CN107058148B - 一种植物乳杆菌菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种植物乳杆菌，涉及微生物领域，其为植物乳杆菌JJZ21(L.plantarum subsp.plantarum JJZ21)，于2016年9月9日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC M 2016471，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，其通过茶叶籽仁水浆发酵获得。本发明提供的植物乳杆菌可以用于生产植物油或生产茶皂素的用途。

Description

一种植物乳杆菌菌株及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种植物乳杆菌菌株(Lactobacillusplantarum subsp.plantarum JJZ21)。

背景技术

茶叶籽油是以茶叶树(Camellia sinensis)的种子为原料生产的食用油，因其富含多种生物活性成分而被誉为东方橄榄油。目前有正式报道的茶叶籽油生产方法主要有冷压榨法、热压榨法、水酶法、一般溶剂浸出法及二氧化碳超临界萃取法，这些茶叶籽油生产工艺均存在一些难以克服的问题。为寻求解决问题的途经，姜金仲不久前报道了一种茶叶籽油生产新工艺——茶叶籽油生物发酵生产工艺，该工艺的核心是通过生物发酵将茶叶籽水浆分为上、中、下三层，然后取出上层加热生产茶叶籽油。该工艺具有生产成本低、产量高、油品质高、茶叶籽油风味浓等优点。

既然生物发酵分层属于发酵范畴，其发生过程必然需要快速有效的发酵微生物。然而，茶叶籽水浆中含有大量的茶皂素，茶皂素对于大多数微生物具有抑制作用，因此，大多数微生物很难在茶叶籽水浆中繁殖生长，因此，找到一种在茶叶籽水浆中快速繁殖生长的微生物较为困难，目前还没有涉及茶叶籽中微生物存在的报道。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本申请在经过大量、反复的发酵、提纯、鉴定试验后，发现了一种可用于茶叶籽水浆发酵，而且还能生产植物油、茶皂素等产品的植物乳杆菌。

为了实现本发明的目的，本发明首先提供一种植物乳杆菌，即植物乳杆菌JJZ21(L.plantarum subsp.plantarum JJZ21)，于2016年9月9日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC M 2016471，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山。茶叶籽油可以通过发酵的方法获得，因此，在进行茶叶籽油生产过程中必然存在发酵微生物。然而由于茶叶籽水浆中含有大量的不利于大多数微生物生长的茶皂素成分，导致茶叶籽中的微生物难以生存，因此，在茶叶籽水浆中找到一种可以快速繁殖生长的微生物较为困难。

本申请的发明人基于大量反复的发酵试验，以期得到从发酵液中发现微生物，最后在发明人不懈的努力下，获得了微生物群落，经发明人对微生物进行提纯、鉴定试验后，反复确认，才得以获得本发明的植物乳杆菌JJZ21(L.plantarum subsp.plantarum JJZ21)。

特别是，所述植物乳杆菌是通过茶叶籽的水浆发酵获得。

具体的，所述通过茶叶籽的水浆发酵获得包括以下步骤：

将茶叶籽仁与水混合，进行打浆处理，过滤后，得到茶叶籽仁浆液；

将茶叶籽仁浆液在恒温条件下发酵，5h后得到发酵菌液；

蘸取发酵液进行培养、观察与鉴定，得到植物乳杆菌JJZ21。

其中，所述将茶叶籽仁与水混合，进行打浆处理，过滤后，得到茶叶籽仁浆液包括：

向茶叶籽仁中加入充足的水，于20℃条件下浸泡16h，将浸泡过的茶叶籽清洗后加水进行2轮打浆，过滤得滤液，得到茶叶籽仁浆液。

其中，所述恒温条件是35℃。

其中，所述蘸取发酵液进行培养、观察与鉴定，得到植物乳杆菌JJZ21包括：

使用接菌环蘸取发酵液中的中层液体并于MRS平板上涂布培养，培养温度为25℃，长出菌落后，挑选独立的菌落，用接种针挑取样本放在载玻片上，用美蓝染色镜检，鉴定杆菌特征；重复上述步骤，直到获得具有杆菌特征的菌落样本，然后接种扩大繁殖该菌落，再行鉴定繁殖，反复多次，使最终平板上为同一形态菌落为止，挑取单菌落接菌于MRS斜面培养基上，25℃培养48h，经形态学观察、生理学生化特征鉴定及16SrDNA、pheS基因序列测定分析、最终鉴定为植物乳杆菌(L.plantarum subsp.plantarum JJZ21)。

