CN106924301A - 灵芝提取物和灵芝三萜单体在治疗常染色体显性遗传多囊肾病中的应用 - Google Patents

灵芝提取物和灵芝三萜单体在治疗常染色体显性遗传多囊肾病中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了灵芝提取物和灵芝三萜单体在治疗常染色体显性遗传多囊肾病中的应用。本发明公开的灵芝提取物按照灵芝提取物的制备方法制备，该方法包括：利用乙醇水溶液回流提取灵芝子实体，得到乙醇提取物；利用乙酸乙酯对乙醇提取物进行萃取，收集乙酸乙酯相得到乙酸乙酯提取物；利用碳酸氢钠水溶液对乙酸乙酯提取物进行萃取，收集水相得到碳酸氢钠提取物；利用乙酸乙酯对碳酸氢钠提取物进行萃取，收集乙酸乙酯相得到灵芝提取物；灵芝三萜单体为灵芝酸C2乙酯、赤芝酮D或/和灵芝酸C2。实验证明，本发明的灵芝提取物和灵芝三萜单体能够抑制肾脏囊泡的形成和生长，可用于治疗常染色体显性遗传多囊肾病。

Description

灵芝提取物和灵芝三萜单体在治疗常染色体显性遗传多囊肾 病中的应用
技术领域
本发明涉及生物医学领域中，灵芝提取物和灵芝三萜单体在治疗常染色体显性遗传多囊肾病中的应用。
背景技术
灵芝三萜(Ganoderma Triterpenes，GTs)是在灵芝中发现的一类三萜类化合物，是灵芝中十分重要的化学和药效成分,具有显著的生理活性。最早在1982年，Kubota T等人首次从赤芝子实体中分离得到三萜类化合物灵芝酸A和灵芝酸B。到目前为止，从各种灵芝的子实体，孢子和菌丝中分离得到的三萜类化合物超过300多种，属灵芝的二级代谢产物，分子量范围在400-600kDa，绝大多数均分离自赤芝。临床用药主要是赤芝、松杉灵芝和紫芝。灵芝中的三萜类化合物多为四环三萜和五环三萜，是一类高度氧化的羊毛甾烷类衍生物，具有共同的羊毛甾烷(Lanostane)骨架(化学结构式如图1)，被归类为羊毛甾烷类三萜。根据侧链和官能团的不同，又可将灵芝三萜的基本骨架分类为灵芝酸(Ganoderic acid)、灵芝内酯(Ganolactone)、灵芝醇(Ganoderiol)和赤芝酸(Lucideric acid)等，灵芝酸为灵芝三萜类化合物中的主要活性成分。灵芝三萜类化合物大多具有一定的生理活性，《本草纲目》中记载：灵芝味苦、平、无毒、益心气、活血、入心充血、助心充脉、安神、益肺血、补肝气、补中、增智慧、好颜色、利关节、坚筋骨、祛痰、健胃。
灵芝三萜对多种生物活性具有调节作用，和其他的天然产物相似，在使用过程中并不能完全避免其副作用。目前为止，灵芝的各种衍生物，作为保健药在市场上非常常见，各种剂型也层出不穷，孢子粉胶囊，冰冻干粉，汤剂，糖浆，药片等。为了确定灵芝衍生物各种剂型的毒性剂量，科研工作者进行了大量的体内和体外实验，结果发现随着摄入剂量不同，药物的作用呈剂量依赖的效应，其毒性也呈剂量依赖效应。
常染色体显性遗传多囊肾病(autosomal dominant polycystic kidneydisease,ADPKD)是一种常见的单基因遗传性疾病，发病率约为1/1000-1/400，居遗传性肾病的第一位。ADPKD以双侧肾脏多发性进行性的充液囊泡为主要特征，囊泡上皮细胞过度增殖，囊液异常分泌，伴有间质纤维化。逐渐增大的充液囊泡不断挤压周围正常的肾组织，导致正常的肾脏结构的破坏和功能的丧失，最终发展为终末期肾衰(end-stage renalfailure,ESRF)，ADPKD占我国终末期肾衰病因的第4位。ADPKD患者通常在中年发生显著的肾功能进行性衰退，肾小球滤过率逐年下降。约50％的ADPKD患者在60岁时进入终末期肾衰。目前对于ADPKD的治疗缺乏特异性的药物，终末期肾衰患者主要依靠透析或肾移植来维持生命，给社会和家庭带来了巨大的负担，因此，筛选ADPKD特异性的治疗药物是一个亟待解决的问题。
关于ADPKD的发病机制，分子生物学的研究发现，与PKD发病相关的两个基因分别为Pkd1(polycystic kidney disease 1)基因和Pkd2(polycystic kidney disease 2)基因。Pkd1和/或Pkd2的突变，可以通过影响细胞内多条信号通路，导致细胞增殖水平升高，分化程度降低，囊泡产生，囊液异常分泌等，最终导致肾脏病理学的变化。由Pkd1基因突变所导致的ADPKD约占85％-90％，而Pkd2基因突变所引起的ADPKD约占10％-15％。Pkd1基因定位于第16号染色体短臂1区3带3亚带(16p13.3)，编码多囊蛋白1，PC1(polycystin 1)，主要表达于肾小管上皮细胞的初级纤毛，紧密连接、粘着连接、桥粒、粘着斑等部位。Pkd2基因定位于第4号染色体长臂2区2带到2区3带(4q22-23)，翻译产物为多囊蛋白2，PC2(polycystin2)。在ADPKD的发病过程中，由于Pkd1基因或/和Pkd2基因的突变，导致多囊蛋白复合物功能异常，细胞内Ca2+浓度降低，从而导致ACVI活性升高，cAMP产生增多；PDE活性降低，cAMP降解减少，最后导致细胞内cAMP水平升高。cAMP水平的升高会导致下游信号通路的过度激活，包括激活蛋白激酶A(PKA)，诱导下游Ras/MAPK信号通路，促进分化不成熟的囊泡上皮细胞过度增殖。PC1可以通过调节结节硬化症蛋白TSC1/TSC2复合物参与抑制mTOR信号通路，从而调节mTOR信号通路——PC1的缺失会导致mTOR信号通路异常激活，导致细胞过度增殖。
