CN102311475A

CN102311475A - 一种从灵芝中分离出的新化合物及其制备方法和医药用途

Info

Publication number: CN102311475A
Application number: CN 201110200649
Authority: CN
Inventors: 许建华; 李鹏; 张志强
Original assignee: Fujian Medical University
Current assignee: FUJIAN XIANZHILOU BIOLOGICAL SCIENCE & TECHNOLOGY CO.,LTD.
Priority date: 2011-07-18
Filing date: 2011-07-18
Publication date: 2012-01-11
Anticipated expiration: 2031-07-18
Also published as: CN102311475B

Abstract

一种从灵芝中分离出的新化合物及其制备方法和医药用途。本发明公开了一种下式结构的化合物，其化学结构式如下：

Figure 2011102006494100004DEST_PATH_IMAGE001

其制备方法为：将灵芝用醇或醇溶液提取一次或2次以上，过滤，收集滤液，再减压浓缩干燥，获得醇提取物；将醇提取物加水，以石油醚萃取脱脂后，再以乙酸乙酯萃取，获得的乙酸乙酯萃取液再以饱和NaHCO₃水溶液萃取，取乙酸乙酯相蒸干，获得粗品；将获得的粗品进行色谱分离纯化，得到上述化合物。本发明所述的化合物能作为治疗肿瘤的药物。

Description

一种从灵芝中分离出的新化合物及其制备方法和医药用途

技术领域

本发明涉及一种从灵芝中分离出的具有抗肿瘤作用并可抑制肿瘤细胞的多重耐药性（MDR）的新化合物。

本发明还涉及该化合物的制备方法。

本发明还涉及以该化合物在制备治疗肿瘤药物中的应用。

背景技术

肿瘤的多重耐药性（Muti-drug Resistance，MDR）被临床上认为是引起化疗失败的最常见的原因，对肿瘤进行的时间较长的化疗常常导致癌细胞的选择性存活，这些存活的癌细胞对于结构上和功能上不相关的广谱的化疗药物具有交叉抗性。可能导致MDR的几种机理包括细胞由于适应化疗而未能进入程序性死亡（细胞凋亡）、或药物未能到达或作用于细胞内靶位。抗癌治疗，例如药物治疗、生物治疗或放射治疗都必须击中肿瘤的细胞内靶位，并且随后引起某种形式的细胞改变或破坏。与直接杀死肿瘤细胞不同，大多数情况下抗癌药物引发细胞程序性死亡，或细胞凋亡的放生。因此，对多种药物的抗性可能是由于细胞的防御机制引起，该细胞防御机制广泛地限制药物进入细胞靶位，或阻止该细胞进入细胞凋亡并被杀伤。多种机制参与肿瘤细胞耐药性的形成，其中ATP结合盒膜通道转运蛋白是产生MDR的主要原因，而ABCB1、ABCC1和ABCG2与肿瘤MDR关系最为密切。因此寻找高效低毒且对化疗药物药代动力学无影响的MDR逆转剂是有效克服MDR的方法之一。

在治疗癌症方面植物药具有较长的使用历史。已将中药用于改善癌症病人的普通状况，但将中药用于MDR癌细胞的具体根除上还未广泛应用。自然界提供了许多植物来源的抗癌药物，例如长春花碱、紫杉醇、雷公藤内酯醇等。这些从植物中分离的有效成分表现出良好的抗肿瘤效应，且相对于人工合成的化学药物来说，其毒性较低的优点使这些植物来源的抗癌药物在肿瘤治疗中得到了大量的应用。

