CN101864380A

CN101864380A - 一种蓝色素产生菌及其制备的粗制剂和方法

Info

Publication number: CN101864380A
Application number: CN 201010166734
Authority: CN
Inventors: 唐琦勇; 宋素琴; 朱静; 王浩
Original assignee: INSTITUTE OF MICROBIOLOGY XINJIANG ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Current assignee: INSTITUTE OF MICROBIOLOGY XINJIANG ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Priority date: 2010-05-10
Filing date: 2010-05-10
Publication date: 2010-10-20
Anticipated expiration: 2030-05-10
Also published as: CN101864380B

Abstract

本发明公开一种可产生的蓝色素的黄杆菌(Flavobacterium sp.B29)CGMCC No.3699及其发酵提取方法制备获得的蓝色素的粗制剂。将增殖培养的菌种接种于液体PDA培养基中，25℃下、200rpm恒温培养12-24小时，以2-10％的接种量接种于PDA培养基，发酵培养48小时；离心收集发酵培养物中的菌体，以有机试剂50％的乙醇溶液作为萃取剂，萃取物经浓缩干燥后获得。所述的蓝色素具有一定的抗氧化功能和具有较好的热稳定性和光稳定性。本发明提供了生产蓝色素的新菌种，同时也为工业化生产天然蓝色素提供了新的途径，具有广泛的应用领域。

Description

一种蓝色素产生菌及其制备的粗制剂和方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体的，本发明涉及生产天然蓝色素的菌株和制备天然蓝色素粗制剂及其方法技术领域。

背景技术

色素即着色剂，因其能显著提高人们对物品性状的感官刺激，成为印染工业、食品添加剂和化妆品等行业的重要组成部分，同时也是决定产品品质的关键因素之一。常用的色素大致可以分为即人工合成色素与天然色素两类。人工合成色素是化学合成方法所制得的有机色素，主要是以煤焦油中分离出来的苯胺染料为原料制成，具有色泽鲜艳、着色力强、性质稳定和价格便宜等优点，被普遍的使用。但研究表明一般合成色素都有不同程度的毒性，甚至是致癌作用，同时在合成过程中常有重金属及其它有害物污染的现象，其全安性引起了广泛关注。目前世界各国，尤其是西方发达国家在食用色素的使用、管理等方面均有严格的规定，多种合成色素已被禁止或严格限量使用，而选择相对安全的天然色素来代替。

天然色素主要是从植物、动物、微生物中提取的天然色素类物质，是早在合成色素出现之前，人们一直使用的色素。与合成色素相比，绝大多数天然色素无毒副作用，生物相容性安全性高。许多天然色素本身可作为一种营养素，具有保健与一定的药理功能，如胡萝卜素被FDA列入药典，对心血管疾病、肿瘤等有疗效；花青苷在国外被制成抗辐射、治疗视力疲劳的口服液；茶色素用于临床等。目前，天然色素已成为食品、化妆品、保健品行业的发展趋势。

红、黄、蓝做为三个基本色素，可以相互搭配呈现出丰富色调，具有极高的应用价值。天然色素中红色素和黄色素的品种较多，天然蓝色素的来源和品种极为有限，主要有植物来源的桅子蓝色素、紫甘蓝色素、花青素、石蕊杀菌素及藻蓝素等。微生物可产生蓝色素的菌株十分少见，主要通过产蓝色素微生物发酵提取获得，因微生物发酵生产不受环境、气候、季节等因素影响，生产、提取方法简单，成本相对较低，是较为理想的色素生产方法。微生物产生蓝色素的种类较少，主要集中于放线菌，如的放线菌Streptomyces sp.(崔恒林等，产蓝色素放线菌细胞化学组分及16S rDNA序列分析，微生物学通报，2001，6：25-29)、海洋放线菌M259(邓祥元等，海洋链霉菌M259高产蓝色素理化性质研究，食品科学，2006，7：35-39)；天蓝色链霉菌100菌株(张和春等，天蓝色链霉菌胞内蓝色素提取方法研究，生物技术，2000，3：19-21)、链霉菌ZLT菌株(李一苇等，一株产蓝色素菌株生物学特性及色素基本性质的研究，生物学杂质，2007，1：41-43)、Streptomycesc oelicolor A 3(2)(Leonid，Jan等，5-Hydroxyaloesaponarin II，a minor blue pigment in an actinorhodin-negative mutantof Streptomyces coelicolor A3(2)[J].Biotechnol Appl Biochem，1997，26：195-201)等，以及Proctinomycescy aneus(Gause，Litmocidin等，a new antibiotic substanceproduced by Proctinomyces cyaneus[J].JBacteriol，1946，51：649-653)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)B1 CGMCC NO.1194(邢新会等，专利申请号：200410074325.0)等。这些菌种的种类及数量远不能满足各行业对天然蓝色素研究开发的需要。因此，筛选出能大量生产蓝色素的新型微生物菌种和具有不同特性蓝色素具有重要的科学研究和应用价值。