尤其是，所述植物乳杆菌具有使油料植物种子的水浆发酵产生植物油。

其中，所述植物种子可以是茶叶籽、油茶籽、野山茶籽、无患子、小桐子、黄连木种子、棉籽等。

其中，所述茶叶籽是指用于茶叶生产的、所有茶树(Camellia sinensis)种及品种的种子，油茶籽是指所有人工栽培的、用于食用油生产的油茶树(Camellia oleifera)种子，野生山茶籽是指野生的、可以用于食用油生产的、油茶属(Camellia)树种的种子。

优选的，所述植物种子是茶叶籽。

优选的，所述植物种子为油茶籽。

优选的，所述植物种子为野生山茶籽。

特别是，所述植物乳杆菌具有分离茶皂素的作用。

其中，所述植物种子为茶叶籽或油茶籽。

其中，所述茶皂素为茶叶籽皂素或油茶籽皂素。

特别是，本发明的植物乳杆菌还具有以下特征：

①其对数生长期为接种后的1-6h，之后进入稳定生长期。

②其最适合发酵温度为30-35℃，能在40℃条件下发酵植物种子产生植物油，能在35℃条件下发酵分离茶皂素，适合生长温度为25-40℃。

③其最适发酵pH值为3.8-6.8，适合生长的pH值范围是4.5-5.2。

④该菌株最显著的特点是能在高浓度茶皂素溶液中繁殖生长，并进行乳酸发酵。

⑤该菌的最适宜保存条件为：MRS斜面培养基，4℃条件下保存，每20天转接一次。

为实现本发明的目的，本发明还提供一种将上述植物乳杆菌用于生产植物油的用途。

其中，将植物乳杆菌用于生产植物油用途是通过以下步骤实现的：

将植物种子依次进行浸泡、打浆和过滤处理后，得到滤液；

向滤液中分别放入茶叶籽酵母及植物乳杆菌菌种；

对加入混合菌的滤液在恒温条件下发酵，得到植物油毛油；

对毛油简单精炼后，得到可食用的植物油。

其中，所述浸泡温度为35℃，浸泡时间为12-20h。

其中，所述茶叶籽酵母的接种量为：茶叶籽酵母干粉/滤液：1-5g/L

其中，所述植物乳杆菌的接种量为：菌种在MRS液体培养基中活化3代，按麦氏比浊法调菌浓度为3.0×109CFU/ml后，按发酵液的2％进行接种。

其中，所述恒温条件为35-40℃。

其中，所述发酵时间为12-20h。

为实现本发明的目的，本发明再提供一种将上述的植物乳杆菌用于生产茶皂素的用途。

其中，将植物乳杆菌用于生产植物油用途是通过以下步骤实现的：

将植物种子依次进行浸泡、打浆和过滤处理后，得到滤液；

沉淀所述滤液，然后放入茶叶籽酵母，进行第一发酵处理，得到上层漂浮物；

向所述上层漂浮物中加入植物乳杆菌进行第二发酵处理，取出下层沉淀进行纯化处理，得到茶皂素。

其中，所述浸泡温度为35℃，浸泡时间为12-20h。

其中，所述沉淀时间为2.5h。

其中，所述滤液与茶叶籽酵母的比例为：茶叶籽酵母干粉/滤液：1-5g/L。

其中，所述植物乳杆菌的接种量为：菌种在MRS液体培养基中活化3代，按麦氏比浊法调菌浓度为3.0×109CFU/ml后，按发酵液的2％进行接种。

其中，所述第一发酵处理温度为35℃，发酵时间为5h。

其中，所述第二发酵处理温度为25℃，发酵时间为72h。

使用本发明的植物乳杆菌生产茶皂素，其产率达1.6％以上，纯度达90％以上。

本发明所述的打浆处理均为两轮打浆处理，其打浆处理方法采用现有的常规技术进行。有益效果：

1、本发明提供植物乳杆菌可以使植物种子的浆液发酵产生植物油，其出油率达到16-20％(茶叶籽油)，相较于传统的植物油(茶叶籽油)生产方法，使用本发明的植物乳杆菌可以提高出油效率、降低出油成本、适用于大规模的生产。

2、本发明提供的植物乳杆菌可以分离茶叶籽或油茶籽中的茶皂素，分离工艺具有低温特点，分离的茶皂素最大限度地保留了天然活性，纯度达90％以上，相对于现有的提取方法，利用本发明的植物乳杆菌，得到的茶皂素使用价值更高，拓展了茶皂素的高档用途。

