CN104478983B - 从灵芝中提取分离的两种药用化合物及其方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了从灵芝中提取分离的两种药用化合物及其方法和用途，其化学结构式如式（Ⅰ）、式（Ⅱ）所示。干燥的灵芝粉碎后加入乙醇加热回流提取，减压浓缩至无醇味，加水分散后用乙酸乙酯萃取，经回收溶剂得乙酸乙酯萃取物以及水相部分；乙酸乙酯萃取物用甲醇完全溶解，以硅胶为载体，干燥后，湿法上样，用硅胶柱色谱分离纯化，收集目标物层析液，减压浓缩干后，甲醇溶解，过滤，滤液用C18反相色谱填料高压制备分离，收集相对应的色谱峰，浓缩收集液至干分别得到化合物Ⅰ和化合物Ⅱ两种白色粉末产物，该两种化合物可作为在制备抗菌药物中的用途。
Description
技术领域
本发明涉及药物化合物及其提取方法和用途，具体涉及从灵芝中提取分离的两种具有药理活性的化合物及其方法和用途，属于植物化学技术领域。
背景技术
灵芝是一类大型真菌，属于层菌纲非褶菌目灵芝科灵芝属，在我国药用已有2000多年的历史。周朝《列子》一书中就有“朽壤之上，有菌者芝”的记载；中国最早的本草学专著《神农本草经》将灵芝列为上品，根据其形态和颜色分为赤芝、黑芝、青芝、白芝、黄芝和紫芝六种，并分别描述了各自的性味和主治；对灵芝“滋补强壮、扶正固本”作用的论述更可见于历代医药学专著中，如《新修本草》、《名医别录》、《本草纲目》等，可见我国古代学者对灵芝的重视。近三十年来，中外学者对灵芝（主要是赤芝）的、菌丝体、抱子粉和发酵液进行了广泛深入的研究，极大促进了灵芝的发展。随着现代科学技术的发展，灵芝的药效已逐渐得到证实，通过对灵芝的生物活性物质研究，发现灵芝中主要含三萜类、多糖类、留体类、生物碱类、苯并啦酮类、脂肪酸类等化学成分类型，具有镇静镇痛、降血糖、降血脂、抗肿瘤、神经保护、增进肝脏合成血清蛋白质、防止衰老等功效。由于灵芝还具有极其重要的经济意义，因而广泛被人们所重视，同时科研领域也涌现出对灵芝的化学成分（药效物质基础）及其药理研究的高潮。
灵芝中三萜类化合物，味苦，并多为高度氧化的羊毛留烧型衍生物，也存在羽扇豆烧型三萜（如Lupen）,按照分子中含有的C原子数可以分为C24（如灵芝酮A，灵芝酮B等）,C27（如赤芝酸A，B，C等）和C30（如灵芝酸A，灵芝酸B，灵芝酸C等）三大基本骨架，也可依据它的侧链和功能团的差异分为五种基本结构类型。自1982年Kubota等首次从赤芝中分离获得三萜类新型化合物，至1991年从灵芝属中共分离到近140种三萜新化合物，并在其药理作用及其作用机制上进行综述。相关专利申请及文献报道如下：
1、“灵芝三萜类化合物的提取”，《上海师范大学学报（自然科学版）》2013年02期，公开了用氯仿回流提取木屑栽培灵芝，氯份提取浓缩液经碳酸氢钠溶液萃取，盐酸酸化后，析出絮状沉淀．沉淀再用氯仿提取，经减压干燥得提取物粗品，三次提取实验得率为0.41％～0．93％。粗品对Salkowski，Lieberman，磷钨酸和香草醛等试剂呈三萜类特有的阳性反应，初步可以肯定此提取粗品为三萜类化合物。
2、中国专利CN102311475A公开了从一种从灵芝中分离出的新化合物及其制备方法和医药用途，其化学结构式如下：其制备方法为：将灵芝用醇或醇溶液提取一次或2次以上，过滤，收集滤液，再减压浓缩干燥，获得醇提取物；将醇提取物加水，以石油醚萃取脱脂后，再以乙酸乙酯萃取，获得的乙酸乙酯萃取液再以饱和NaHCO3水溶液萃取，取乙酸乙酯相蒸干，获得粗品；将获得的粗品进行色谱分离纯化，得到上述化合物。本发明所述的化合物能作为治疗肿瘤的药物。