发明内容

本发明目的在于利用一种可产生的蓝色素的微生物菌株，通过发酵及提取制备获得天然蓝色素粗制剂。

本发明提供了一种蓝色素产生菌Flavobacterium sp及其天然蓝色素发酵与提取制备的方法及制备的蓝色素粗制剂。

本发明从新疆干旱荒漠环境中分离筛选得到多株菌，经过多级筛选，确定一株编号为B29，经微生物分类学检测鉴定，确定为细菌Flavobacterium属的新种。目前，该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏日期为2010年3月26日，保藏号为CGMCC No.3699。

本发明具体提供的蓝色素产生菌B29为革兰氏阴性、无芽孢杆菌；好氧；具运动性；在PDA固体培养基(土豆200g、葡萄糖20g，琼脂15g、水1000mL)上幼龄菌落为圆形、边缘整齐、白色、表面光滑湿润，老化后呈现蓝或蓝紫色、表面干燥、褶皱；生长温度范围4-30℃、最适生长温25℃；NaCl耐受能力小于4％；使用Biolog菌种鉴定仪GN测试板鉴定确定其能利用环糊精、糊精、Tween40、N-乙酰基-D-葡萄糖胺、D-果糖、龙胆二糖、D-葡萄糖、D-麦芽糖、D-甘露糖、D-海藻糖、L-天冬酰胺酸、L-谷氨酸、L-苏氨酸等唯一碳源。对该菌种黄杆菌(Flavobacterium sp.B29)CGMCC No.3699的形态观察、培养特征、生理生化特性和细胞化学分析按《常见细菌系统鉴定手册》东秀珠，蔡妙英所述的方法进行分析、测定，确定B29菌株为Flavobacterium中的成员。再结合16SrDNA序列比对及进化分析确定该菌为隶属Flavobacterium菌属，与该属标准模式菌Flavobacterium hercynium WB4.2-33T同源性98.9％、Flavobacteriumchungangense CJ7T同源性98.5％，目前尚未对该菌株进行正式的微生物分类学命名，暂定菌株名称为Flavobacterium sp.B29。

黄杆菌(Flavobacterium sp.B29)CGMCC No.3699可以采取斜面传代方式或真空冷冻干燥方式保藏。其中斜面传代保藏方法只要是在适合于菌株生长的固体培养基上，25℃下恒温培养48-72小时，待菌落完成生长时后置于4℃下恒温保藏，约6个月进行传代一次。利用真空冷冻干燥法保藏的菌种可在常温或低温条件下保藏1年以上。

长期保藏的菌种在发酵培养之前需对进行菌株进行活化培养。首先在适合于黄杆菌(Flavobacterium sp.B29)CGMCC No.3699的固体培养基上进行活化培养，同时检测菌株是否有杂菌污染。在本发明中选择PDA培养基(土豆200g、葡萄糖20g，琼脂15g、水1000mL)，以平板划线法或涂布法接种黄杆菌(Flavobacterium sp.B29)CGMCC No.3699于固体培养基表面进行增殖培养和杂菌检测。

进一步。本发明提供了由黄杆菌(Flavobacterium sp.B29)CGMCC No.3699发酵提取制备获得的蓝色素的粗制剂。

将增殖培养的黄杆菌(Flavobacterium sp.B29)CGMCC No.3699培养物接种于液体PDA培养基中，25℃下、200rpm恒温培养12-24小时，以2-10％的接种量接种于适合于菌体增殖的发酵培养基中，本发明采用发酵培养基为PDA培养基(500ml三角瓶装100ml发酵液)，发酵培养48小时；离心收集发酵培养物中的菌体，以有机试剂萃取，在本发明中优选50％的乙醇溶液作为萃取剂，萃取物经浓缩干燥后所得的物质即为蓝色素粗提物。