中药灵芝是多孔菌科灵芝属真菌植物赤芝[Ganoderma lucidum(Leys.ex Fr.)Karst]或紫芝[Ganoderma japonicum(Fr.) Lloyd]的干燥子实体。性温、味甘，具有补中益气、滋补强壮、扶正固本的功效，临床上常用于肿瘤的治疗或辅助治疗。对于灵芝抗肿瘤有效成分的研究，主要针对灵芝多糖和灵芝三萜类成分。抗肿瘤研究结果表明，灵芝三萜对多种肿瘤细胞的生长和转移都有抑制作用。对灵芝三萜类成分的研究在20世纪八十年代达到了高潮，目前已经有130多种灵芝三萜类成分被分离鉴定，我们在针对灵芝抗肿瘤作用的有效成分研究中，分离鉴定了一个新的三萜类化合物，命名为赤芝酸A乙酯（Ethyl lucidenates A）。药理学实验表明，该化合物具有抗肿瘤活性，并且可抑制肿瘤细胞的MDR。针对该化合物经过试验，确定了合理的制备方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种从灵芝中分离出的具有抗肿瘤作用的新化合物（赤芝酸A乙酯）。

本发明的另一个目的在于提供制备该化合物方法。

本发明的再一目的在于提供该化合物在制备治疗肿瘤药物中的应用。

根据本发明的一方面，提供具有下列化学结构式（Ⅰ）的化合物：

（Ⅰ）。

根据本发明的另一方面，提供本发明化合物的制备方法，本发明的化合物可以人工合成，但优选的是从天然植物中分离提取，以获得天然存在的、低毒性的天然化合物。在本发明的一个优选实施方案中，从中国传统中药灵芝中分离纯化了本发明的化合物，其制备步骤包括：

A）将灵芝用醇或醇溶液提取一次或多次，过滤，收集滤液，再减压浓缩干燥，获得醇提取物；

B）将醇提取物加水，以石油醚萃取脱脂后，再以乙酸乙酯萃取，获得的乙酸乙酯萃取液再以饱和NaHCO₃水溶液萃取，取乙酸乙酯相蒸干，获得粗品。

C）将获得的粗品进行色谱分离纯化，得到纯的式（Ⅰ）化合物。

上述步骤C）的粗品进行色谱分离纯化的步骤包括如下：1）将粗品在硅胶上进行柱层析，用氯仿-甲醇梯度洗脱，获得氯仿-甲醇（体积比99：1）洗脱物；2）取氯仿-甲醇（体积比99：1）洗脱物再进行硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，得到石油醚-乙酸乙酯（体积比4：1）洗脱部位；3）取此部位经制备型高效液相色谱分离，甲醇-水梯度洗脱，从甲醇-水（体积比75：25）洗脱部位得到纯的化合物（1）。

根据本发明的再一方面，提供含有本发明化合物的药物组合物，可以通过将本发明化合物添加药学上可接受的载体或附形剂或可选的其他成分而制成适于临床使用的药物组合物。

根据本发明的再一方面，提供本发明化合物在制备治疗肿瘤药物中的应用，其具有杀伤肿瘤细胞的作用，同时该化合物还具有抑制肿瘤细胞MDR的作用。

所述的肿瘤优选为人慢性粒细胞白血病细胞株K562、人髓系白血病细胞株HL60、人Burkitt淋巴瘤细胞株CA46、人结肠癌细胞株SW1116、人结肠癌细胞株SW480、人肝癌细胞株SMMC7221、人肝癌细胞株HepG2，P-gp高表达的耐药细胞株K562/A02。

