CN101613416B - 花刺参中皂苷类抗真菌化合物Variegatuside F～I - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药技术领域，是从海洋动物花刺参中分离得到的4个新的皂苷类抗真菌化合物Variegatuside F、G、H、I。化学结构通式如下：

其中，各化合物的R₁、R₂、R₃、R₄基团搭配分别为：

Description

花刺参中皂苷类抗真菌化合物Variegatuside F～I

技术领域

本发明涉及医药技术领域，是从海洋动物花刺参中分离得到的4个新的皂苷类抗真菌化合物Variegatuside F、G、H、I。

背景技术

花刺参(Stichopus variegatus Semper)是一种广泛生长于我国广东、广西和海南沿海的海参纲动物，属刺参科刺参属。体形较大，体长一般20cm，最大可达90cm体稍呈方柱状。花刺参是重要的食用海参之一，民间也常做药用，中医主要用于治疗肾阳虚损、水湿停聚者(廖玉麟编著.中国动物志，棘皮动物门，海参纲.北京：科学出版社，1997，115)。但至今未见有关从花刺参中分离得到皂苷类抗真菌化合物Variegatuside F、G、H、I的报道。

发明内容

本发明提供一种从生长在海南三亚海域的花刺参中分离得到的新的皂苷类抗真菌化合物，分别命名为Variegatuside F，VariegatusideG，Variegatuside H，Variegatuside I，它们的化学结构通式如下：

其中，各化合物的R₂、R₂、R₃、R₄基团搭配分别为：

R₁    R₂    R₃    R₄

Variegatuside F  CH₂OH  H     OH

Variegatuside G  CH₂OH  H     OH

Variegatuside H  CH₂OH  CH₂OH OCH₃

Variegatuside I  H      H     OCH₃

本发明化合物的制备方法如下：

(1)制备粗总皂苷提取物：将花刺参干品粉碎，按常规用75％乙醇水溶液加热提取，减压回收乙醇液，得流浸膏，将流浸膏分散在于水中，依次用石油醚、水饱和正丁醇分别萃取，减压浓缩正丁醇液至干，得到粗总皂苷提取物；

(2)分离提纯：按常规将上述粗总皂苷提取物进行硅胶柱层析，以体积比为氯仿∶甲醇∶水＝8～6∶2～4∶1的混合溶剂洗脱，薄层层析检测，收集含有皂苷的流份，再经过ODS反相柱层析，以体积比为甲醇∶水＝5～10∶5～0梯度洗脱，薄层层析检测，分别得到化合物Variegatuside F～I。

经多种现代光谱分析，特别是综合应用多种先进的二维核磁共振波谱解析，确定了上述4种化合物的化学结构和立体构型。

1.Variegatuside F为白色结晶性粉末。m.p.214～215℃(MeOH-H₂O)，Liebermann-Burchard和Molish反应阳性。IR(KBr，cm^-1)：3422(OH)，1760(C＝O)，1635(C＝C)等主要吸收峰。电喷雾-飞行时间-正离子质谱ESI-MS⁺中的准分子离子峰m/z：1461[M+Na]⁺；负离子质谱ESI-MS^-中的分子离子峰m/z：1437[M-H]^-。¹³C NMR与¹H NMR数据见表1和表2。以三氟乙酸水解皂苷后得到组成皂苷糖链的单糖，将所得单糖制成糖腈乙酸酯衍生物，用GC-MS进行分析，通过对照标准糖的糖腈乙酸酯，确定variegatusideF糖链由木糖、葡萄糖、3-O-甲基葡萄糖，比例为2∶3∶1。

2.Variegatuside G为白色结晶性粉末。m.p.214～216℃(MeOH-H₂O)，Liebermann-Burchard和Molish反应阳性。IR(KBr，cm^-1)：3422(OH)，1760(C＝O)，1635(C＝C)等主要吸收峰。电喷雾-飞行时间-正离子质谱ESI-MS⁺中的准分子离子峰m/z：1463[M+Na]⁺；负离子质谱ESI-MS^-中的分子离子峰m/z：1439[M-H]^-。¹³C NMR与¹H NMR数据见表3和表4。以三氟乙酸水解皂苷后得到组成皂苷糖链的单糖，将所得单糖制成糖腈乙酸酯衍生物，用GC-MS进行分析，通过对照标准糖的糖腈乙酸酯，确定variegatuside G糖链由木糖、葡萄糖、3-O-甲基葡萄糖，比例为2∶3∶1。

3.Variegatuside H为白色结晶性粉末。m.p.212～214℃(MeOH-H₂O)，Liebermann-Burchard和Molish反应阳性。IR(KBr，cm^-1)：3422(OH)，1760(C＝O)，1635(C＝C)等主要吸收峰。电喷雾-飞行时间-正离子质谱ESI-MS⁺中的准分子离子峰m/z：1505[M+Na]⁺；负离子质谱ESI-MS^-中的分子离子峰m/z：1481[M-H]^-。¹³C NMR与¹H NMR数据见表5和表6。以三氟乙酸水解皂苷后得到组成皂苷糖链的单糖，将所得单糖制成糖腈乙酸酯衍生物，用GC-MS进行分析，通过对照标准糖的糖腈乙酸酯，确定variegatusideH糖链由木糖、葡萄糖、3-O-甲基葡萄糖，比例为1∶3∶2。

