CN103451235B - 一种利用枯草芽孢杆菌生产红色素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物发酵领域，涉及利用枯草芽孢杆菌液体发酵制备红色素的工艺方法以及红色素粗产品的纯化精制技术。本发明所用菌株为枯草芽孢杆菌 (Bacillussubtilis) HJ，保藏编号为CGMCCNo.5701。本发明提供的发酵生产红色素的方法，包括如下步骤：（1）种子液的制备：将菌种枯草芽孢杆菌CGMCCNo.5701活化培养后获得种子液；（2）将种子液接入发酵培养基进行发酵，所述发酵为摇瓶发酵或深层液体通风发酵；（3）提取枯草芽孢杆菌发酵液中的红色素。通过摇瓶发酵方法红获得的红色素产量达到1.8g/L以上。通过深层液体通风发酵方法获得的红色素产量为2.4g/L。

Description

一种利用枯草芽孢杆菌生产红色素的方法

技术领域：

本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及利用枯草孢杆菌液体发酵制备红色素的工艺方法以及红色素粗产品的纯化精制技术。

背景技术：

天然色素不仅可以作为食品添加剂，用于食品染色，其中一些色素还具有重要的生理保健功能，而且在化妆品行业、纺织、服装、家纺行业都有广泛的应用。我国庞大的天然色素研发队伍，使我国食品工业在改革开放以来快速发展壮大。经过多年的努力，我国的食用色素产业已然崛起，形成一定规模，成为未来食品工业中的一个不可缺少的行业。传统以动植物为原料生产天然色素具有诸多缺点，而利用微生物资源生产天然色素成本低、周期短、操作方便，且不受时间空间的限制，容易实现工业化生产。所以采用微生物生产天然色素将逐渐成为天然色素来源的主流，并将为我国天然色素行业的发展提供丰富的原料。

红色作为三原色之一，能与黄、蓝两色以不同比例调和出多种色彩，故此，红色素有很高的附加值。目前常用的红色素多集中于红色植物，如红辣椒；某些真菌，如红曲霉菌，以及极少数细菌。传统的以红色植物为原料的提取方法原料需求量极大，且易造成浪费。而目前已报道的用来生产红色素的微生物多为真菌，例如：红曲霉菌，但真菌受到生长条件，和时间的限制，对此，研究人员探索一种利用细菌（如枯草芽孢杆菌）生产红色素的生产工艺，在其液体发酵及其发酵条件优化和发酵产物提取精制等方面进行研究，为天然红色素的开发提供一种简便可行的生产方法和提纯方法。枯草芽孢杆菌已被用来生产功能性食品和饲用微生态制剂，是食品、饲料中允许使用的微生物，具有极高的安全性，是一种潜在的益生菌。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种利用枯草芽饱杆菌发酵生产红色素的方法。

本发明技术方案如下：

本发明所用菌株为枯草芽饱杆菌(Bacillus subtilis)HJ，保藏编号为CGMCC No.5701。保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101，保藏日期：2012年1月9日。

本发明提供的发酵生产红色素的方法，包括如下步骤：（1）种子液的制备：将菌种枯草芽孢杆菌CGMCC No.5701活化培养后获得种子液；（2）将种子液接入发酵培养基进行发酵，所述发酵为摇瓶发酵或深层液体通风发酵；（3）提取枯草芽孢杆菌发酵液中的红色素。

所述摇瓶发酵制备方法如下：

将种子液以2-10%的接种量接入发酵培养基，250ml三角瓶装液量为30-60ml，三角瓶塞采用乳胶塞，培养温度30-35℃，转速160-180r/min摇床培养12-15h，而后于24-29℃恒温箱静置培养106h。

所述发酵培养基组成：麦芽糖0.3-0.8g、麸皮浸出液10ml，可溶性淀粉0.4-0.7g、葡萄糖0.6-1.2g、硫酸铵0.3g、蛋白胨1g、牛肉膏0.5g、NaCl0.5g、KH₂PO₄0.1g、MgSO₄·7H₂O0.04g、蒸馏水100mL，pH7.5-8.0，121℃，灭菌20min。

所述种子培养基组成：蛋白胨1g、牛肉膏0.5g、酵母粉0.5g、NaCl0.5g、K₂HPO₄0.02g、H₂O100mL，pH6.8-7.2，121℃灭菌20min。