在ADPKD的发病过程中，除了最终导致肾衰竭以外，又常累及多种肾外器官，包括肝脏、脾脏等的囊性变以及一些心脑血管疾病，尤其是早发性的高血压(HTN)，有超过60％的PKD患者会患有早发性高血压，因此ADPKD被认为是一种系统性疾病，而相应的心血管疾病很可能作为发生终末期肾衰的预警。但是目前关于ADPKD的治疗，除了到终末期肾衰主要依靠透析或肾移植以外，尚无有效的治疗方法。由于ADPKD疾病的复杂性，联合用药一方面保留正常的肾功能，有效的避免终末期肾衰的发生，另一方面最大程度的发挥作用减缓疾病的发展，减少副作用，是一个急需解决的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何治疗常染色体显性遗传多囊肾病(autosomaldominant polycystic kidney disease,ADPKD)。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了灵芝提取物的下述任一应用：
X1、制备治疗和/或预防常染色体显性遗传多囊肾病产品；
X2、治疗和/或预防常染色体显性遗传多囊肾病；
X3、制备治疗和/或预防Pkd1(polycystic kidney disease 1)基因和Pkd2(polycystic kidney disease 2)基因引发的常染色体显性遗传多囊肾病产品；
X4、治疗和/或预防Pkd1(polycystic kidney disease 1)基因和Pkd2(polycystic kidney disease 2)基因引发的常染色体显性遗传多囊肾病；
X5、制备抑制肾脏囊泡产生和/或生长产品；
X6、抑制肾脏囊泡产生和/或生长；
X7、制备抑制Ras/MAPK信号通路产品；
X8、抑制Ras/MAPK信号通路；
X9、制备促进肾脏细胞形成小管样结构产品；
X10、促进肾脏细胞形成小管样结构；
X11、制备促进肾脏囊泡小管样结构的形成和/或生长产品；
X12、促进肾脏囊泡小管样结构的形成和/或生长；
X13、制备促进肾脏囊泡上皮细胞的分化产品；
X14、促进肾脏囊泡上皮细胞的分化；
所述灵芝提取物可按照灵芝提取物制备方法制备；所述灵芝提取物制备方法包括：
1)利用乙醇水溶液对灵芝进行回流提取，得到乙醇提取物；
2)利用乙酸乙酯对所述乙醇提取物进行萃取，收集乙酸乙酯相得到乙酸乙酯提取物；
3)利用碳酸氢钠水溶液对所述乙酸乙酯提取物进行萃取，收集水相得到碳酸氢钠提取物；
4)利用乙酸乙酯对所述碳酸氢钠提取物进行萃取，收集乙酸乙酯相得到所述灵芝提取物。
回流提取是用易挥发的有机溶剂提取原料成分，将浸出液加热蒸馏，其中挥发性溶剂馏出后又被冷却，重复流回浸出容器中浸提原料，这样周而复始，直至有效成分回流提取完全。
上述应用中，所述灵芝可为灵芝子实体。所述灵芝具体可为赤芝。
上述应用中，所述乙醇水溶液中乙醇的体积百分比可为95％。
上述应用中，所述碳酸氢钠水溶液可为饱和碳酸氢钠水溶液。
上述应用中，所述灵芝提取物制备方法还可包括在利用乙酸乙酯对所述碳酸氢钠提取物进行萃取前调节所述碳酸氢钠提取物的PH至2～3。
所述灵芝与所述乙醇水溶液的配比可为20kg：140L。
利用乙酸乙酯对所述乙醇提取物进行萃取时，乙酸乙酯与所述乙醇提取物的体积比可为1:1。
利用碳酸氢钠水溶液对所述乙酸乙酯提取物进行萃取时，所述碳酸氢钠水溶液与所述乙酸乙酯提取物的体积比可为2:1。
利用乙酸乙酯对所述碳酸氢钠提取物进行萃取时，乙酸乙酯与所述碳酸氢钠提取物的体积比可为2:1。
为解决上述技术问题，本发明还提供了所述灵芝提取物。
为解决上述技术问题，本发明还提供了所述灵芝提取物制备方法。
为解决上述技术问题，本发明还提供了包含所述灵芝提取物的产品，所述产品具有如下功能：
Y1、治疗和/或预防常染色体显性遗传多囊肾病；
Y2、治疗和/或预防Pkd1基因和Pkd2基因引发的常染色体显性遗传多囊肾病；
Y3、抑制肾脏囊泡产生和/或生长；
Y4、抑制Ras/MAPK信号通路；
Y5、促进肾脏细胞形成小管样结构；
Y6、促进肾脏囊泡小管样结构的形成和/或生长；
Y7、促进肾脏囊泡上皮细胞的分化。
上述产品可仅以所述灵芝提取物作为其活性成分，还可以将所述灵芝提取物与具有相同功能的物质一起作为其活性成分。
上述产品还可以包括药学上可接受的载体。所述载体可为固体载体或液体载体。
为解决上述技术问题，本发明还提供了灵芝三萜单体的下述任一应用：
A1、制备治疗和/或预防常染色体显性遗传多囊肾病产品；
