数点后2位；
③虾青素产量的测定
虾青素产量的计算如公式Ⅲ所示：
A＝C×X Ⅲ
其中，A表示样品中虾青素的产量，单位为mg/L；C表示样品中虾青素的含量，单位为mg/g；X表示样品中的红法夫酵母生物量，g/L。
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