通过摇瓶发酵方法红获得的红色素产量达到1.8g/L以上。

所述深层液体通风发酵方法如下：

红色素的气升式发酵：将气升式反应器装入10L液体发酵培养基，通过发酵罐夹套升温到95℃时，改为将蒸汽直接通入到液体培养基中，121℃灭菌30min，然后将温度逐渐降至32-35℃，将种子液以3-8%的接种量接入培养基中，初始发酵12-15h，发酵控制条件为：35-37℃，pH7.5-8.0，通气量为0.6vvm；发酵12-15h后将发酵温度调为25-26℃通气量调节至0.3vmm，pH调节至8.0；发酵72h，补加浓度1g/L的葡萄糖500ml。

气升式通风发酵培养基组成：麦芽糖0.5g、可溶性淀粉0.5-0.7g、葡萄糖0.7-1g、硫酸铵0.3g、硝酸铵0.2g，蛋白胨0.4-1g、牛肉膏0.5g、NaCl0.5g、KH₂PO₄0.1g、MgSO₄·7H₂O0.04g、蒸馏水100mL，pH8.0，121℃，灭菌20min。

通过深层液体通风发酵方法获得的红色素产量为2.4g/L。

发酵液中红色素的提取：

所述摇瓶发酵或深层液体通风发酵结束后，发酵液10000r/min离心10min，洗涤沉淀得菌体，用80%的pH4.5的酸性乙醇作为溶剂，然后用300W超声细胞破碎仪，破碎温度35℃，超声时间为30min；然后将破碎液在37℃下震荡抽提40min，10000r/min离心5min，超声振荡处理后得红色素溶液；接着采用旋转蒸发仪真空浓缩，温度控制为55-65℃，当浓缩至色素溶液粘稠时，取出色素浓缩液，-20℃冷冻过夜，然后将结冰的色素置于真空冷冻干燥机中，控制真空度为30-50Pa，温度为-35℃，冷冻时间15-18h；取出即为干燥好的红色素制品。

本发明所产红色素的特性：

该色素易溶于甲醇，乙醇，酸性乙醇，异丙醇，正丁醇，乙酸等有机溶剂，色素溶液的最大吸收波长为535nm；该红色素的酸碱稳定性及耐热性较好；该色素在避光、室内散射光和室外自然光照射下具有良好的光稳定性，但紫外光对其光稳定性有一定的影响；该色素对Na^＋、K^＋的稳定性较好；Ca^2＋对其具有明显的消色作用；Mn^2＋对其具有明显的增色作用，并且持续增色；Mg^2＋、Fe^2＋、Fe^3＋、Cu^2＋均可以使色素溶液产生沉淀或结晶，并且Fe^3＋对色素色泽影响最大。氧化剂对色素的影响较小，但还原剂对红色素影响显著。食品中常用的防腐剂苯甲酸钠和山梨酸钾对红色素稳定性几乎没有影响。小鼠经口急性毒性试验显示，在最大剂量范围内未产生毒副作用，且无剂量反应关系，本发明红色素属于无毒级，是一种安全性较高的天然色素，因此具有较大的开发利用价值，可以应用于食品等工业。

有益效果：

（1）本发明提供一种以枯草芽孢杆菌为生产菌的红色素液体发酵方法，操作简便，重现性好，发酵后期采用静置方式，节省人力资源，减小能耗，且红色素产量较高，达到2.4g/L。

（2）本发明提供一种从枯草芽孢杆菌红色素发酵液中提取纯化红色素的方法，能够较快速地纯化出该色素，色素回收率85%，色素纯度在95%以上。

（3）本发明制备得到的红色素属于纯天然色素产品，没有人工化学合成色素的潜在危害性，不会对环境造成污染。小鼠经口急性毒性试验证明，对动物体不会产生任何毒副作用，可以在食品工业、化妆品工业、医药、生物试剂、防治中广泛应用。

（4）本发明筛选到的菌株遗传稳定性好。连续传代10代以上，红色素的合成能力基本不变。

（5）本发明所述产红色素菌株培养周期短，发酵速度快，色素产量高，成本低，所产色素稳定性强、颜色鲜艳，对发酵设备要求低，无需大型发酵设备，节省大量动力和人工费用，具有工业化开发价值。