A2、治疗和/或预防常染色体显性遗传多囊肾病；
A3、制备抑制肾脏囊泡产生和/或生长产品；
A4、抑制肾脏囊泡产生和/或生长；
A5、制备抑制Ras/MAPK信号通路产品；
A6、抑制Ras/MAPK信号通路；
所述灵芝三萜单体为灵芝酸C2乙酯(ethyl ganoderate C2,CBLZ-7)、赤芝酮D(lucidone D，CBLZ-2)或/和灵芝酸C2(ganoderic acid C2,CBLZ-6)。灵芝酸C2乙酯、赤芝酮D和灵芝酸C2的结构式如图23中所示。
上述应用中，所述肾脏细胞可为犬肾细胞(Madin-Darby canine kidney cells)。
为解决上述技术问题，本发明还提供了包含所述灵芝三萜单体的产品，所述产品具有如下功能：
B1、治疗和/或预防常染色体显性遗传多囊肾病；
B2、抑制肾脏囊泡产生和/或生长；
B3、抑制Ras/MAPK信号通路。
上述产品中，所述肾脏细胞为犬肾细胞。
上述产品可仅以所述灵芝三萜单体作为其活性成分，还可以将所述灵芝三萜单体与具有相同功能的物质一起作为其活性成分。
上述产品也可仅为所述灵芝三萜单体。
上述产品还可以包括药学上可接受的载体。所述载体可为固体载体或液体载体。
为解决上述技术问题，本发明还提供了所述灵芝三萜单体。
本发明中，所述肾脏细胞可为犬肾细胞(Madin-Darby canine kidney cells)。
本发明中，所述治疗和/或预防常染色体显性遗传多囊肾病和所述治疗和/或预防Pkd1基因和Pkd2基因引发的常染色体显性遗传多囊肾病均可通过抑制肾脏囊泡产生、抑制Ras/MAPK信号通路、促进肾脏细胞形成小管样结构、促进肾脏囊泡小管样结构的形成和/或生长和/或促进肾脏囊泡上皮细胞的分化来实现。
本发明中，所述抑制Ras/MAPK信号通路可体现在如下方面：下调H-ras的表达，上调Raf-1的表达，下调B-raf，下调p-MEK，下调p-ERK，下调Egr-1，和/或，下调c-fos。
本发明应用MDCK囊泡模型证明本发明的灵芝提取物能够抑制肾脏囊泡的形成和生长，并通过体外胚胎肾囊泡模型确定灵芝提取物的肾内药理活性，对肾脏内囊泡的发展具有显著的抑制作用，最后在两种多囊肾小鼠模型中进一步证明，灵芝提取物在体内同样具有抑制囊泡发展的作用，以上体外和体内的囊泡抑制作用，呈剂量效应关系。灵芝提取物不影响肾脏细胞的活力，说明灵芝提取物对多囊肾的抑制作用与其细胞毒性无关；灵芝提取物能够促进肾脏细胞和囊泡形成小管样结构，说明其具有促进细胞分化的作用；灵芝提取物对细胞内信号通路的调节作用，可能是其抑制肾脏囊泡发展的重要机制之一。本发明的灵芝三萜单体能够抑制肾脏囊泡的形成和生长，并且对肾脏细胞无毒性，并对细胞内相应的信号通路具有调节作用。实验证明，本发明的灵芝提取物和灵芝三萜单体均可以用于治疗常染色体显性遗传多囊肾病。
附图说明
图1为灵芝三萜单体共有的结构框架。
图2为MDCK细胞集落与囊泡。
图3为灵芝总三萜对MDCK囊泡形成的抑制作用。
图4为灵芝总三萜对MDCK囊泡生长的抑制作用。
图5为灵芝总三萜对囊泡生长的剂量效应抑制及可逆性抑制作用曲线。
图6为小鼠胚胎肾囊泡模型示意图。
图7为灵芝总三萜对胚胎肾囊泡生长的抑制作用及其可逆性。
图8为灵芝总三萜抑制胚胎肾囊泡生长的剂量效应。
图9为灵芝总三萜对胚胎肾囊泡生长的剂量效应抑制及可逆性抑制作用。
图10为Pkd1flox/flox；Ksp-Cre小鼠模型给药后小鼠个体，肾脏照片及体重统计。
图11为Pkd1flox/flox；Ksp-Cre小鼠模型给药肝重指数，肾重指数统计。
图12为Pkd1flox/flox；Ksp-Cre小鼠模型给药肾脏HE染色图及囊性指数统计。
图13为Pkd1flox/flox,Aqp2-Cre小鼠模型给药后小鼠个体，肾脏照片及体重统计。
图14为Pkd1flox/flox,Aqp2-Cre小鼠模型给药肝重指数，肾重指数统计。
图15为Pkd1flox/flox,Aqp2-Cre小鼠模型给药肾脏WGA免疫荧光染色图。
图16为CCK-8检测法检测灵芝三萜对MDCK细胞无细胞毒性。
图17为灵芝总三萜对MDCK细胞小管生成的促进作用。
图18为灵芝总三萜对MDCK囊泡形成小管样结构的促进作用。
图19为forskolin刺激MDCK细胞不同时间点对ERK磷酸化的影响。
图20为灵芝总三萜对MDCK细胞Ras/MAPK信号转导通路的调节作用。
图21为灵芝总三萜对MDCK细胞mTOR信号转导通路无明显的调节作用。
图22和图23为15种灵芝三萜单体的基本信息。
图24为MDCK囊泡生长抑制实验筛选有效单体及CCK-8实验证明三种单体在所用剂量下对MDCK细胞无毒性。
图25为囊泡形成抑制实验筛选有效单体。
图26为灵芝三萜单体CBLZ-7对MDCK细胞Ras/MAPK信号转导通路的调节作用。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的犬肾细胞(Madin-Darby canine kidney cells,MDCK)为ATCC细胞库产品，编号为CCL-34。