而本发明人在对灵芝化学成分进行研究时又发现并分离出了两种新的三萜类化合物，这两种化合物对金黄色葡萄球菌S.aureus均有一定的抑制作用。可见，目前对于灵芝中所含的化学活性成分仍有具有进一步研发和探讨的必要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从灵芝中提取分离的具有药理活性的两种药用新化合物的方法及其用途。
实现本发明目的所采用的具体技术方案如下：
从灵芝中提取分离的两种新的药用化合物，其化学结构式如式（Ⅰ）、式（Ⅱ）所示：
化学名称为：3β,7β，15β-三羟基-11-羰基-羊毛甾烷-8-烯-24→20内酯。
化学名称为：3β,7β，12β-三羟基-11,15-二羰基-羊毛甾烷-8-烯-24→20内酯
所述两种药用化合物从灵芝中提取分离的具体工艺步骤是：
A．将干燥的灵芝粉碎后用8-10倍重量浓度为85%的乙醇加热回流提取3-5次，每次2小时，减压浓缩至无醇后，将得到的浓缩液体按体积比1:5-10倍加水进行分散处理；
B．将水分散体用等体积乙酸乙酯萃取3-5次，回收溶剂得乙酸乙酯萃取物及水相部分；
C．将乙酸乙酯萃取物用甲醇完全溶解，然后以硅胶为载体，干燥后，湿法上样，用硅胶柱色谱分离纯化，收集目标物层析液，减压浓缩干后，用甲醇溶解，过滤，滤液用C18反相色谱填料高压制备分离，收集相对应的色谱峰，浓缩收集液至干分别得到化合物Ⅰ和化合物Ⅱ两种白色粉末产物。
所述硅胶柱色谱分离：A：二氯甲烷B：甲醇，A：B（20:1)→(10:1)V/V为流动相；
C18反相色谱填料高压制备液相分离：A：乙腈B：0.2%V/V乙酸水，A：B30:70V/V为流动相；检测波长252nm。
本发明制得的两种白色粉末产物，10%硫酸乙醇显色呈紫红色，即该化合物为三萜类化合物。
在此基础上，进一步分析结果如下：
（1）本发明化合物Ⅰ为白色粉末，ESI-MS（e/z）：正离子483.27[M+Na]+，943.57[2M+Na]+；1403.86[3M+Na]+；负离子495.25[M-Cl]-，即该化合物分子量为460；且高分辨质谱给出的准分子离子峰为：483.1125[M+Na]+，计算值为483.1118[M+Na]+，确定其分子式为C27H40O6。
1H-NMR和13C-NMR数据见下表1。
表1化合物Ⅰ核磁数据（600MHz，Pyridine-d 5 ，TMS，δppm,J=Hz）
通过1H、13C-NMR以及DEPT135o和核磁二维HSQC，HMBC，H-HCOSY，NOESY等分析技术手段，确定了该化合物为：3β,7β，15β-三羟基-11-羰基-羊毛甾烷-8-烯-24→20内酯，结构式如式（Ⅰ）所示。
（2）本发明化合物Ⅱ为白色粉末，电喷雾电离质谱ESI-MS显示：正离子497.27[M+Na]+，971.28[2M+Na]+；负离子473.70[M-H]-，即该化合物分子量为474；且高分辨质谱给出的准分子离子峰为：473.7123[M-H]-，计算值为473.7115[M-H]-，所以确定其分子式为C27H38O7。
1H-NMR和13C-NMR数据见下表2。
表2化合物Ⅱ核磁数据（600MHz，Pyridine-d 5 ，TMS，δppm,J=Hz）