附图说明

图1为植物乳杆菌JJZ21菌落形态；

图2为植物乳杆菌JJZ21个体特征及出芽情况；

图3为以16SrDNA序列为基础的植物乳杆菌系统发育树；

图4为以pheS基因序列为基础的植物乳杆菌系统发育树。

菌种保存

本发明菌种命名为植物乳杆菌JJZ21，其拉丁文名称为：Lactobacillusplantarum subsp.plantarum JJZ21，于2016年9月9日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC M 2016471，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合附图和具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述。

在下面的描述中阐述了很多具体的细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用其他不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明并不限于下面公开的具体实施例的限制。

实施例1：菌株的筛选和保藏

本发明的植物乳杆菌JJZ21(或L.plantarum subsp.plantarum JJZ21)是从贵州省贵阳市乌当区高新路115号贵州师范学院“贵州特色生物资源开发利用重点实验室”自制茶叶籽水浆发酵液中分离筛选获得，具体分离鉴定步骤如下：

1、菌株的获得

称取茶叶籽仁100g，加充足的水于25℃条件下浸泡16h，将浸泡好的茶叶籽清洗后加水进行2轮打浆、过滤得滤液(即茶叶籽水浆)，把滤液置于35℃恒温发酵，5h以后，使用接菌环蘸取发酵液并于MRS平板上涂布培养(25℃)，长出菌落后，挑选独立的菌落，用接种针挑取样本放在载玻片上，用美蓝染色，观察是否是杆菌，如果是杆菌；接种扩大繁殖该菌落，再行鉴定繁殖，反复4次，使最终平板上为同一形态菌落为止。挑取单菌落接菌于MRS斜面培养基上25℃培养48h，以备保藏和鉴定使用。

2、菌株的形态观察

如图1和图2所示的本发明的植物乳杆菌JJZ21：菌落呈圆形，白色，凸起，表面光滑湿润，边缘整齐。植物乳杆菌JJZ21菌株25℃培养48h的个体形态如附图2：菌体呈杆状，大小0.5-0.7μm×0.8-1.7μm，单个或成对排列，革兰氏阳性。

3、菌株的生理生化特征测试

测试参考《伯杰氏细菌鉴定手册》进行，对植物乳杆菌JJZ21菌株的生理生化特征进行测试，测试结果如表1所示，根据表1的检测结果可知，JJZ21菌株对大多数的芳胺酶及糖苷酶均呈阴性，对大多数的D型糖类碳源均呈阳性。上述试验由“中国食品发酵工业研究院微生物检测中心”完成。

表1：JJZ21菌株的生理生化特征

注：生理生化特征表中：(“+”表示阳性；“-”表示阴性)。

4、菌株的16SrDNA及pheS基因序列测定及分析

JJZ21菌株的16SrDNA及pheS基因的序列测定结果如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。JJZ21菌株的16SrDNA序列全长为1417bp，pheS基因序列全长为410bp。利用Blest进行序列同源检索，相似度达到98％以上的植物乳杆菌(Lactobacillus)近缘种有10种如表2所示，其中与L.plantarum subsp.plantarum的相似度达到了100％。以16SrDNA及pheS基因序列的同源性为基础，用MEGA5.0软件进行系统进化分析，结果得到了如图3及图4所示的系统发育树。图3所示的系统发育学分析结果表明，该系统树中L.plantarum subsp.plan-tarumATCC 14917T(ACGZ01000098)是一个单独的外群种，JJZ21菌株与该种单独构成一个分支；二者序列的相似性最大，遗传距离最小；但可靠性只有66％，不足以给出结论；但图4的分析结果表明：JJZ21菌株仍然与L.plantarum subsp.Plantarum相似性最大，遗传距离最小，且可靠性达到了100％；综合两种分析结果，可以得出结论：JJZ21菌株与L.plantarumsubsp.Plantarum的亲缘关系最近。

表2：JJZ21菌株的16SrDNA及pheS基因序列与近缘种同源性比较结果

综合上述形态观察、碳源反应、酶学反应、16SrDNA及pheS基因序列比对、以及系统发育树的构建与分析，中国食品发酵工业研究院微生物检测中心将JJZ21菌株鉴定为：L.plantarum subsp.plantarum，结合我们的研究编号：JJZ21菌株，因此将该菌株定义为：L.plantarum subsp.plantarum JJZ21。将植物乳杆菌JJZ21(L.plantarumsubsp.plantarum JJZ21)于2016年9月9日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC M 2016471，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山。