4.Variegatuside I为白色结晶性粉末。m.p.215～217℃(MeOH-H₂O)，Liebermann-Burchard和Molish反应阳性。IR(KBr，cm^-1)：3422(OH)，1760(C＝O)，1635(C＝C)等主要吸收峰。电喷雾-飞行时间-正离子质谱ESI-MS⁺中的准分子离子峰m/z：1447[M+Na]⁺；负离子质谱ESI-MS^-中的分子离子峰m/z：1423[M-H]^-。¹³C NMR与¹H NMR数据见表7和表8。以三氟乙酸水解皂苷后得到组成皂苷糖链的单糖，将所得单糖制成糖腈乙酸酯衍生物，用GC-MS进行分析，通过对照标准糖的糖腈乙酸酯，确定variegatusideH糖链由木糖、葡萄糖、3-O-甲基葡萄糖，比例为3∶1∶2。

表1.variegatuside F苷元部分的¹H NMR and¹³C NMR数据

表2.variegatuside F糖链部分的¹H NMR and ¹³C NMR数据

表3.variegatuside G苷元部分的¹H NMR and ¹³C NMR数据

表4.variegatuside G糖链部分的¹H NMR and ¹³C NMR数据

表5.variegatuside H苷元部分的¹H NMR and ¹³C NMR数据

表6.variegatuside H糖链部分的¹H NMR and ¹³C NMR数据

表7.variegatuside I苷元部分的¹H NMR and ¹³C NMR数据

表8.variegatuside I糖链部分的¹H NMR and ¹³C NMR数据

Xyl：木糖：Glu：葡萄糖；MeGlu：3-O-甲基葡萄糖；J：偶合常数

本发明化合物Variegatuside F～I经体外抗真菌活性实验，表明具有明显的抑制真菌菌株生长的效果，因此可用于制备抗真菌药物。

本发明为开发新的抗真菌药物提供了新的先导化合物，对开发利用中国的海洋药用资源具有重要意义。

具体实施方式

现结合实施例，对本发明作详细描述。

实施例1：制备Variegatuside F～I

选择生长于海南三亚海域的花刺参干品1500g，将花刺参干品粉碎，用75％乙醇水溶液加热提取3次(3000ml/次)，合并3次提取液，减压回收乙醇液，得流浸膏，将流浸膏分散于水中，依次用石油醚、水饱和正丁醇分别萃取，减压浓缩正丁醇液至干，得到粗总皂苷提取物14g。将粗总皂苷提取物进行硅胶柱层析，以体积比为氯仿∶甲醇∶水＝8～6∶2～4∶1的混合溶剂洗脱，薄层层析检测，收集含有皂苷的流份，再经过ODS反相柱层析，以体积比为甲醇∶水＝5～10∶5～0梯度洗脱，薄层层析检测，分别得到Variegatuside F～I纯品。其得量依次为20mg、12mg、14mg、17mg。

本发明化合物Variegatuside F～I体外抗真菌活性实验：

实验所用真菌菌株为ATCC标准菌株和临床菌株，即：

ATCC菌株：白念珠菌(Candida albicans)SC5314

新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)BLS108

临床菌株：热带念珠菌(Candida tropicalis)

红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)

石膏状小孢子菌(Microsporum gypseum)

薰烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)

实验方法：取无菌96孔板，于每排1号孔加RPMI 1640 100μl作空白对照；3～12号孔各加新鲜配制的菌液120μl；2号孔分别加菌液160μl和受试化合物溶液1.6μl。2～11号孔10级4倍稀释，使各孔中的药物终浓度分别为64、16、4、1、0.25和0.0625、0.0156、0.0039、0.00097、0.00024mg·L^-1，各孔中DMSO含量均低于1％；12号孔不含药物，作阳性对照。各药敏板于35℃培养。念珠菌、新生隐球菌及丝状菌分别于35℃培养24h、72h和一周后，用酶标分析仪于630nm测各孔OD值。

与阳性对照孔比，以OD值下降80％以上的最低浓度孔中的药物浓度为MIC₈₀(真菌生长80％被抑制时的药物浓度)。当药物的MIC₈₀值超过测定浓度范围时，按以下方法进行统计：MIC₈₀值高于最高浓度64mg·L^-1时，计为“＞64mg·L^-1”；MIC₈₀值为最低浓度或在最低浓度以下时，不作区别，均计为“≤0.00024mg·L^-1”。实验结果见表9(表中，本发明化合物以F、G、H、I表示)。

表9本发明化合物F、G、H、I对6种真菌的抗菌活性(MIC₈₀，mg·L^-1)

由表1可见，本发明化合物VariegatusideF～I对6种不同的真菌菌株均显示明显的抑制作用，因而可用于制备抗真菌药物。

Claims (3)

1.一种皂苷类抗真菌化合物Variegatuside F～I，其特征在于化学结构通式如下：

其中，各化合物的R₁、R₂、R₃、R₄基团搭配分别为：

                R₁       R₂     R₃    R₄

Variegatuside F CH₂OH    H      OH   

Variegatuside G CH₂OH    H      OH   

Variegatuside H CH₂OH    CH₂OH  OCH₃   

Variegatuside I H        H      OCH₃   

2.权利要求1所述化合物的制备方法，步骤如下：

(1)制备粗总皂苷提取物：将花刺参干品粉碎，按常规用75％乙醇水溶液加热提取，减压回收乙醇液，得流浸膏，将流浸膏分散于水中，依次用石油醚、水饱和正丁醇分别萃取，减压浓缩正丁醇液至干，得到粗总皂苷提取物；

(2)分离提纯：按常规将上述粗总皂苷提取物进行硅胶柱层析，以体积比为氯仿∶甲醇∶水＝8～6∶2～4∶1的混合溶剂洗脱，薄层层析检测，收集含有皂苷的流份，再经过ODS反相柱层析，以体积比为甲醇∶水＝5～10∶5～0梯度洗脱，薄层层析检测，分别得到化合物Variegatuside F～I。

3.权利要求1所述化合物在制备抗真菌药物中的应用。