通过1H、13C-NMR以及DEPT135o和核磁二维HSQC，HMBC，H-HCOSY，NOESY等分析技术手段，确定了该化合物为：3β,7β，12β-三羟基-11,15-二羰基-羊毛甾烷-8-烯-24→20内酯，结构式如式（Ⅱ）所示。
经更深入的研究表明，所述药用化合物Ⅰ和Ⅱ均具有一定的抗菌活性，对金黄色葡萄球菌S.aureus有一定的抑制作用，可作为在制备抗菌药物中的用途。
本发明的有益技术效果在于：
1、化合物结构确定，明确了其药理活性与灵芝有效成分的关系。
三萜类化合物具有一定的抗菌活性，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌等具有一定的抑制作用。抗菌药理试验表明，与广谱抗生素硫酸卡那霉素对耐药性金黄色葡萄球菌的抑制效果相当。
2、化合物产品提取分离容易，方法简单。
该化合物可由不同质量百分比浓度的乙醇，通过加热回流的方式，从药材中提取出来，经过有机试剂乙酸乙酯萃取除杂，得到粗产品，经硅胶柱色谱分离后，再经过C18反相色谱填料高压制备分离，得到目标化合物，该提取分离方法简单，适用于工业化生产。
3、进一步发掘了灵芝新的药用作用，对于制备新型抗菌药物具有很好的参考价值。
作为首次报道其结构，并根据核磁二维等相关数据确定了其相对构型的新化合物，药理研究表明其对金黄色葡萄球菌具有很好的抑制效果，在研制新型抗菌药物方面，能够作为一种潜体结构进行开发利用。
具体实施方式
实施例1化合物的提取分离
取干燥的灵芝5kg，粉碎后用8倍重量浓度为85%的乙醇加热回流提取3次，每次2小时，减压浓缩至无醇后，得浓缩提取液2000ml，将得到的浓缩液体按体积比1:8倍加水进行分散处理；将水分散体依次用等体积乙酸乙酯萃取4次，回收溶剂得乙酸乙酯萃取物600g及水相部分；将乙酸乙酯萃取物用500ml甲醇完全溶解，然后以硅胶为载体，干燥后，湿法上样，用硅胶柱色谱分离纯化，A：二氯甲烷B：甲醇，A：B10:1V/V为流动相，收集目标物层析液，减压浓缩干后，用甲醇溶解，过滤，滤液用C18反相色谱填料高压制备分离，A：乙腈B：0.2%V/V乙酸水，A：B30:70V/V为流动相；检测波长252nm，收集相对应的色谱峰，浓缩收集液至干分别得到白色粉末化合物Ⅰ230mg，白色粉末化合物Ⅱ190mg。
实施例2化合物的提取分离
取干燥的灵芝5kg，粉碎后用10倍重量浓度为85%的乙醇加热回流提取5次，每次2小时，减压浓缩至无醇后，得浓缩提取液2600ml，将得到的浓缩液体按体积比1:10倍加水进行分散处理；将水分散体依次用等体积乙酸乙酯萃取3次，回收溶剂得乙酸乙酯萃取物670g及水相部分；将乙酸乙酯萃取物用600ml甲醇完全溶解，然后以硅胶为载体，干燥后，湿法上样，用硅胶柱色谱分离纯化，A：二氯甲烷B：甲醇，A：B15:1V/V为流动相，收集目标物层析液，减压浓缩干后，用甲醇溶解，过滤，滤液用C18反相色谱填料高压制备分离，A：乙腈B：0.2%V/V乙酸水，A：B30:70V/V为流动相；检测波长252nm，收集相对应的色谱峰，浓缩收集液至干分别得到白色粉末化合物Ⅰ255mg，白色粉末化合物Ⅱ215mg。
实施例3化合物的提取分离