实施例1、灵芝总三萜(灵芝提取物)的制备
1、灵芝总三萜(灵芝提取物)及灵芝三萜单体的制备
1.1灵芝总三萜(GT，灵芝提取物)的制备
将20kg赤芝子实体粉碎后，用95％(体积百分比浓度)的乙醇水溶液加热回流提取3次，每次所用95％的乙醇水溶液的体积均为140L，分别回流2h，1h和1h，减压浓缩至干，减压回收溶剂后得乙醇提取物1Kg(膏状)。
将乙醇提取物混悬于5L水中，得到乙醇提取物悬浮液；向乙醇提取物悬浮液中加入是乙醇提取物悬浮液1倍体积的乙酸乙酯进行萃取，收集乙酸乙酯相；将剩余液体继续用是剩余液体1倍体积的乙酸乙酯萃取，用乙酸乙酯共萃取4次，将每次萃取的乙酸乙酯相合并，减压浓缩至2.5L，得到乙酸乙酯提取物。
向乙酸乙酯提取物中加入是乙酸乙酯提取物0.5倍体积的饱和碳酸氢钠水溶液进行萃取，收集水相；将剩余液体继续用是剩余液体0.5倍体积的饱和碳酸氢钠水溶液萃取，用饱和碳酸氢钠水溶液共萃取4次，将每次萃取的水相合并，得到碳酸氢钠提取物。将碳酸氢钠提取物用6mol/mL盐酸调节PH至2～3，得到碳酸氢钠提取物1。
向碳酸氢钠提取物1中加入是碳酸氢钠提取物0.5倍体积的乙酸乙酯进行萃取，收集乙酸乙酯相；将剩余液体继续用是剩余液体0.5倍体积的乙酸乙酯萃取，用乙酸乙酯共萃取4次，将每次萃取的乙酸乙酯相合并，得到乙酸乙酯提取物1。减压回收乙酸乙酯提取物1的溶剂，即得到灵芝总三萜(灵芝提取物)80g。
1.2灵芝三萜单体的提取方法如下：
将20kg茶病灵芝子实体粉碎后，用95％(体积百分比浓度)的乙醇水溶液加热回流提取3次，每次所用95％的乙醇水溶液的体积均为140L，分别回流2h，1h和1h，减压浓缩至干，得到乙醇浸膏1kg。
将乙醇浸膏1kg与D101大孔树脂(天津南开大学化工厂)1kg混合拌匀，晾干，进行D101大孔树脂柱层析(7L D101大孔树脂，柱体积：12×150cm，)，依次用水(21L)、30％(体积百分比浓度)的乙醇水溶液(21L)、50％(体积百分比浓度)的乙醇水溶液(21L)、70％(体积百分比浓度)的乙醇水溶液(21L)和95％(体积百分比浓度)的乙醇水溶液(21L)进行洗脱，将用水洗脱的流出液记为水部分(48.3g)，将用30％的乙醇水溶液洗脱的流出液记为30％乙醇部分(36.6g)，将用50％的乙醇水溶液洗脱的流出液记为50％乙醇部分(360g)，将用70％的乙醇水溶液洗脱的流出液记为70％乙醇部分(110g)，将用95％的乙醇水溶液洗脱的流出液记为95％乙醇部分(210g)。
将50％乙醇部分通过硅胶柱色谱分离(硅胶(100-200目)4kg，柱体积：12.0×150cm)，采用氯仿-甲醇作为洗脱剂进行梯度洗脱，所用洗脱剂依次为氯仿和甲醇体积比分别为100:1、75:1、50:1、40:1、30:1、20:1、10:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和0:1的氯仿-甲醇，依次得到Fr.A～Fr.M共13个部分，每种洗脱剂的所用体积均为5L。
将其中Fr.C部分(40g)经硅胶柱层析(硅胶(100-200目)700g，柱体积：6.5×90cm)，用石油醚-丙酮作为洗脱剂进行梯度洗脱，所用洗脱剂依次为石油醚和丙酮体积比分别为8:2、7:3、1:1和0:1的石油醚-丙酮，依次得到Fr.C-1～Fr.C-4共4个流分，每种洗脱剂的所用体积均为2.5L。
将Fr.C-1流分(15g)经硅胶柱层析(硅胶(100-200目)400g，柱体积：5.0×80cm)，用石油醚与丙酮体积比为7:3的石油醚-丙酮进行等度洗脱，共洗脱5次，每次石油醚-丙酮的体积为1.5L，自第一次洗脱依次得到Fr.C-1-1～Fr.C-1-5共5个流分。
将Fr.C-1-1流分(2.3g)溶于10ml甲醇，放置后析出白色晶体，将该白色晶体过滤，再次在甲醇中重结晶得到化合物lucidone F(CBLZ-4)(90mg)，其纯度检测结果显示其纯度达到98％以上，光谱鉴定其结构，其结构式见图22。
将Fr.C-1-2流分(2.2g)经硅胶柱层析(硅胶(100-200目)，柱体积：2.2×72cm)，用二氯甲烷-甲醇(其中二氯甲烷与甲醇的体积比为15:1)作为洗脱剂进行洗脱(6L)，共洗脱17次，每次所用体积均相同，得到17份洗脱液，将第6次洗脱得到的洗脱液减压浓缩后溶于甲醇重结晶得到化合物lucidone B(CBLZ-1)(21mg)，其纯度检测结果显示其纯度达到98％以上，光谱鉴定其结构，其结构式见图22。
将Fr.C-1-4流分(1.8g)经硅胶柱层析(硅胶(100-200目)，柱体积：2.0×70cm)，用二氯甲烷-甲醇(其中二氯甲烷与甲醇的体积比为10:1)洗脱(5L)，共洗脱12次，每次所用体积均相同，得到12份洗脱液，将第8次洗脱得到的洗脱液减压浓缩后溶于甲醇重结晶得到化合物lucidone D(CBLZ-2)(11mg)，其纯度检测结果显示其纯度达到98％以上，光谱鉴定其结构，其结构式见图22。