实验表明在含有结构式（Ⅰ）的化合物和/或其衍生物的药物组合物中，其中结构式（Ⅰ）的化合物和/或其衍生物的含量大于50%以上，尤其90%以上，治疗效果较佳。

本发明的有益效果是：1）肿瘤细胞增殖的抑制作用，本发明的赤芝酸A乙酯对K562及HL-60细胞增殖有显著的抑制作用，均表现出明显的量效关系（见图1，图2）和时效关系（见图3，图4。药物作用于K562细胞24 h、48 h和72 h的IC₅₀值分别是57.59 μg/ml、37.62 μg/ml和25.73 μg/ml；作用于HL60细胞24 h、 48 h和72 h的IC₅₀值分别是37.29 μg/ml、25.98 μg/ml和14.92 μg/ml。作用于CA46、SW480、HepG2、SW1116及SMMC7221细胞48 h 的IC₅₀值分别是20.42μg/ml、50.45μg/ml、55.15μg/ml、135.38μg/ml和73.98 μg/ml。实验结果表明，本发明的化合物具有抗肿瘤活性。2）罗丹明累积实验，本发明的赤芝酸A乙酯能浓度依赖性地增加罗丹明123在P-gp高表达的耐药细胞株K562／A02中的累积，而对相应的敏感细胞株无影响。2.5，5，10 μM的赤芝酸A乙酯使罗丹明123的蓄积水平分别增加2.08、2.49和4.10倍。而作为阳性对照的P-gp抑制剂维拉帕米在浓度为10 μM使丹明123的蓄积水平增加2.93。赤芝酸A乙酯与维拉帕米一样并不改变同样处理的敏感细胞K562中罗丹明123的累积水平。3）罗丹明123胞内分布实验，在DMSO对照组中，罗丹明123基本上被K562/A02 细胞膜上的P-gp蛋白转运出细胞外，因此在共聚焦显微镜下观察胞内残留的罗丹明123很少。而经过不同浓度赤芝酸A乙酯处理后，细胞内罗丹明123的蓄积量增加，其在胞内主要分布在靠近质膜的细胞质中，并且显示出了一定的剂量依赖性。4）赤芝酸A乙酯逆转P-gp介导的肿瘤细胞MDR，2.5，5和10 μM 的赤芝酸A乙酯逆转K562/A02细胞对阿霉素的耐药倍数分别为1.33、2.40和4.59倍，逆转对长春新碱的耐药倍数分别为2.94、4.51和7.21倍；但是并不增加阿霉素、长春新碱、紫杉醇对敏感细胞K562的细胞毒作用。此外赤芝酸A乙酯并不改变非P-pg底物顺铂对K562/A02和K562的细胞毒作用。由上可知，本发明的化合物（1）——赤芝酸A乙酯制备方法简便，工艺条件温和，化合物（1）为白色不定形粉末，实验证明采用本发明工艺步骤，获得的产品纯度可达98%，明显高于现有技术的步骤。本发明的化合物能作为治疗肿瘤的药物，其具有杀伤肿瘤细胞的作用，同时还具有抑制肿瘤细胞MDR的作用。尤其对人红白血病具有较好的疗效。

附图说明

图1为本发明化合物（1）（作用48h）对K562细胞增殖抑制作用的量效关系曲线图。

图2为本发明化合物（1）（作用48h）对HL60细胞增殖抑制作用的量效关系曲线图。

图3为本发明化合物（1）对K562细胞增殖抑制作用的时效关系曲线图。

图4为本发明化合物（1）对HL60细胞增殖抑制作用的时效关系曲线图。

具体实施方式

下面通过对本发明实施例的描述，详细说明但不限制本发明。

实施例

实施例1 化合物（1）的制备

材料来源 灵芝（Ganoderma lucidum(Leys.ex Fr.)Karst）购自中国福建仙芝楼生物科技有限公司，该灵芝的标本样本保藏在福建医科大学药学院。

提取和分离 将干的和粉碎的灵芝用无水乙醇回流提取3次，每次2h，提取液用2号滤纸过滤，用旋转蒸发器去除乙醇获得醇提浸膏。醇提浸膏加适量水后，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，获得的乙酸乙酯萃取液再用饱和碳酸氢钠水溶液萃取，取出乙酸乙酯相减压浓缩蒸干得粗品，将粗品在硅胶上进行柱层析，用氯仿-甲醇梯度洗脱，取氯仿-甲醇（体积比99：1）洗脱物再进行硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，得到石油醚-乙酸乙酯（体积比4：1）洗脱部位，取此部位经制备型高效液相色谱（岛津LC-6AD半制备型高效液相色谱仪）分离，甲醇-水梯度洗脱，从甲醇-水（体积比75：25）洗脱部位得到纯的化合物（1）。化合物（1）为白色不定形粉末，经测试纯度达98%。

实施例2 化合物（1）的化学结构测定

结构测定 用Perkin-Elmer 1600分光光度计记录FTIR光谱，用Shimadzu-3100分光光度计测定紫外光谱，在CDCl₃溶液中用BRUKER核磁共振波谱仪记录NMR光谱，用Agilent 6210飞行时间质谱仪测定质谱。

