CN101186633B

CN101186633B - 糙海参中皂苷类抗真菌化合物及其制备方法

Info

Publication number: CN101186633B
Application number: CN2007100473310A
Authority: CN
Inventors: 易杨华; 韩华; 李玲; 刘宝姝
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2007-10-23
Filing date: 2007-10-23
Publication date: 2010-12-15
Anticipated expiration: 2027-10-23
Also published as: CN101186633A

Abstract

本发明涉及医药技术领域，具体为从糙海参中分离的2种皂苷类抗真菌化合物scabraside A和scabraside B，分子式分别为：C₅₄H₈₅O₂₆SNa；C₅₄H₈₅O₂₇SNa。经多种现代光谱分析，特别是综合应用多种先进的二维核磁共振波谱的解析，确定了这些化合物的化学结构和立体构型。体外抗真菌试验表明，这些化合物对白色念珠菌和烟曲霉菌等多种菌株有明显的抑制作用。因此可用于制备抗真菌药物。本发明为研制新的抗真菌药物提供先导化合物，对开发利用海洋药用生物资源具有重要价值。

Description

糙海参中皂苷类抗真菌化合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及医药技术领域，是从海洋动物糙海参中分离到的皂苷类抗真菌化合物scabraside A和scabraside B及其制备方法。

背景技术

糙海参(Holothuria scabra Jaeger)是一种大量生长于我国广东中西部、广西东兴到海南岛海域的海参纲动物，属海参科海参属。体长一般30-40cm，直径8-10cm，体壁厚，骨片丰富，边缘平滑。糙海参是重要的食用海参之一，它体大肉厚，品质极佳。因肉质白而透明，又称明玉参、白参或沙参。药用价值极高，是滋补珍品〔廖玉麟编著，中国动物志，棘皮动物门，海参纲[M].北京：科学出版社，1997，116-117〕。但未见有关从糙海参中提取分离到皂苷类化合物scabraside A和scabraside B及其抗真菌活性的报道。

发明内容

本发明从生长于中国南海海域的糙海参中提取分离到2种新的皂苷类化合物，分别命名为scabrasideA，scabraside B，它们的化学结构通式如下：

本发明化合物的制备方法如下：

(1)制备总皂苷提取物：将糙海参干品粉碎，用体积含量比为55％～60％乙醇热回流提取，浓缩提取液，得到流浸膏。将流浸膏溶于水中过滤，将滤液通过大孔树脂柱HP60，然后依次用水、体积含量比为50％和70％乙醇洗脱，收集体积含量比为50％和70％乙醇洗脱液，减压回收乙醇，得到总皂苷提取物。

(2)分离提纯：将上述总皂苷提取物进行硅胶柱层析，以体积比为氯仿∶甲醇∶水＝8～6.5∶2～3.5∶1混合溶剂洗脱，薄层层析检测，收集含有皂苷的流分，再经过C₁₈反相柱层析，以体积比为甲醇∶水＝57～62∶43～38梯度洗脱，薄层层析检测，分别收集含scabraside A和scabraside B的洗脱液，浓缩至干，分别得到scabraside A和scabraside B纯品。经多种现代光谱分析，特别是综合应用多种先进的二维核磁共振波谱的解析，确定了scabraside A和scabraside B的化学结构和立体构型。

1.scabraside A：白色结晶性粉末，熔点234～236℃(MeOH-H₂O)，分子式C₅₄H₈₅O₂₆SNa；

Liebermann-Burchard反应和Molish反应均呈阳性。电喷雾阳离子质谱ESI-MS⁺m/z：1227[M+Na]⁺；电喷雾阴离子质谱ESI-MS^-m/z：1181[M-Na]^-；高分辨质谱HRESI-MS⁺中准分子离子峰提供的精确分子量m/z：1227.4856[M+Na]⁺(Calc.Mass 1227.4845)。IR(KBr)cm^-1：3421(羟基)，1761(羰基)，1653(双键)，1256，1073(磺酸基)。¹³C NMR与¹H NMR数据见表1。以三氟醋酸水解皂苷后得到组成皂苷糖链的单糖，将其制备成糖腈乙酸酯衍生物，进行气相色谱-质谱联用分析，经与标准糖的糖腈乙酸酯衍生物对照，确定scabraside A的糖链由D-木糖、D-奎诺糖、D-葡萄糖、3-甲氧基-D-葡萄糖组成，比例为1∶1∶1∶1。

2.scabraside B：白色结晶性粉末，熔点236～238℃(MeOH-H₂O)，分子式C₅₄H₈₅O₂₇SNa；

Liebermann-Burchard反应和Molish反应均呈阳性。电喷雾阳离子质谱ESI-MS⁺m/z：1243[M+Na]⁺；电喷雾阴离子质谱ESI-MS^-m/z：1141[M-Na]^-；高分辨质谱HRESI-MS⁺中准分子离子峰提供的精确分子量m/z：1243.4792[M+Na]⁺(Calc.Mass 1243.4794)。IR(KBr)cm^-1：3407(羟基)，1718、1775(羰基)，1631(双键)，1266，1074(磺酸基)。¹³C NMR与¹H NMR数据见表2。以三氟醋酸水解皂苷后得到组成皂苷糖链的单糖，将其制备成糖腈乙酸酯衍生物，进行气相色谱-质谱联用分析，经与标准糖的糖腈乙酸酯衍生物对照，确定scabraside B的糖链由D-木糖、D-奎诺糖、D-葡萄糖、3-甲氧基-D-葡萄糖组成，比例为1∶1∶1∶1。