附图说明：

图1菌株HJ固体平板菌落

图2菌株HJ液体发酵情况

图3红色素的洗脱曲线

图4红色素的吸收光谱

图5温度对色素稳定性的影响

图6光照对色素稳定性的影响

具体实施方式：

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

实施例1：高产红色素菌株的筛选

（1）富集培养：

将1g土样(采集于含腐殖质丰富的土壤)加入装有80ml无菌水的250ml三角瓶中，加入无菌玻璃珠，在150r/min摇床中振荡20min。吸取3-4ml振荡后的乳浊液，加入100ml富集培养基中，置于35℃、转速170r/min的恒温摇床中培养48h。富集培养基：麸皮浸出液5ml、牛肉膏0.3g，蛋白胨1g，NaCl0.5g，K₂HPO₄0.1g，MgSO₄·7H₂O0.02g,H₂O95mL，pH7.2，121℃灭菌20min。

（2）初筛：

将富集后的培养液逐级稀释到10^-4、10^-5、10^-6，取0.2ml涂布于初筛固体培养基平板上，平板晾至表面没有流动液体时，在32-37℃恒温培养箱中培养30～36h，然后培养温度降到24～32℃，继续培养24～72h。挑取初筛平板上菌落或菌落周围显示红色的菌株进行纯化。

初筛固体培养基：牛肉膏0.3g，蛋白胨1g，NaCl0.5g，K₂HPO₄0.1g，MgSO₄·7H₂O0.02g，H₂O100mL，琼脂粉1.6g，pH7.2，121℃灭菌20min。

（3）纯化：

将初筛出来的菌株，于牛肉膏蛋白胨培养基平板上划线，置于37℃恒温培养箱中培养48h，重复划线培养三次以上，如连续多次在显微镜下观察到形态单一的菌体则认为菌株已纯化。本发明所述菌株如图1所示。

（4）复筛：

将初筛平板上菌落或菌落周围显示红色的菌株接种到种子培养基中，32-37℃恒温震荡摇床培养16-20h后，按照2-6%的接种量接种到复筛发酵培养基中，摇床震荡培养。发酵条件为：250ml三角瓶，装液量为30-60ml，初始12-18h，摇床震荡频率为160-220r/min，然后三角瓶继续培养24-72h，发酵温度24-32℃。选择发酵培养后发酵液颜色红色越深的对应菌株低温保藏。

麸皮浸出液的制备方法：5g麸皮加水在电炉上加热，待沸腾后，改用小火熬煮，当水少于80ml时，补充水至100ml，在沸水中煮沸30min，取其过滤液，定容至100ml。

种子培养基：蛋白胨1g、牛肉膏0.5g、酵母粉0.5g、NaCl0.5g、K₂HPO₄0.5g、H₂O100mL，pH7.2，121℃灭菌20min。

复筛培养基：麸皮浸出液10ml，牛肉膏0.3g，葡萄糖0.5g，蛋白胨1g，NaCl0.5g，NH₄NO₃0.02g，H₂O90mL,，pH7.5，121℃灭菌20min。

(5)菌种保藏：

将筛选到的菌种在牛肉膏蛋白胨上划线，分离到单菌落后在LB斜面培养基上划线，37℃培养3天，置于4度冰箱内保存。

斜面培养基(g/L)：葡萄糖10，蛋白胨10，NaCl5，琼脂15，pH值7.2～7.4，121℃灭菌20min。

实施例2：高产红色素菌株HJ形态特征及生理生化特征

本发明所述菌株，牛肉膏蛋白胨培养基平板培养18h后，观察菌落形态，表面较粗糙，边缘不整齐，菌落颜色为淡红色，革兰氏染色呈阳性。菌体的形态为短杆棒状。菌体大小为0.65μm×2.7μm，可形成内生芽孢，菌体具有运动性；纤维素分解实验呈阴性；在糖类发酵实验中，该菌株可利用可溶性淀粉、葡萄糖、麦芽糖和蔗糖做唯一性碳源生长；在其他生理生化检测中，该菌株接触酶、VP测定呈阳性，能水解淀粉，液化明胶，能利用柠檬酸盐，不产生荧光色素，甲基红实验呈阳性。菌株HJ具体的形态学及生理生化特征见表1。菌落、染色特征和生理生化特征与《伯杰细菌鉴手册》（第八版）中的枯草芽孢杆菌比较接近，初步确定菌株HJ为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