化合物（1）的理化性质 本发明化合物（1）为白色不定形粉末，UV（EtOH）λmax 254nm；Liebermann-Burchard反应阳性；IR_νmax（cm^-1）：3427，2971，2917，2888，1725，1703，1652，1453，1408，1380，1306，1239，1056；¹H-NMR（CDCl₃，500MHz）：δ1.52(1H，m，H-1)，δ2.90(1H，m，H-1’)，δ2.50(1H，m，H-2)，δ2.45(1H，m，H-2’)，δ1.55(1H，m，H-5)，δ2.11(1H，m，H-6)，δ1.64(1H，m，H-6’)，δ4.81(1H，m，H-7)，δ2.79(1H，d，J=8.5Hz，H-12)，δ2.75(1H，d，J=8.5Hz，H-12’)，δ2.12(1H，dd，J=19.5，9.5 Hz，H-16)，δ2.79(1H，dd，J=19.5，8.5Hz，H-16’)，δ1.97(1H，m，H-17)，δ0.96(3H，s，H-18)，δ1.21(3H，s，H-19)，δ1.57(1H，m，H-20)，δ0.94(3H，d，J=5.0Hz，H-21)，δ1.35(2H，m，H-22)，δ2.30(2H，m，H-23)，δ1.08(3H，s，H-25)，δ1.06(3H，s，H-26)，δ1.31(3H，s，H-27)，δ4.09(2H，q，J=7.0Hz，H-28)，δ1.22(3H，t，J=7.0Hz，H-29)；¹³C-NMR（CDCl₃，125MHz）：δ35.60(C-1), 34.24(C-2)，218.05(C-3)，46.71(C-4)，48.72(C-5)，27.60(C-6)，66.25(C-7)，157.90(C-8)，141.11(C-8)，38.17(C-10)，197.77(C-11)，50.15(C-12)，44.90(C-13)，59.32(C-14)，216.79(C-15)，41.07(C-16)，46.19(C-17)，17.64(C-18)，18.15(C-19)，35.15(C-20)，18.01(C-21)，30.60(C-22)，31.07(C-23)，173.49(C-24)，26.99(C-25)，20.71(C-26)，24.64(C-27)，60.08(C-28)，14.24(C-29)；ESI-MS：m/z 487.28[M+H]^-1。

从¹³C-¹H COSY NMR谱图及¹H -¹H COSY NMR谱图数据，并结合上述理化数据，确证本化合物（1）的结构式如下：

实施例3 化合物（1）抗癌作用的生物学实验及分析

1、材料和方法

细胞系和试剂 用P-gp高表达的耐药细胞株K562/A02、人慢性粒细胞白血病细胞株K562、人髓系白血病细胞株HL60、人Burkitt淋巴瘤细胞株CA46、人结肠癌细胞株SW1116、人结肠癌细胞株SW480、人肝癌细胞株SMMC7221和人肝癌细胞株HepG2。将这些细胞在含10%小牛血清的RPMI 1640培养液中培养，置37℃，5%饱和湿度的CO₂培养箱中培养（人肝癌细胞株SMMC7221及人结肠癌细胞株SW480用含10%小牛血清的DMEM培养液培养）。上述的化合物（1）化学名为赤芝酸A乙酯，来自于实施例1的制备而获得的。

细胞增殖分析 取对数生长期的K562、HL60、CA46、SW1116、SW480、SMMC7221及HepG2细胞，根据细胞株不同按一定的密度接种于96孔培养板中，每孔190 μl。悬浮细胞接种细胞后立即加药，贴壁细胞则先培养1天，第二天待细胞贴壁后再加药。实验组加入不同浓度药物10 μl/孔，细胞对照组加含等量浓度DMSO的无血清培养液，空白对照组为190 μl RPMI 1640加10 μl无药溶剂，每组3个复孔。K562及HL60细胞分别孵育0 h、24 h、48 h和72 h，CA46、SW1116、SW480、SMMC7221及HepG2孵育48 h后，加入5 mg/ml的MTT 20 μl/孔，37℃孵育4 h后离心（2000 rpm，10分钟），小心吸去上清，加150 μl/孔DMSO混匀，各组均于570 nm波长处测定各孔的OD值，计算细胞生长抑制率，抑制率=(1-药物处理孔平均OD值/细胞对照孔平均OD值)×100%。以作用时间为横轴，抑制率值为纵轴绘制细胞增殖抑制时效关系曲线；以药物浓度为横轴，抑制率值为纵轴绘制细胞增殖抑制量效关系曲线。用Logit法计算48 h时药物浓度的IC₅₀值，实验重复3次，取平均值。