将Fr.C-2流分(9g)经硅胶柱层析(硅胶(100-200目)350g，柱体积：3.0×70cm)，用石油醚-丙酮作为洗脱剂进行梯度洗脱，所用洗脱剂依次为石油醚和丙酮体积比分别为8:2、7:3、6:4和1:1的石油醚-丙酮，所用体积依次为1.5L、2L、2L和2L，依次得到Fr.C-2-1～Fr.C-2-4共4个流分。
将Fr.C-2-2流分(2.5g)经硅胶柱层析(硅胶(100-200目)，柱体积：2.2×72cm)，用石油醚与丙酮的体积比为8:2的石油醚-丙酮(6L)进行洗脱，共洗脱19次，每次所用体积均相同，得到19份洗脱液，将第7次洗脱得到的洗脱液减压浓缩后溶于甲醇重结晶得到化合物ganoderenic acid H(CBLZ-3)(56mg)，其纯度检测结果显示其纯度达到98％以上，光谱鉴定其结构，其结构式见图22。
将Fr.C-2-3流分(1.6g)经硅胶柱层析(硅胶(100-200目)，柱体积：2.0×70cm)，用石油醚与丙酮的体积比为10:1的石油醚-丙酮(4L)进行洗脱，共洗脱11次，每次所用体积均相同，得到11份洗脱液，将第5次洗脱得到的洗脱液减压浓缩后溶于甲醇重结晶)得到化合物3β,7β-dihydroxy-11,15,23-trioxo-lanost-8,16-dien-26-oic acid(CBLZ-8)(10mg)，其纯度检测结果显示其纯度达到98％以上，光谱鉴定其结构，其结构式见图22。
将Fr.C-2-4流分(1.2g)溶于5ml甲醇，放置，)析出白色晶体，将该白色晶体过滤，再次溶于甲醇中重结晶，得到化合物ganoderic acid C2(CBLZ-6)(351mg)，其纯度检测结果显示其纯度达到98％以上，光谱鉴定其结构，其结构式见图22。
将Fr.C-3流分(7g)经硅胶柱层析(硅胶(100-200目)300g，柱体积：2.6×87cm)，用石油醚-丙酮作为洗脱剂进行梯度洗脱，所用洗脱剂依次为石油醚和丙酮体积比分别为9:1、8:2、7:3、6:4和1:1的石油醚-丙酮，所用体积均为2L，依次得到Fr.C-3-1～Fr.C-3-5共5个流分。
将Fr.C-3-1流分(1.2g)经硅胶柱层析(硅胶(100-200目)，柱体积：1.3×65cm)，用二氯甲烷-甲醇作为洗脱剂进行梯度洗脱，所用洗脱剂依次为二氯甲烷-甲醇体积比分别为60:1、50:1、40:1、30:1、20:1和10:1的二氯甲烷-甲醇，所用体积依次为1L、0.5L、0.5L、1L、1L和1L，依次得到Fr.C-3-1-1～Fr.C-3-1-6共6个流分。将C-3-1-2流分减压浓缩后溶于甲醇重结晶得到化合物7-oxo-ganoderic acid Z(CBLZ-9)(210mg)，其纯度检测结果显示其纯度达到98％以上，光谱鉴定其结构，其结构式见图23；将C-3-1-3流分减压浓缩后溶于甲醇重结晶得到化合物ganoderic acid AP3(CBLZ-5)(15mg)，其纯度检测结果显示其纯度达到98％以上，光谱鉴定其结构，其结构式见图22。
将Fr.C-3-2流分(0.8g)经硅胶柱层析(硅胶(100-200目)100g，柱体积：1.0×70cm)，用二氯甲烷与甲醇的体积比为20:1的二氯甲烷-甲醇(4L)进行洗脱，共洗脱7次，每次所用体积均相同，得到7份洗脱液，将第4次洗脱得到的洗脱液减压浓缩后溶于甲醇重结晶得到化合物ethyl ganoderate C2(CBLZ-7)(6mg)，其纯度检测结果显示其纯度达到98％以上，光谱鉴定其结构，其结构式见图22。
将Fr.C-3-3流分(0.7g)经硅胶柱层析(硅胶(100-200目)100g，柱体积：1.0×70cm)，用石油醚与丙酮的体积比为1:1的石油醚-丙酮(3L)进行洗脱，共洗脱7次，每次所用体积均相同，得到7份洗脱液，将第5次洗脱得到的洗脱液减压浓缩后溶于甲醇重结晶得到化合物3β,5α,7ξ-trihydroxy-9(11),22-dien-epoxyergosta(CBLZ-10)(35mg)，其纯度检测结果显示其纯度达到98％以上，光谱鉴定其结构，其结构式见图23。
将Fr.C-3-4流分(1.1g)经硅胶柱层析(硅胶(100-200目)，柱体积：1.2×65cm)，用二氯甲烷-甲醇作为洗脱剂进行梯度洗脱，所用洗脱剂依次为二氯甲烷与甲醇体积比分别为10:1、9:1、8:2、7:3、6:4和1:1的二氯甲烷-甲醇，所用体积依次为1L、0.5L、0.5L、1L、1L和1L，依次得到Fr.C-3-4-1～Fr.C-3-4-6共六个流分。将Fr.C-3-4-3流分减压浓缩后溶于甲醇重结晶得到化合物ganoderic acid XL1(CBLZ-11)(20mg)，其纯度检测结果显示其纯度达到98％以上，光谱鉴定其结构，其结构式见图23。