表1菌株HJ形态学及生理生化特性

注：“+”和“-”分别代表阳性和阴性

实施例3：摇瓶发酵方法生产红色素

1、发酵菌种的准备：将事先筛选保藏的枯草芽孢杆菌菌种在牛肉膏蛋白胨培养基平板上划线，而后倒置于37℃恒温培养箱中15～24h进行活化。

固体培养基的配置方法是：牛肉膏0.3g、蛋白胨1.0g、琼脂粉1.5g、加蒸馏水至100mL，pH7.2，121℃，灭菌20min。

2、制备枯草芽孢杆菌的种子液：从步骤1中活化好的菌种中挑取单菌落，接入装有30mL种子培养基的250mL锥形瓶中，35-37℃摇床培养18-25h，转速160-200r/min。

种子培养基的组成：蛋白胨1g、牛肉膏0.5g、酵母粉0.5g、NaCl0.5g、K₂HPO₄0.02g、加蒸馏水至100ml，pH6.8-7.2，121℃，灭菌20min。

3、摇瓶发酵培养：将步骤2中的种子液，以2-10%的量接入装有30-60ml优化培养基的250mL锥形瓶中，三角瓶塞采用乳胶塞，30-35℃摇床培养12～15h，转速160-180r/min，而后静置于24-29℃恒温培养箱中，培养106h即可达到最佳色素产量。通过该种发酵方法红色素产量达到1.8g/L以上。发酵后结果如图2所示。

发酵培养基组成：麦芽糖0.3-0.8g、麸皮浸出液10ml，可溶性淀粉0.4-0.7g、葡萄糖0.6-1.2g、硫酸铵0.3g、蛋白胨1g、牛肉膏0.5g、NaCl0.5g、KH₂PO₄0.1g、MgSO₄·7H₂O0.04g、蒸馏水100mL，pH7.5-8.0，121℃，灭菌20min。

麸皮浸出液的制备方法：5g麸皮加水在电炉上加热，待沸腾后，改用小火熬煮，当水少于80ml时，补充水至100ml，在沸水中煮沸30min，取其过滤液，定容至100ml。

实施例4：深层液体通风发酵方法生产红色素

1、发酵菌种的准备基本同实施例3.

2、制备枯草芽孢杆菌一级种子

从步骤1中活化好的菌种中挑取单菌落，接入250mL锥形瓶中，装液量为100mL的种子培养基中，37℃摇床培养18h，转速180r/min。

3、二级种子液的制备

从步骤2中摇好的一级种子液，接入装有300mL种子培养基的1000mL锥形瓶中，接种量为6%，32-37℃摇床培养18-25h，转速260-180r/min。

种子培养基的组成同实施例3。

4、红色素的气升式发酵

将气升式反应器打开罐体上口处的注料口，装入10L液体培养基，通过发酵罐夹套升温到95℃时，改为将蒸汽直接通入到液体培养基中，121℃灭菌30min，然后将温度逐渐降至32-35℃，将步骤3所得的二级种子液以3-8%的量接入培养基中，初始发酵12-15h，发酵控制条件为：35-37℃，发酵培养基pH7.5-7.8，通气量为0.6vvm。发酵12-92h，发酵12-15h后将发酵温度调为25-26℃，通气量调节至0.3vmm，pH调节至8.0。发酵72h，补加浓度1g/l的葡萄糖500ml。通过该通风发酵方式，产色素量为2.4g/L。

气升式通风发酵培养基组成：麦芽糖0.5g、可溶性淀粉0.5-0.7g、葡萄糖0.7-1g、硫酸铵0.3g、硝酸铵0.2g，蛋白胨0.4-1g、牛肉膏0.5g、NaCl0.5g、KH₂PO₄0.1g、MgSO₄·7H₂O0.04g、蒸馏水100mL，pH8.0，121℃，灭菌20min。

实施例5：红色素分离纯化方法

1、色素抽提

将上述发酵步骤所得发酵液10000r/min离心10min，得到沉淀菌体加入蒸馏水充分震荡悬浮，8000r/min，离心10min，去上清液。按照以上方法重复3次，对菌体充分洗涤。洗涤好的固体菌体加入80%的pH4.5的酸性乙醇，充分吹打悬浮，然后用300W超声破碎抽提，破碎温度35℃，超声时间为30min。菌体超声后，震荡器37℃下震荡抽提40min，然后10000r/min离心5min，分离出上清液，沉淀细胞碎片中加入异丙醇，充分悬浮后，再用300W超生破碎抽提，破碎温度35℃，超声时间为20min。菌体超声后，震荡器37℃下震荡抽提30min，然后10000r/min离心5min。将上清同上次上清液合并进一步纯化。