实施例2：植物乳杆菌JJZ21应用于植物油的生产

称取油茶籽仁1000g，加充足的水于35℃条件下浸泡16h，将浸泡好的油茶籽仁清洗后加水(茶叶籽：水＝1:3)进行2轮打浆、过滤得滤液，按照一定比例(茶叶籽酵母干粉/滤液：1-5g/L)向滤液中加入茶叶籽酵母(Meyerozyma caribbica JJZ11，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC M 2016470；中国典型培养物保藏中心及本实验室可以提供菌种。)及植物乳杆菌JJZ21(菌种在MRS液体培养基中活化3代，按麦氏比浊法调菌浓度为3.0×109CFU/ml后，按发酵液的2％的量进行接种)，搅拌均匀，放入容器置于40℃恒温发酵16h后，滤液会出现坚实的白色顶层，捞出白色顶层加热，即可生产出油茶籽毛油，经简单精炼后，可得到油茶籽成品油，其中精炼方法可参照现有技术进行，经计算，其产油率达30％以上。

将同样的方法、同样的操作条件应用于茶叶籽，同样可以获得茶叶籽油，其产油率达18-20％。

参照油茶籽油国家标准GB11765-2003的食用油质量检测标准对本发明获得的植物油进行检测，检测结果如表3所示。

表3植物油质量检测结果

根据表3所示的检测数据可知，本申请的油茶籽油红色仅为0.2，黄色仅为22，茶叶籽油红色仅为0.5，黄色仅为20，可见其色泽均小于国家一级油的标准(即红2.0，黄35)；而且利用本发明的乳杆菌获得的油茶籽油和茶叶籽油的均无异味、只有油茶籽或茶叶籽油特有的香味、均为澄清透明状态，且水分及挥发物均小于国家一级标准的0.05％、不溶性杂质均小于国家一级标准的0.05％，酸值均远小于国家一级标准的1.0mgKOH/g，过氧化值均远小于国家一级标准的6.0mol/kg，对油茶籽油或茶叶籽油进行280℃加热试验，均无析出物，黄色不变，红色增加小于0.4，含皂量小于0.03％，烟点大于280℃，无溶剂残留。可见，利用本申请的乳杆菌均可以获得一级标准的油茶籽油或茶叶籽油。

实施例4：植物乳杆菌JJZ21用于生产茶皂素。

以茶叶籽皂素为例。称取茶叶籽仁1000g，加充足的水于30℃条件下浸泡16h，将浸泡好的油茶籽清洗后加水(茶叶籽：水＝1:3)进行2轮打浆、过滤得滤液，滤液沉淀2.5h，去除沉淀，按照一定比例(茶叶籽酵母干粉/滤液：1-5g/L)向滤液中加入茶叶籽酵母(Meyerozyma caribbica JJZ11，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCCM 2016470；中国典型培养物保藏中心及本实验室可以提供菌种)，搅拌均匀，放入容器置于35℃恒温发酵5h后，取出上层漂浮物。然后按照一定比例向发酵液中加入植物乳杆菌JJZ21(菌种在MRS液体培养基中活化3代，按麦氏比浊法调菌浓度为3.0×109CFU/ml后，按发酵液的2％的量进行接种)，搅拌均匀，放入容器置于35℃恒温发酵72h后，倒掉上清液，取出下层沉淀，将沉淀溶解在80％的乙醇中，过滤，浓缩滤液回收乙醇，将浓缩液放入烘箱，60℃烘干，可得到纯度为90％以上的茶叶籽皂素，其产率达1.6％。

将同样的方法、同样的操作条件应用于油茶籽，同样可以获得油茶籽皂素，其产率达3％。

利用本发明的植物乳杆菌制备茶皂素的方法获得的茶皂素是低温天然的茶皂素，与目前市售茶皂素的最大不同点是其水溶液为淡黄色，而不是市售产品的黑褐色；且发泡能力及去污能力远高于目前市售产品(具体比较如下表)；因此，拓宽了茶叶籽皂素的高档用途。

表：本专利茶皂素与市售茶皂素对比

以上所述实施方式及应用领域仅为本发明的优选实施例，而并非本发明可行实施的穷举。对于本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理和精神的前提下对其所做出的任何显而易见的改动及应用领域的拓广，都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。