取干燥的灵芝5kg，粉碎后用9倍重量浓度为85%的乙醇加热回流提取4次，每次2小时，减压浓缩至无醇后，得浓缩提取液2400ml，将得到的浓缩液体按体积比1:5倍加水进行分散处理；将水分散体依次用等体积乙酸乙酯萃取4次，回收溶剂得乙酸乙酯萃取物650g及水相部分；将乙酸乙酯萃取物用560ml甲醇完全溶解，然后以硅胶为载体，干燥后，湿法上样，用硅胶柱色谱分离纯化，A：二氯甲烷B：甲醇，A：B20:1V/V为流动相，收集目标物层析液，减压浓缩干后，用甲醇溶解，过滤，滤液用C18反相色谱填料高压制备分离，A：乙腈B：0.2%V/V乙酸水，A：B30:70V/V为流动相；检测波长252nm，收集相对应的色谱峰，浓缩收集液至干分别得到白色粉末化合物Ⅰ240mg，白色粉末化合物Ⅱ200mg。
实施例4两种化合物抗菌活性实验
实验材料
2.1药品
上述实施例1提取分离得到的两种白色粉末化合物。
2.2人体病原菌
金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）ATCC51650由海南省药品检验所提供。
2.3培养基
牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（NA）：牛肉膏3g，NaCl5g，蛋白胨l0g，定容至1000ml，pH为7.4-7.6。
3.实验方法
滤纸片琼脂扩散法测定化合物的抗菌活性；S.aureus采用NA培养基。
3.1将S.aureus制成一定浓度的菌悬液（105-107cfu/ml），取100μl用棉签均匀涂布于供试无菌平板，制成含菌平板。
3.2将测定的化合物配制成lmg/50μl溶液，取20μl分别滴加于灭菌滤纸片上(Φ=6mm)，待溶剂挥发干后将滤纸片贴于含菌平板上，每处理重复3次。
3.3阳性对照液为硫酸卡那霉素0.08mg/ml(10/μl)，37℃下培养，24h后观察结果，测量并记录抑菌圈直径。
4.实验结果
药理活性结果见表3
注：甲醇为阴性对照，滤纸原片直径为6mm。
上述实验结果表明，两种新化合物对金黄色葡萄球菌S.aureus有一定的抑制作用，可作为在制备抗菌药物中的用途。
Claims (5)
1.从灵芝中提取分离的两种药用化合物，其化学结构式如式（Ⅰ）、式（Ⅱ）所示：
化学名称为：3β,7β，15β-三羟基-11-羰基-羊毛甾烷-8-烯-24→20内酯；
化学名称为：3β,7β，12β-三羟基-11,15-二羰基-羊毛甾烷-8-烯-24→20内酯。
2.如权利要求1所述的从灵芝中提取分离的两种药用化合物的方法，其特征在于：具体工艺步骤是：
A．将干燥的灵芝粉碎后用8-10倍重量浓度为85%的乙醇加热回流提取3-5次，每次2小时，减压浓缩至无醇后，将得到的浓缩液体按体积比1:5-10倍加水进行分散处理；
B．将水分散体用等体积乙酸乙酯萃取3-5次，回收溶剂得乙酸乙酯萃取物及水相部分；
C．将乙酸乙酯萃取物用甲醇完全溶解，然后以硅胶为载体，干燥后，湿法上样，用硅胶柱色谱分离纯化，收集目标物层析液，减压浓缩干后，用甲醇溶解，过滤，滤液用C18反相色谱填料高压制备分离，收集相对应的色谱峰，浓缩收集液至干分别得到结构式如式（Ⅰ）和式（Ⅱ）的化合物。
3.如权利要求2所述的从灵芝中提取分离的药用化合物的方法，其特征在于：所述硅胶柱色谱分离：A：二氯甲烷B：甲醇，A：B（20:1)→(10:1)V/V为流动相。
4.如权利要求2所述的从灵芝中提取分离的药用化合物的方法，其特征在于：所述C18反相色谱填料高压制备分离：A：乙腈B：0.2%V/V乙酸水，A：B30:70V/V为流动相；检测波长252nm。
5.一种如权利要求1所述的从灵芝中提取分离的两种药用化合物在制备抗菌药物中的用途。
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