将Fr.C-3-5流分(0.9g)经RP-18柱层析(Alltima C18(150mm×4.6mm，5μm))，用甲醇-水作为洗脱剂进行梯度洗脱，所用洗脱剂依次为甲醇与水体积比分别为45:55、75:25和100:0的甲醇-水，所用体积依次为1.5L、1L和1L，依次得到Fr.C-3-5-1～Fr.C-3-5-3共三个流分。将Fr.C-3-5-2流分减压浓缩后溶于甲醇重结晶得到化合物ganodersin C(CBLZ-12)(19mg)，其纯度检测结果显示其纯度达到98％以上，光谱鉴定其结构，其结构式见图23。
将Fr.D部分(33g)经硅胶柱层析(硅胶(100-200目)650g，柱体积：6.5×90cm)，用石油醚-丙酮作为洗脱剂进行梯度洗脱，所用洗脱剂依次为石油醚和丙酮体积比分别为6:4、1:1和0:1的石油醚-丙酮，所用体积依次为15L、3L和3L，依次得到Fr.D-1～Fr.D-3共3个流分。
将Fr.D-3流分(6g)经硅胶柱层析(硅胶(100-200目)300g，柱体积：4.6×70cm)，用石油醚与丙酮体积比为2:1的石油醚-丙酮进行等度洗脱，共洗脱3次，每次石油醚-丙酮的体积为1.2L，依次得到Fr.D-3-1～Fr.D-3-3共3个流分。
将Fr.C-3-2流分(0.7g)经高效液相色谱分离化合物，色谱柱为YMC-Pack ODS-A(20×250mm，5μm(日本YMC公司)，上样量为500μl，柱温为25℃，检测器为紫外检测器(254nm)，流动相为甲醇与水的体积比为78:22的甲醇水溶液，流速为6mL/min。检测各含有单一化合物的流出液中的化合物的结构，结果显示在保留时间为65.0min时的得到的化合物为sinensine(CBLZ-15)(6mg)，其纯度检测结果显示其纯度达到98％以上，光谱鉴定其结构，其结构式见图23。
将Fr.E部分(22g)经硅胶柱层析(硅胶(100-200目)500g，柱体积：5.0×90cm)，用石油醚-丙酮作为洗脱剂进行梯度洗脱，所用洗脱剂依次为石油醚和丙酮体积比分别为7:3和0:1的石油醚-丙酮，所用体积依次为8L和3L，依次得到Fr.E-1和Fr.E-2共2个流分。
将Fr.E-1流分(7g)经硅胶柱层析(硅胶(100-200目)，柱体积：2.5×88cm)，用二氯甲烷-甲醇作为洗脱剂进行梯度洗脱，所用洗脱剂依次为二氯甲烷与甲醇体积比分别为20:1、9:1、8:2、7:3、6:4和1:1的二氯甲烷-甲醇，所用体积均为6L，依次得到Fr.E-1-1～Fr.C-1-6共6个流分。
将Fr.E-1-4流分(2.3g)经硅胶柱层析(硅胶(100-200目)，柱体积：1.6×65cm)，用石油醚-丙酮作为洗脱剂进行梯度洗脱，所用洗脱剂依次为石油醚和丙酮体积比分别为7:3、6:4和1:1的石油醚-丙酮，所用体积依次为1L、1L和2L，依次得到Fr.E-1-4-1～Fr.C-1-4-3共3个流分。
将Fr.E-1-4-1流分(0.5g)经高效液相色谱分离化合物，色谱柱为YMC-Pack ODS-A(20×250mm，5μm)(日本YMC公司)，上样量为400μl，柱温为25℃，检测器为紫外检测器(254nm)，流动相为乙腈与水的体积比为30:70的乙腈水溶液，流速为6mL/min。检测各含有单一化合物的流出液中的化合物的结构，结果显示在保留时间为58.2min时的得到的化合物为7-oxo-ganoderic acid Z2(CBLZ-14)(5mg)，其纯度检测结果显示其纯度达到98％以上，光谱鉴定其结构，其结构式见图23。
将Fr.E-1-4-2流分(0.4g)经高效液相色谱分离化合物，色谱柱为YMC-Pack ODS-A(20×250mm，5μm)(日本YMC公司)上样量为300μl，柱温为25℃，检测器为紫外检测器(254nm)，流动相为乙腈与水的体积比为20:80的乙腈水溶液，流速为6mL/min。检测各含有单一化合物的流出液中的化合物的结构，结果显示在保留时间为275min时的得到的化合物为ganoderic acid XL2(CBLZ-13)(5mg)，其纯度检测结果显示其纯度达到98％以上，光谱鉴定其结构，其结构式见图23。
其中，CBLZ-1～CBLZ-15均为灵芝三萜单体。
其中，RP-18柱为Alltech公司产品，Alltima C18(150mm×4.6mm，5μm)；硅胶均为青岛海洋化工厂产品，货号为3号。
上文光谱鉴定化学物结构的方法见文献(Li-Ying Liu,Hui Chen,Chao Liu,Hong-QingWang,Jie Kang,Yan Li,Ruo-Yun Chen.Triterpenoids of Ganodermatheaecolum and their hepatoprotective activities.Fitoterapia,2014,98:254–259.)和文献(刘莉莹，康洁，吴长辉，李晔，陈若芸。茶病灵芝中三萜类成分研究。中国中药杂志，2016,41(6):1075-1080.)。灵芝三萜单体共有的结构框架见图1。