2、红色素浓缩干燥

抽提得到的红色素溶液，采用旋转蒸发仪真空浓缩，温度控制为55-65℃，当浓缩至色素溶液较为粘稠时，取出色素浓缩液。-20℃冷冻过夜，然后将结冰的色素置于真空冷冻干燥机中，控制真空度为：30-50Pa，温度为-35℃，冷冻时间15-18h。干燥彻底后，取出即为干燥好的红色素制品。

3、红色素纯化

选用美国GE公司全自动层析仪对红色素进行纯化。使用pH8.0浓度20mmol/L的Tris-HCl缓冲液充分平衡DEAE-Sepharose fast flow(2.5cm×30cm)阴离子交换柱，然后将干燥好的色素制品用去离子水稀释至浓度为5%，取5ml上样，接着用pH8.0、20mmol/L的Tris-HCl缓冲液洗脱未结合的色素，洗至洗脱曲线没有变化为至。然后用浓度为0-80%的异丙醇作线性梯度洗脱，洗脱速度为1ml/min，每管收集4mL，洗脱时间为120min。在洗脱浓度为40%-60%处出现洗脱峰，该洗脱峰同收集管红色素颜色相一致。洗脱曲线如图3所示。收集红色素集中的收集管，合并后再进行浓缩和冷冻干燥，最后制得较纯的红色素制品。

4、菌株HJ所产色素的光谱特征

将得到的色素浓缩液用95%乙醇稀释至体积浓度2%，用紫外可见光光度计进行光谱扫描，以95%乙醇为参照，选取扫描波长为180～900nm，如图4，可以看出该红色素在535nm处有最大的特征吸收峰，其最大吸光度为1.187。分析光谱曲线可知：该色素的最大吸收波长为535nm，说明该色素的分子结构具有很大的共轭体系，可能有很多共轭双键，苯环或类似苯环的共轭结构，或含杂原子的一些杂环。

实施例6：红色素的稳定性实验

1、pH值对色素稳定性的影响

将95%乙醇pH分别调至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11，分别向10mL各pH值乙醇溶液中加入200μL色素乙醇浓溶液，混合均匀，20℃静置30min后，观察该红色素在各pH值乙醇溶液中的颜色变化情况，并测定其静置后的535nm处的吸光度。结果如表2所示。红色素吸光度的总体变化趋势是随着乙醇pH值的增加而先升后下降，颜色由紫红色渐变为浅橙色。该色素的色调随着pH值的变化呈现不同的颜色，有紫红、红、浅红、橙色等，可以满足着色的不同需求。从另一方面分析，pH值在2～6之间对色素影响较小，色素颜色较稳定。pH值在8～11之间，随着pH值的增加，色素表现为明显的消色行为。

表2pH值对色素稳定性的影响

2、温度对色素稳定性的影响

取稀释后的色素乙醇溶液，分别在25℃、40℃、55℃、70℃恒温水浴中孵育0min、30min、60min、90min后分别取样，测定其吸光度，并绘制不同温度条件随着时间的变化，红色素吸光度变化的曲线图。结果如图5所示。在25℃条件下红色素的吸光度随着时间延长变化不大；在40℃条件下加热红色素溶液，其吸光度随着温度的升高而有所增加，但变化不大。在55℃以下，随着时间的延长，色素溶液吸光度值变化不大，说明红色素在55℃以下比较稳定；当温度为70℃时，随着时间的延长，色素溶液的吸光度有下降的趋势。总体来说该红色素的耐热性较好，但在使用该色素的过程中还应保持适宜的温度。