罗丹明累积实验 将赤芝酸A乙酯用DMSO配成10 mM，5 mM，2.5 mM的工作液，并以维拉帕米（VRP）作为阳性对照；取对数生长期的敏感细胞与对应的耐药细胞株配成1 mL培养液的工作体积，分别加入1 μl的不同浓度的赤芝酸A乙酯和10 mM VRP，使细胞培养液中赤芝酸A乙酯的终浓度分别为2.5、5.0和10.0μM，VRP的终浓度为10 μM，并以不加入化合物的DMSO作对照；37℃孵育30 min后，加入终浓度为0.5 μM的罗丹明123，37℃继续孵育1h；收集细胞，用冷PBS洗涤细胞2次；将洗涤后的细胞重悬于300 μl 冷PBS中制成单细胞悬液；立即用流式细胞仪（FCM）测定细胞内罗丹明123的累积量(激发波长为488 nm，发射波长为525 nm，检测通道为FL1-H)；计算加入赤芝酸A乙酯或维拉帕米与DMSO阴性组的罗丹明123蓄积量的比值（fold accumulation）。

罗丹明123胞内分布实验 收集K562/A02和K562细胞，用RPMI 1640培养基分装至EP管内，每管1 ml细胞悬液，约0.5×10⁶个细胞；分别设置DMSO阴性对照管和不同浓度的赤芝酸A乙酯管，恒温水浴30min；各管加入终浓度为0.5 μM 的罗丹明123，恒温水浴1h，保持避光；取出EP管，2000rpm×3min，弃去上清，预冷PBS洗涤2次，每次1 ml；300 μL预冷的PBS重悬细胞，共聚焦显微镜观察分析。

赤芝酸A乙酯逆转P-gp介导的肿瘤细胞MDR 取对数生长期K562、K562/A02细胞(8000细胞/孔)进行种板；取单细胞悬液160 μl接种于96孔培养板；赤芝酸A乙酯和各化疗药物用细胞培养液稀释至相应终浓度的10倍；培养24 h后先加入20 μl一定浓度的赤芝酸A乙酯，1h后再加入20 μl不同浓度的化疗药物，阴性对照组培养体系中不加药物，空白对照组不加细胞仅加相应培养液；将96孔板置于37℃，5％C02饱和湿度培养箱中培养72h；每孔加入20 μl 5 mg/ml的MTT，再培养4h；弃去培养液，每孔加入100 μl DMSO，待完全溶解显色后用酶标仪570 nm波长测定OD值；使用统计学分析软件Prism 3.0拟合出细胞的浓度-生存率曲线，并计算出无赤芝酸A乙酯时化疗药物对细胞的IC₅₀和加入赤芝酸A乙酯后化疗药物对细胞的IC₅₀。

耐药倍数=化疗药物对耐药细胞的IC₅₀/化疗药物对敏感细胞的lC₅₀；

逆转倍数=无逆转剂时化疗药物对细胞IC₅₀/在逆转剂存在时化疗药物对细胞的IC₅₀。

结果：

肿瘤细胞增殖的抑制作用结果 赤芝酸A乙酯对K562及HL-60细胞增殖有显著的抑制作用，均表现出明显的量效关系（见图1，图2）和时效关系（见图3，图4）。药物作用于K562细胞24 h、48 h和72 h的IC₅₀值分别是57.59 μg/ml、37.62 μg/ml和25.73 μg/ml；作用于HL60细胞24 h、 48 h和72 h的IC₅₀值分别是37.29 μg/ml、25.98 μg/ml和14.92 μg/ml。作用于CA46、SW480、HepG2、SW1116及SMMC7221细胞48 h 的IC₅₀值分别是20.42μg/ml、50.45μg/ml、55.15μg/ml、135.38μg/ml和73.98 μg/ml。实验结果表明，本发明的化合物具有抗肿瘤活性。