<110>贵州师范学院

<120>一种植物乳杆菌菌株及其应用

<160> 1

<170>PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1417

<212> DNA

<213> 植物乳杆菌JJZ21（Lactobacillus plantarum subsp. plantarum JJZ21）

tgcagtcgaa cgaactctgg tattgattgg tgcttgcatc atgatttaca tttgagtgag 60

tggcgaactg gtgagtaaca cgtgggaaac ctgcccagaa gcgggggata acacctggaa 120

acagatgcta ataccgcata acaacttgga ccgcatggtc cgagcttgaa agatggcttc 180

ggctatcact tttggatggt cccgcggcgt attagctaga tggtggggta acggctcacc 240

atggcaatga tacgtagccg acctgagagg gtaatcggcc acattgggac tgagacacgg 300

cccaaactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccac aatggacgaa agtctgatgg 360

agcaacgccg cgtgagtgaa gaagggtttc ggctcgtaaa actctgttgt taaagaagaa 420

catatctgag agtaactgtt caggtattga cggtatttaa ccagaaagcc acggctaact 480

acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt gtccggattt attgggcgta 540

aagcgagcgc aggcggtttt ttaagtctga tgtgaaagcc ttcggctcaa ccgaagaagt 600

gcatcggaaa ctgggaaact tgagtgcaga agaggacagt ggaactccat gtgtagcggt 660

gaaatgcgta gatatatgga agaacaccag tggcgaaggc ggctgtctgg tctgtaactg 720

acgctgaggc tcgaaagtat gggtagcaaa caggattaga taccctggta gtccataccg 780

taaacgatga atgctaagtg ttggagggtt tccgcccttc agtgctgcag ctaacgcatt 840

aagcattccg cctggggagt acggccgcaa ggctgaaact caaaggaatt gacgggggcc 900

cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagctacg cgaagaacct taccaggtct 960

tgacatacta tgcaaatcta agagattaga cgttcccttc ggggacatgg atacaggtgg 1020

tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa 1080

cccttattat cagttgccag cattaagttg ggcactctgg tgagactgcc ggtgacaaac 1140

cggaggaagg tggggatgac gtcaaatcat catgcccctt atgacctggg ctacacacgt 1200

gctacaatgg atggtacaac gagttgcgaa ctcgcgagag taagctaatc tcttaaagcc 1260

attctcagtt cggattgtag gctgcaactc gcctacatga agtcggaatc gctagtaatc 1320

gcggatcagc atgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc 1380

atgagagttt gtaacaccca aagtcggtgg ggtaacc 1417

<210> 2

<211> 410

<212> DNA

<213> 植物乳杆菌JJZ21（Lactobacillus plantarum subsp. plantarum JJZ21）

cgtgatatgc aagacacgtt ctatattacc aaagacgtgc tactacgcac gcagacgtct 60

gctgatcagc cgcggtcact tgaaaatcac gatttttcta aaggaccgct gaaggtcttg 120

tcacctggcc gcgtttatcg gcgtgatacg gatgatgcaa cccattccca tcaatttcat 180

caaattgaag ggttagtcgt ggacaagcat attacgatgg ctgatttgaa gggcacctta 240

attctggttg ccaagacttt gtttggcgat caattcgatg ttcggctacg gccaagcttc 300

tttccattca cggaaccatc cgtagaagct gatgtaactt gctttaattg caatggcaag 360

ggctgtgcaa tctgtaagca aacgggttgg atcgaagtac tgggagcagg 410

Claims (10)

1.一种植物乳杆菌，其特征在于，其为植物乳杆菌JJZ21(L.plantarum subsp.plantarumJJZ21)，于2016年9月9日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCCM2016471，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山。

2.如权利要求1所述的植物乳杆菌，其特征在于，其通过茶叶籽仁水浆发酵获得。

3.如权利要求2所述的植物乳杆菌，其特征在于，所述通过茶叶籽仁水浆发酵获得包括：

将茶叶籽仁与水混合，进行打浆处理，过滤后，得到茶叶籽仁浆液；

将茶叶籽仁浆液在恒温条件下发酵，5h后得到发酵菌液；

蘸取发酵液进行培养、观察与鉴定，得到植物乳杆菌JJZ21。

4.如权利要求1所述的植物乳杆菌，其特征在于，其适合发酵温度为30-40℃，其最适发酵pH值为3.8-6.8。

5.如权利要求1所述的植物乳杆菌，其特征在于，其保存条件为MRS斜面培养基，4℃条件下保存，每20天转接一次。

6.如权利要求1所述的植物乳杆菌，其特征在于，其具有使油料植物种子水浆通过发酵分层生产植物油的作用。

7.如权利要求1所述的植物乳杆菌，其特征在于，其具有分离茶皂素的作用。

8.一种将权利要求1所述的植物乳杆菌用于生产植物油的用途。

9.一种将权利要求1所述的植物乳杆菌用于生产茶皂素的用途。

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，将植物乳杆菌用于生产茶皂素，茶皂素的纯度为90％以上。

Images