本发明制备的蓝色素制剂，即为蓝色素粗提取物，是一种混合物，该蓝色素制剂干燥时呈蓝色粉末状，该色素提取物在579nm处有一最大吸收峰；具有抗氧化功能；在pH 2.2～9.0范围内较为稳定；具有较好的热稳定性和光稳定性；低浓度Ca²⁺、Al³⁺、Pb²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺离子对色素稳定性影响较小，高浓度时影响较大。

作为本发明的天然蓝色素产生菌种，既可为本发明所保护的菌株，也可为自然筛选的原始菌株，或通过自然变异或人工诱导变异的变异菌株，也可通过分子生物学技术，从原始菌株或诱导变异菌种中获取天然蓝色素相关基因，以原核微生物如大肠杆菌，真核微生物如酵母等，作为基因受体菌，构建基因工程生产菌株，也可作为本发明的天然蓝色素产生菌种。

通过实施本发明具体的技术指标，可以达到以下有益效果。

本发明提供的黄杆菌(Flavobacterium sp.B29)CGMCC No.3699蓝色素产率可达0.781g/L-1.101g/L。10min 0.25mg/mL色素溶液对0.2g/L的DPPH标准溶液的自由基消除率为40.2％，在579nm处有一最大吸收峰，具有一定的抗氧化功能；蓝色素在pH2.2-9.3下保持相对稳定，色素最大吸收波长随着pH的增加而增加，由pH 2.2的569到pH 12.1的604，颜色也随之略有改变，具有较好的热稳定性和光稳定性；低浓度Ca²⁺、Al³⁺、Pb²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺离子对色素稳定性影响较小，高浓度时影响较大。这不仅为天然蓝色素获得提供了新的菌种，同时也增加了一个新的天然蓝色素品种，为工业化生产天然蓝色素提供了新的途径。

附图说明：

图1所示为本发明的黄杆菌(Flavobacterium sp.B29)CGMCC No.3699所产生的天然蓝色素的紫外-可见吸收图。

图2所示为自然光对黄杆菌(Flavobacterium sp.B29)CGMCC No.3699所产生的天然蓝色素溶液的浓度与吸光值标准曲线图。

图3所示为自然光对黄杆菌(Flavobacterium sp.B29)CGMCC No.3699所产生的天然蓝色素的影响图。

图4所示为不同金属离子对黄杆菌(Flavobacterium sp.B29)CGMCCNo.3699所产生的天然蓝色素的的影响图。

具体实施方式

实施例1：黄杆菌(Flavobacterium sp.B29)CGMCC No.3699的培养

将保藏的黄杆菌(Flavobacterium sp.B29)CGMCC No.3699在PDA培养基上进行传代活化培养，检测菌落颜色变的同时检测是否有杂菌污染；将活化的菌株接种于液体TGY培养基中(无琼脂)，液体培养基装料量为100mL/瓶(500mL三角瓶)，25℃恒温，200rpm下培养72小时，观察菌体生长与颜色变化。

黄杆菌(Flavobacterium sp.B29)CGMCC No.3699培养实验表明，在TGY培养基表面首先生成白色、湿润菌落，逐步生成表面褶皱、干燥的蓝色至蓝紫色菌落；在液体TGY培养基中，培养24小时出现明显的白色菌体，72小时后菌体呈现蓝色。

实施例2：蓝色素粗制剂的制备与吸光特性

如实施例1中所获得的黄杆菌(Flavobacterium sp.B29)CGMCC No.3699发酵液，以8000rpm、3min离心处理获得菌体，以每100mL发酵培养物所获菌体加入50mL 50％的乙醇溶液，100rpm振荡萃取处理1小时，再以8000rpm、5min离心处理，所获得的上清液即为蓝色素乙醇提取物；将乙醇提取物置于60℃恒温条件下进行真空浓缩直干，所得即为蓝色素粗提物。将所获得的蓝色素粗提物溶解于50％的乙醇溶液中，利用紫外分光光度计进行200-800nm的扫描分析，分析结果参见附图1所示。

分析结果表时，黄杆菌(Flavobacterium sp.B29)CGMCC No.3699产生的蓝色素在579nm处有最大的吸收峰，说明可以用579nm波长的光波进行B29菌株蓝色素的含量测定。