罗丹明累积实验结果 赤芝酸A乙酯能浓度依赖性地增加罗丹明123在P-gp高表达的耐药细胞株K562／A02中的累积，而对相应的敏感细胞株无影响。2.5，5，10 μM的赤芝酸A乙酯使罗丹明123的蓄积水平分别增加2.08、2.49和4.10倍。而作为阳性对照的P-gp抑制剂维拉帕米在浓度为10 μM使丹明123的蓄积水平增加2.93。赤芝酸A乙酯与维拉帕米一样并不改变同样处理的敏感细胞K562中罗丹明123的累积水平。

罗丹明123胞内分布实验结果 在DMSO对照组中，罗丹明123基本上被K562/A02 细胞膜上的P-gp蛋白转运出细胞外，因此在共聚焦显微镜下观察胞内残留的罗丹明123很少。而经过不同浓度赤芝酸A乙酯处理后，细胞内罗丹明123的蓄积量增加，其在胞内主要分布在靠近质膜的细胞质中，并且显示出了一定的剂量依赖性。

赤芝酸A乙酯逆转P-gp介导的肿瘤细胞MDR结果 2.5，5和10 μM 的赤芝酸A乙酯逆转K562/A02细胞对阿霉素的耐药倍数分别为1.33、2.40和4.59倍，逆转对长春新碱的耐药倍数分别为2.94、4.51和7.21倍；但是并不增加阿霉素、长春新碱、紫杉醇对敏感细胞K562的细胞毒作用。此外赤芝酸A乙酯并不改变非P-pg底物顺铂对K562/A02和K562的细胞毒作用。

Claims

1.一种结构式（Ⅰ）的化合物，其化学结构式如下：

（Ⅰ）。

2.权利要求1的所述的化合物的制备方法，包括以下步骤：

A）将灵芝用醇或醇溶液提取一次或2次以上，过滤，收集滤液，再减压浓缩干燥，获得醇提取物；

B）将醇提取物加水，以石油醚萃取脱脂后，再以乙酸乙酯萃取，获得的乙酸乙酯萃取液再以饱和NaHCO₃水溶液萃取，取乙酸乙酯相蒸干，获得粗品；

3.根据权利要求2所述的化合物的制备方法，其特征在于步骤C）的粗品进行色谱分离纯化的步骤包括如下：1）将粗品在硅胶上进行柱层析，用氯仿-甲醇梯度洗脱，获得氯仿-甲醇的体积比为99：1的洗脱物；2）取氯仿-甲醇的体积比为99：1的洗脱物再进行硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，得到石油醚-乙酸乙酯的体积比为4：1的洗脱部位；3）取此部位经制备型高效液相色谱分离，甲醇-水梯度洗脱，从甲醇-水的体积比为75：25的洗脱部位得到纯的化合物（1）。

4.权利要求1所述的结构式（Ⅰ）的化合物或其衍生物在制备治疗肿瘤药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述的肿瘤为人慢性粒细胞白血病细胞株K562、人髓系白血病细胞株HL60、人Burkitt淋巴瘤细胞株CA46、人结肠癌细胞株SW1116、人结肠癌细胞株SW480、人肝癌细胞株SMMC7221、人肝癌细胞株HepG2。

6.权利要求1所述的结构式（Ⅰ）的化合物或其衍生物在制备治疗抑制肿瘤细胞MDR的药物中的作用。

7.含有治疗有效量的权利要求1所述的结构式（Ⅰ）的化合物或其衍生物的药物组合物。

8.根据权利要求7所述的的药物组合物，其中结构式（Ⅰ）的化合物和/或其衍生物的含量大于50%以上，尤其90%以上。