表1.scabraside A苷元和糖链部分的¹³C NMR与¹H NMR数据

Xyl：木糖；Glc：葡萄糖；Qui：奎诺糖；J：偶合常数

表2.scabraside B苷元和糖链部分的¹³C NMR与¹H NMR数据

Xyl：木糖；Glc：葡萄糖；Qui：奎诺糖；J：偶合常数

本发明化合物scabraside A和scabraside B经体外抗真菌活性试验，表明这些化合物有明显的抑制真菌的效果。试验所用的菌株为国际通用的菌株，即：

白色念珠菌(Candida albicans)

新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)

热带念珠菌(Candida pseudotropicalis)

红色毛藓菌(Trichophyton rubrum)

紧密着色真菌(Fonsecaea compacta)

烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)

石膏状小孢子菌(Microsporum gypseum)

试验方法为国际通用的酵母菌的液体培养基稀释法：以氟康唑、伊曲康唑和特比奈芬作为阳性对照，根据试验方法将各菌种活化两次，本发明化合物样品分别用二甲基亚砜(DMSO)配成25.6mg/ml的溶液，-20℃保存，实验前，将药液取出置35℃温箱融化备用。取无菌96孔板作为药敏板，于每排1号加RPMI 1640 100μl作空白对照；3～12号孔各加新鲜配制的菌液100μl；2号孔分别加菌液200μl和本发明化合物溶液2μl。2～11号孔10级倍比稀释，使各孔中的最终药物浓度分别为64，32，16，8，4，2，1，0.5，0.25和0.125μg/ml，各孔中DMSO含量均低于1％；12号不含药物，作阴性对照。各药敏板于35℃培养24h和72h，用酶标分析仪于620nm测各孔OD值。上述实验平行操作2次至3次，当MIC₈₀值能准确重复或只差一个浓度时才被接受，并以较高浓度作为MIC₈₀值。结果见表3和表4。

表3.scabraside A对菌株的抑制作用(MIC₈₀：μg/ml)

MIC₈₀：真菌生长80％被抑制时的样品浓度

表4.scabraside B对菌株的抑制作用(MIC₈₀：μg/ml)

MIC₈₀：真菌生长80％被抑制时的样品浓度

从表3和表4可见，scabraside A和scabraside B对各种菌株的有效抑制浓度(MIC₈₀)为2，4，8，16，32μg/ml，通常MIC₈₀＜64μg/ml浓度为有效。上述试验结果表明，scabrasideA和scabraside B对多种不同的菌株均有明显的抑制作用。因而可用于制备抗真菌药物。

本发明为研制新的抗真菌药物提供了新的先导化合物，对开发利用海洋药用生物资源具有重要意义。

具体实施方式：

实施例1：制备scabraside A和scabraside B

取生长于中国海南南海海域的糙海参干品3000克，粉碎后分别用2倍重量55％～60％的乙醇依次热回流提取5次，每次提取1小时。合并乙醇提取液，减压回收乙醇，得流浸膏。将流浸膏溶于3倍重量的水中，过滤，滤液通过日本三菱公司的大孔树脂柱HP60，依次用水、50％和70％乙醇各5000ml洗脱。收集50％和70％7醇洗脱液，减压回收溶剂至干，得到总皂苷70克。

将总皂苷进行硅胶柱层析，以氯仿∶甲醇∶水＝8∶2∶1混合溶剂(下层)约1500ml洗脱，收集含有皂苷的部分，再进行C₁₈反相柱层析，以甲醇∶水＝57～62∶43～38进行梯度洗脱，薄层层析检测，分别收集含有scabrasideA和scabraside B的流分，回收溶剂至近干，70℃水浴蒸干，分别得到scabraside A 0.107克和scabraside B 0.19克。

实施例2：scabraside A和scabraside B的制备

取生长于中国海南南海海域的糙海参干品2000克，粉碎后按实施例1所述的方法进行提取，得总皂苷41克。将总皂苷进行硅胶柱层析，以氯仿∶甲醇∶水＝6.5∶3.5∶1(下层)约1000ml洗脱，收集含有皂苷的部分，再进行C18反相柱层析，以59％的甲醇/水洗脱，分别收集含有scabraside A和scabraside B的流分，减压回收至干，得到scabraside A0.066克和scabraside B 0.12克。

Claims

1.一种糙海参中皂苷类抗真菌化合物，其特征在于化学结构通式如下：

2.权利要求1所述皂苷类抗真菌化合物的制备方法，步骤如下：

(1)制备总皂苷提取物：将糙海参干品粉碎，按常规用体积含量比为55％～60％乙醇热回流提取，浓缩提取液，得到流浸膏；将流浸膏溶于水中过滤，将滤液通过大孔树脂柱HP60，依次用水、体积含量比为50％和70％乙醇洗脱，收集体积含量比为50％和70％乙醇洗脱液，减压回收乙醇，得到总皂苷提取物；

(2)分离提纯：将上述总皂苷提取物进行硅胶柱层析，以体积比为氯仿∶甲醇∶水＝8～6.5∶2～3.5∶1混合溶剂洗脱，薄层层析检测，收集含有皂苷的流分，再经过C₁₈反相柱层析，以体积比为甲醇∶水＝57～62∶43～38进行梯度洗脱，薄层层析检测，分别收集含有scabraside A和scabraside B的流分，回收溶剂至干，分别得到scabraside A和scabraside B纯品。

3.权利要求1所述化合物scabraside A和scabraside B在制备抗真菌药物中的应用。