实施例3：蓝色素粗制剂的定量检测

按实施例2中所述的方法获制备黄杆菌(Flavobacterium sp.B29)CGMCCNo.3699的蓝色素粗制剂进行真空冷冻干燥，除去水份；精确称取1.000g干燥处理的制剂，使用50％的乙醇溶液进行充分溶解，并定容至100mL，制备成为250mg/L的蓝色素母液；进一步的稀释处理制备成为50、100、150、200、250mg/L的系列蓝色素溶液，并于579nm波长处测定吸光值；以蓝色素浓度为横作标，以579nm波长下的吸光值为纵坐标，绘制浓度-吸光值标准曲线。

黄杆菌(Flavobacterium sp.B29)CGMCC No.3699产生的蓝色素浓度与吸光值的对应关系测定结果参见附图2所示；依据测定结果所得对应计算方法如下。

C＝N×0.243×X

其中：C为色素浓度，mg/L

N为稀释倍数

X为579nm波长下的吸光值

0.234为吸光值与浓度值间的转换系数

实施例4：蓝色素粗制剂产生菌的液体发酵-Ⅰ

按实施例1中所述的方法对黄杆菌(Flavobacterium sp.B29)CGMCCNo.3699进行活化与检测；将检测后的菌株接种于液体TGY培养中，25℃、200rpm条件下培养24小时，再以2％的接种量接培养物接种于液体PDA培养基中，PDA培养基装料量为80mL/瓶(500mL三角瓶)，25℃、200rpm条件下培养60小时至菌体呈现蓝色。按实施例2中所述方法收集菌体并进行蓝色素的提取，按实施例3中所述进行发酵培养产率的测定。

结果表明，以此实施例所述的方法黄杆菌(Flavobacterium sp.B29)CGMCCNo.3699蓝色素产率可达0.781g/L。

实施例5：蓝色素粗制剂产生菌的液体发酵-Ⅱ

按实施例4中的述进行黄杆菌(Flavobacterium sp.B29)CGMCC No.3699的发酵培养，发酵培养基为可溶性淀粉5g，葡萄糖20 g，硝酸铵2 g，磷酸二氢钾2 g，硫酸镁0.5 g，水1000 mL，pH 7.0，每80 mL/瓶(500 mL三角瓶)，121℃灭菌20分钟。按实施例2中所述方法收集菌体并进行蓝色素的提取，按实施例3中所述进行发酵培养产率的测定。

结果表明，以此实施例所述的方法黄杆菌(Flavobacterium sp.B29)CGMCCNo.3699蓝色素产率可达1.101g/L。

实施例6：蓝色素粗制剂的提取

如实施例5中所述进行黄杆菌(Flavobacterium sp.B29)CGMCC No.3699液体发酵，以8000 rpm、3 min离心处理获得菌体，以每100 mL发酵培养物所获菌体分别加入50 mL 50％、100％的乙醇溶液，50％、100％甲醇溶液，乙酸乙酯、丙酮、正丁醇，于摇床100 rpm振荡萃取处理1小时，再以8000 rpm、5 min离心处理，取上清液于579nm波长测定吸光值，并计算得率，见表1。

表1不同溶液对提取效果

如表1所示，可以看出，使用上述不同的溶液提取得率非常相近，考率到安全、环保和费用，优先选取使用50％的乙醇溶液提取。

实施例7：蓝色素粗制剂的抗氧化特性

精确称取1，1-二苯-3-苦基肼(DPPH)10 mg，使用无水乙醇溶解并且定容至50 mL，从而配制成0.2 g/L的DPPH标准溶液。将本发明得到的蓝色素配制成0.25mg/mL乙醇溶液，分别吸取2 ml色素溶液和2 ml DPPH标准溶液，快速混匀后置于扫描分光光度计上，517nm光波下进行时间-吸光值扫描(扫描时间为10min)，记录起始吸光值A_i和10min后吸光值A_t；同时分别吸取2ml无水乙醇和2mlDPPH标准溶液作对照，记录A_O，通过以下公式计算自由基消除率。