3、光照对色素稳定性的影响

取稀释后的色素乙醇溶液，分别置于室外自然光、8W254nm波长紫外光灯和暗室处，室温静置0min、30min、60min、90min后分别取样，测定其吸光度，并绘制光照时间与红色素吸光度的关系曲线图。结果如图6所示，红色素溶液在室内避光即暗室条件下，其吸光度值随着时间的延长没有大的变化，基本保持平稳；在室外自然光照射条件下，其吸光度值随着时间的延长会略微下降。紫外光对红色素的稳定性有一定的影响，溶液在紫外灯下照射30min后，色素的吸光度值明显下降；在紫外灯下放置90min后，色素液消色明显，由紫红色变成棕黄色，色素残存率为开始的70%左右。

总的来说该红色素有较好的光稳定性。该色素在贮存和使用过程中应避免强光及紫外光照射。

4、金属离子对色素稳定性的影响

取稀释后的色素乙醇溶液分别加入NaCl、KCl、MgCl₂、CuSO₄、CaCl₂、FeSO₄、Fe₂(SO₄)₃等终浓度为10mmol/L的金属离子溶液，混合合均匀，测定静置0h和2h后的吸光度。结果如表3所示。大多数所测金属离子对色素色泽有影响。该红色素对Na^＋、K^＋的稳定性较好；Ca^2＋具有明显的消色作用；Mn^2＋具有明显的增色作用，并且持续增色；Mg^2＋、Fe^2＋、Fe^3＋、Cu^2＋均可以使色素溶液产生沉淀或结晶，并且Fe^3＋对色素色泽影响最大。故该色素在贮存和使用过程中应避免与铁制和铜制容器的接触。

表3金属离子对色素稳定性的影响

5、氧化剂对色素稳定性的影响

分别取5mL稀释后的色素液分别加入1mL、2mL、3mL、4mL、5mL30%的H₂O₂，用95%乙醇定容至10mL，混合均匀，静置20min后观察，测定吸光度。结果如表4所示。随着H₂O₂的加入体积分数的增大和放置时间的延长，色素液的吸光度基本保持在一个稳定的水平，色素的色泽基本不变，2h后色素的残存率很高，达98%以上。故该红色素的抗氧化性能较好。

表4氧化剂对色素稳定性的影响

6、还原剂对色素稳定性的影响

分别取5mL稀释后的色素液分别加入一定体积梯度的Na₂SO₃溶液，用95%乙醇定容至10mL，混合均匀，静置20min后观察，并测定吸光度。结果如表5所示。Na₂SO₃加入使色素的吸光度明显下降，随着Na₂SO₃体积浓度的增加色素的色泽明显发生变化，溶液由紫红→橙色→浅黄色→乳黄色渐变。并且Na₂SO₃的体积浓度越大，溶液产生的沉淀越多，色素的吸光度越低，最终接近于0。故该红色素的抗还原性不是很好，不能与抗氧化剂一起使用。

表5还原剂对色素稳定性的影响

7、防腐剂对红色素稳定性的影响

分别取5mL稀释后的红色素溶液分别加入相同浓度的苯甲酸钠和山梨酸钾，混合均匀，25℃静置30d后观察。结果发现，红色素溶液中加入山梨酸钾或苯甲酸钠后，其吸光度随存放时间的延长几乎无变化，说明色素液对苯甲酸钠和山梨酸钾有较好的稳定性。

实施例7：红色素经口急性毒性试验

选择健康小鼠40只，雌雄各半，每只体重20～25g，随机分成4组，每组10只，在实验室适应性喂养5d后，给药前禁食8h，不禁水。四组分别以用蒸馏水配成的红色素浓度为0.5g/ml、0.25g/ml、0.125g/ml、0.0625g/ml4个不同剂量组进行灌胃，灌量按照30ml/kg，共分3次灌胃，每次间隔8h。观察10d，在此期间让小鼠自由进食和饮水。每天观察小白鼠的进食、活动、大小便、精神等全身反应状况及死亡情况，并及时记录。结果如表6所示。红色素灌胃剂量达小鼠最大耐受剂量15000mg/kg.bw时，小鼠无一死亡或中毒症状。在10天观察期内，小白说活动敏捷，皮毛光滑，整个试验过程中均未见受试动物有任何死亡或异常反应，未见小白鼠出现明显的中毒症状。从定性和定量的角度，以LD50为依据对受试物毒性进行分级，根据国标GBl5193.3-94颁布的化学物质的急性毒性分级标准，LD50>15000mg/kg.bw为无毒，根据现有标准和试验结果，可认为本发明红色素为无毒级。