实施例2、灵芝总三萜对MDCK囊泡形成和生长的抑制作用
一、灵芝总三萜能够抑制MDCK囊泡的形成，不影响总的细胞集落数
囊泡形成抑制实验：
体外在三维基质胶(Purecol Collagen，Inamed Biomaterials Fremont公司，货号5409)中培养犬肾细胞(Madin-Darby canine kidney cells,MDCK)，所用培养液1为向10×MEM培养液中添加三维基质胶、HEPES、青霉素和链霉素得到的三维基质胶浓度为2.9mg/ml、HEPES浓度为10mM、青霉素浓度为100U/ml、链霉素浓度为100μg/ml的培养液，pH为7.4。培养液2为向DMEM/F12培养液中添加FBS和forskolin(FSK,弗斯可林，Sigma公司，货号F6886)得到的FBS浓度为10％、forskolin浓度为10μM的培养液，DMEM/F12培养液为由DMEM培养基(美国Invitrogen公司,商品目录号12100-046)和F12培养基(美国Invitrogen公司,商品目录号21700-075)等体积混合得到的液体。具体方法如下：
取24孔板，将约400个MDCK细胞混匀于0.4ml冷的培养液1中，加入24孔板的一个孔中。将24孔板置于37℃细胞培养箱中约90分钟，待三维基质胶凝固后，向每孔加入1.5ml培养液2(即灵芝总三萜浓度为0的培养液)，置于37℃的5％CO2/95％空气培养箱中培养，每12小时更换新鲜培养液2，培养至12天。MDCK细胞受cAMP刺激形成单囊腔囊泡，由单层上皮细胞包被，并可持续生长，其囊泡特性与多囊肾囊泡的特性相似，是筛选评价化合物治疗多囊肾药理活性的最佳体外模型。利用不加入forskolin作为对照，不加入forskolin的MDCK细胞在三维基质胶中培养则会形成不规则的细胞集落，不会形成囊泡，见图2，图2中集落表示细胞集落。
取24孔板，将约400个MDCK细胞混匀于0.4ml冷的培养液1中，加入24孔板的一个孔中。将24孔板置于37℃细胞培养箱中约90分钟，待三维基质胶凝固后，向每孔加入1.5ml培养液3(培养液3为向培养液2中添加实施例1的灵芝总三萜得到的灵芝总三萜浓度为25μg/ml的培养液)，置于37℃的5％CO2/95％空气培养箱中培养，每12小时更换新鲜培养液3，设置3个复孔。培养4-5天后，10μM forskolin诱导囊泡的形成，培养第6天时计数每个孔中圆形有空腔单层上皮细胞包被的囊泡(直径大于50μm)和非囊泡细胞的集落，计算囊泡占总的细胞集落数(囊泡和非囊泡集落之和)的百分率。实验设三次重复，结果表明，灵芝总三萜可以明显减少forskolin诱导的MDCK囊泡的形成，但是不影响总的细胞集落数(包括囊泡和非囊泡集落)，含有灵芝总三萜与不含有灵芝总三萜的囊泡和非囊泡集落总和没有明显差异，见图3，图3左图表示囊泡占总的细胞集落数(囊泡和非囊泡集落之和)的百分比，右图为总的细胞集落数，＊＊表示差异达到极显著水平(p<0.01)。以上结果说明灵芝总三萜对MDCK囊泡形成有明显的抑制作用，这种抑制作用并不毁坏MDCK细胞，与细胞毒性作用无关。
二、灵芝总三萜能够可逆地抑制囊泡的生长，作用呈剂量效应关系
囊泡生长抑制实验：取24孔板，将MDCK细胞混匀于0.4ml冷的培养液1中，加入24孔板的一个孔中，每孔细胞数相同。将24孔板置于37℃细胞培养箱中约90分钟，待三维基质胶凝固后，向每孔加入1.5ml培养液2，置于37℃的5％CO2/95％空气培养箱中培养，培养4天左右即可在显微镜下观察到单层上皮包被的单囊腔囊泡；然后在细胞培养孔中加入终浓度分别为0μg/ml、6.25μg/ml、25μg/ml和100μg/ml的灵芝总三萜继续培养，每个剂量重复3个孔。每12h更换新鲜的含有灵芝总三萜和forskolin的培养液，每两天跟踪拍照记录各个囊泡并测量囊泡直径以评价不同浓度的灵芝总三萜对囊泡生长的抑制作用，共观察8天，每孔计数10个以上囊泡，作囊泡生长曲线。实验设三次重复，灵芝总三萜对囊泡生长的抑制作用如图4所示，图4对照组为灵芝总三萜浓度为0的处理组。其中，第一排表示第5-12天用仅含forskolin的培养液培养，第二排表示第5-12天用含有25μg/ml灵芝总三萜和forskolin的培养液共同培养，第三排表示第5-8天用含有25μg/ml灵芝总三萜和forskolin的培养液培养，第9-12天只用含forskolin的培养液培养。可以看出，灵芝总三萜明显抑制了囊泡的生长，但是将灵芝总三萜去除以后，囊泡又重新长大，说明灵芝总三萜对囊泡生长的抑制作用呈可逆性。