公式：消除率＝[1-(A_i-A_t)/A₀]×100％

其中：A_i为色素与DPPH溶液混匀后的吸光值；A_t色素与DPPH溶液混匀，反应10min后的吸光值；A₀为乙醇与DPPH溶液混匀后的吸光值

通过测定计算可知，在本反应浓度和反应条件下，10min 0.25mg/mL色素溶液对0.2g/L的DPPH标准溶液的自由基消除率为40.2％

实施例8：蓝色素粗制剂的热稳定特性

将本发明得到的蓝色素分别配制成0.25mg/mL乙醇溶液和0.25mg/mL水溶液，各吸取10mL并密闭分装于玻璃试管中，置于4℃、20℃、40℃、60℃、80℃、100℃水浴2h时，迅速冷却至室温，于室温下测定579nm下的收光值，以未作保温处理的样本为对照计算色素的残余量，结果如见表2所示。由表2可以看出色素在乙醇溶液中非常稳定，在100℃水浴2h后色素损失仅为19.4％，而在水中损失率达到35.2％。

表2蓝色素的热稳定性

实施例9：蓝色素粗制剂的光稳定特性

将本发明得到的蓝色素配制成0.25mg/mL乙醇溶液，密闭分装于玻璃试管中，置于自然光下照射1-9天，分别测定579nm下的吸光值，计算色素残余量。结果参见附图3所示。

由附图3所示可以看出，本发明蓝色素的乙醇溶液在自然光下放置2d后仍有80％以上残余量，表现出一定的光稳定性，但放置3d后急剧下跌，5d后仅有25.1％的残余量。

实施例10：pH对蓝色素粗制剂的影响

将本发明得到的蓝色素配制成0.25mg/mL水溶液，各吸取10ml置于不同试管中，分别利用HCl、NaOH调至不同pH的色素水溶液，室温避光放置2h后，于579nm测定其吸光值，计算残余率；同时进行500-700nm波长扫描观察色素最大吸收峰的变化，结果见表3。由表3可以看到本发明的蓝色素在pH2.2-9.3下保持相对稳定，在pH 12.1时色素损失极大，达到67％；色素最大吸收波长随着pH的增加而增加，由pH 2.2的569到pH 12.1的604，颜色也随之略有改变。

表3pH对色素的影响

实施例11：金属离子对蓝色素粗制剂的影响

将本发明得到的蓝色素提取物配制成0.25mg/mL水溶液，分别取5mL上述溶液与0.01mol/L和1mol/L的不同金属离子溶液等体积混合并混匀，室温黑暗密闭放置1d后，于579nm下测定其吸光值，计算色素残余量，结果参见附图4。

由附图4所示可以看出0.01mol/L的金属离子对本发明蓝色素影响不大，损失都小于5％。但1mol/L的Ca²⁺、Al³⁺、Pb²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺对对本发明蓝色素的影响较大，尤其是Al³⁺影响最大，损失高达70％。

Claims

1.一种产生蓝色素的黄杆菌(Flavobacterium sp.B29)CGMCC No.3699。

2.如权利要求1所述的黄杆菌(Flavobacterium sp.B29)CGMCC No.3699发酵提取制备蓝色素粗制剂的方法，其特征在于，所述的提取制备蓝色素粗制剂的方法，将增殖培养的黄杆菌(Flavobacterium sp.B29)CGMCC No.3699培养物接种于液体PDA培养基中，25℃、200rpm恒温培养12-24小时，以2-10％的接种量接种于PDA培养基，发酵培养48小时；离心收集发酵培养物中的菌体，以有机试剂作为萃取剂，萃取物经浓缩干燥后获得蓝色素粗制剂，即为蓝色素粗提物。

3.如权利要求2所述的黄杆菌(Flavobacterium sp.B29)CGMCC No.3699发酵提取制备蓝色素粗制剂的方法，其特征在于，所述的有机试剂作为萃取剂中，将50％的乙醇溶液作为萃取剂。

4.如权利要求1所述的黄杆菌(Flavobacterium sp.B29)CGMCC No.3699按照权利要求2所述的发酵提取方法制备获得的蓝色素粗制剂。

5.如权利要求4所述的黄杆菌(Flavobacterium sp.B29)CGMCC No.3699发酵提取制备获得的蓝色素粗制剂，其特征在于，所述的蓝色素粗制剂在579nm处有一最大吸收峰；具有一定的抗氧化功能；在pH 2.2～9.0范围内较为稳定；具有较好的热稳定性和光稳定性；低浓度Ca²⁺、Al³⁺、Pb²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺离子对色素稳定性影响较小，高浓度时影响较大。