表6红色素灌胃急性毒性试验

实施例8：红色素的食品着色试验

大米着色试验：取500g大米，加入浓度为50mg/L的红色素溶液1L，浸泡12h后，蒸煮20min，观察大米的颜色。结果显示，大米呈现深红色，比蒸煮初期颜色稍深。故说明本发明红色素可以用做食品色素。

发酵香肠应用试验：在发酵香肠的加工工艺中，改用本发明的红色素作发酵香肠的发色剂。肉搅拌中按照1g/kg的量添加红色素，以150ppm的亚硝酸钠作为对照，结果显示：以红色素为着色剂制作的发酵香肠其颜色接近于150ppm亚硝酸钠为发色剂制作的发酵香肠。以本发明红色素制作的发酵香肠在4℃条件下贮存，一个120d内不变色。虽然用量较亚硝酸钠多，但安全性高。

Claims (4)

1.一种利用枯草芽孢杆菌生产红色素的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)种子液的制备：将菌种枯草芽孢杆菌CGMCCNo.5701活化培养后获得种子液；(2)将种子液接入发酵培养基进行发酵，所述发酵为摇瓶发酵或深层液体通风发酵；(3)枯草芽孢杆菌发酵液中红色素的提取；

所述摇瓶发酵的方法包括以下步骤：将种子液以2-10％的接种量接入发酵培养基，250ml三角瓶装液量为30-60ml，三角瓶塞采用乳胶塞，培养温度30-35℃，转速160-180r/min摇床培养12-15h，而后于24-29℃恒温箱静置培养106h；

所述深层液体通风发酵的方法包括以下步骤：红色素的气升式发酵：将气升式反应器装入10L液体发酵培养基，通过发酵罐夹套升温到95℃时，改为将蒸汽直接通入到液体培养基中，121℃灭菌30min，然后将温度逐渐降至32-35℃，将种子液以3-8％的接种量接入培养基中，初始发酵12-15h，发酵控制条件为35-37℃，pH7.5-8.0，通气量为0.6vvm；发酵12-15h后将发酵温度调为25-26℃，通气量调节至0.3vmm，pH调节至8.0；发酵72h，补加浓度1g/L的葡萄糖500ml；

所述发酵液中红色素的提取方法包括以下步骤：发酵液10000r/min离心10min，洗涤沉淀得菌体，用80％的pH4.5的酸性乙醇作为溶剂，然后用300W超声细胞破碎仪，破碎温度35℃，超声时间为30min；然后将破碎液在37℃下震荡抽提40min，10000r/min离心5min，超声振荡处理后得红色素溶液；接着采用旋转蒸发仪真空浓缩，温度控制为55-65℃，当浓缩至色素溶液粘稠时，取出色素浓缩液，-20℃冷冻过夜，然后将结冰的色素置于真空冷冻干燥机中，控制真空度为30-50Pa，温度为-35℃，冷冻时间15-18h；取出即为干燥好的红色素制品。

2.根据权利要求1所述的一种利用枯草芽孢杆菌生产红色素的方法，其特征在于，所述摇瓶发酵培养基组成：麦芽糖0.3-0.8g、麸皮浸出液10ml，可溶性淀粉0.4-0.7g、葡萄糖0.6-1.2g、硫酸铵0.3g、蛋白胨1g、牛肉膏0.5g、NaCl0.5g、KH₂PO₄0.1g、MgSO₄·7H₂O0.04g、蒸馏水100mL，pH7.5-8.0，121℃，灭菌20min。

3.根据权利要求1所述的一种利用枯草芽孢杆菌生产红色素的方法，其特征在于，所述气升式通风发酵培养基组成：麦芽糖0.5g、可溶性淀粉0.5-0.7g、葡萄糖0.7-1g、硫酸铵0.3g、硝酸铵0.2g，蛋白胨0.4-1g、牛肉膏0.5g、NaCl0.5g、KH₂PO₄0.1g、MgSO₄·7H₂O0.04g、蒸馏水100mL，pH8.0，121℃，灭菌20min。

4.根据权利要求1所述的一种利用枯草芽孢杆菌生产红色素的方法，其特征在于，所述种子液的制备所用培养基组成：蛋白胨1g、牛肉膏0.5g、酵母粉0.5g、NaCl0.5g、K₂HPO₄0.02g、加蒸馏水至100ml，pH6.8-7.2，121℃，灭菌20min。