灵芝总三萜对囊泡生长的抑制作用曲线如图5所示。图5右侧生长曲线：黑色球曲线代表第5-12天用含有25μg/ml灵芝总三萜和forskolin的培养液培养，空心球曲线代表第5-8天用含有25μg/ml灵芝总三萜和forskolin的培养液培养，第9-12天只用含forskolin的培养液培养，发现去掉灵芝总三萜后，囊泡又重新恢复生长，且具有显著性差异，说明灵芝总三萜并未损害囊泡上皮细胞，结果证明灵芝总三萜能够可逆性的抑制囊泡的生长。图5左侧生长曲线：随着加入灵芝总三萜终浓度的升高，0μg/ml，6.25μg/ml，25μg/ml和100μg/ml，囊泡的直径越小，表明灵芝总三萜对囊泡生长的抑制作用随灵芝总三萜浓度的增加而增强，说明灵芝总三萜对MDCK囊泡生长的抑制作用具有剂量效应。
实施例3、通过体外胚胎肾模型确定灵芝总三萜肾内的囊泡抑制作用
第1天晚上将6周龄以上的C57BL/6小鼠(北京大学医学部实验动物中心)按照1∶1的数量进行雌雄同笼交配，第2天早上观察雌鼠是否有阴栓，若有阴栓则表示雌鼠已怀孕半日，将没有阴栓的小鼠先分笼，晚上再合笼，第二日再观察；将怀孕雌鼠继续单独喂养13天，第13天取胚胎肾用transwell板(Corning公司，货号3401)培养。
取上述13.5天的小鼠胚胎肾置于transwell的上层小室中，下层培养孔中加入含有终浓度为100μM的8-Br-cAMP(Sigma公司，货号B-5386)、浓度为10％的胎牛血清、浓度为2mM的L-谷氨酰胺、浓度为10mM的HEPES、浓度为5g/ml的胰岛素、浓度为5g/ml的转铁蛋白、浓度为2.8nM的硒离子、浓度为25ng/ml的前列腺素E、浓度为32pg/ml的甲状腺激素T3、浓度为250U/ml的青霉素和浓度为250g/ml的链霉素的DMEM/F12培养液进行培养，在cAMP的作用下，肾组织内会形成多发性、进行性生长的肾囊泡，可以作为评价灵芝总三萜预防和/或治疗ADPKD的体外整体器官模型。胚胎肾囊泡模型(多囊肾)的示意图如图6所示。
在胚胎肾的培养过程中，如图7所示，第一行为胚胎肾在加入100μM的8-Br-cAMP持续培养到第6天，第二行为胚胎肾在加入100μM的8-Br-cAMP刺激的基础上，加入100μg/ml的灵芝总三萜进行处理，培养至第6天，第三行为胚胎肾在加入100μM的8-Br-cAMP和100μg/ml的灵芝总三萜培养至第4天，第5-6天只在加入100μM的8-Br-cAMP的培养液中进行培养，每12h更换新鲜的相应的培养液。每天跟踪拍照记录肾脏的状况，实验重复三次。结果发现，给予100μg/ml的灵芝总三萜明显抑制了肾脏囊泡的发展，将药物洗出以后，肾脏囊泡又重新增大，说明这种抑制作用是可逆的。
在胚胎肾培养过程中，使用不同浓度的灵芝总三萜(0μg/ml，6.25μg/ml，25μg/ml和100μg/ml的灵芝总三萜)，与100μM的8-Br-cAMP共同处理，培养至第6天，如图8所示，实验重复三次。结果可以发现，随着灵芝总三萜剂量的升高，对肾脏囊泡的增大抑制作用越明显。根据囊泡面积占肾总面积的比例，绘制肾脏囊泡发展曲线，如图9所示，图9左侧统计图可以看出，灵芝总三萜对胚胎肾囊泡模型囊泡发展的抑制作用，呈剂量效应关系，6.25μg/ml灵芝总三萜处理的胚胎肾囊泡面积占肾脏面积的百分比与0μg/ml的灵芝总三萜处理的胚胎肾无显著差异，而25μg/ml的灵芝总三萜和100μg/ml的灵芝总三萜处理的胚胎肾囊泡面积占肾脏面积的百分比与0μg/ml的灵芝总三萜灵芝总三萜处理的胚胎肾分别达到了显著水平(p<0.05)和极显著水平(p<0.01)。图9右侧统计图可以看出，给予100μg/ml的灵芝总三萜与8-Br-cAMP共同培养至第6天(图9右图中“100”柱)，药物明显抑制囊泡的发展(p<0.01)，但是给予100μg/ml的灵芝总三萜与8-Br-cAMP共同培养至第4天，将药物去除，再单独使用8-Br-cAMP培养至第6天(图9右图中“100(1-4d)”柱)，囊泡又重新增多增大，与持续给予100μg/ml的灵芝总三萜至第6天组相比，具有统计学的差异(p<0.05)。说明这种抑制作用是可逆的。
实施例4、PKD小鼠模型确定灵芝总三萜抑制囊泡生长的体内作用
1.所用小鼠按照如下方法得到：将Pkd1flox/flox小鼠和Ksp-Cre小鼠交配得到子一代Pkd1+/-；Ksp-Cre小鼠，将Pkd1+/-；Ksp-Cre小鼠的公鼠和母鼠交配，得到野生型小鼠Pkd1+/+；Ksp-Cre和Pkd1flox/flox；Ksp-Cre小鼠(PKD小鼠)。其中，Pkd1flox/flox小鼠和Ksp-Cre小鼠的遗传背景均为C57BL/6小鼠，均记载在文献(Wang W,Li F,Sun Y,et al.Aquaporin-1retards renal cyst development in polycystic kidney disease by inhibition ofWnt signaling.FASEB J.2015；29(4):1551-1563.)中。Pkd1flox/flox小鼠为在C57BL/6小鼠背景下全肾特异性的敲除Pkd1基因得到的小鼠，使小鼠出生后即发生快速进行性发展的ADPKD，该种小鼠可在出生后存活约7-10天左右，在小鼠出生后的第一天进行基因鉴定，确定小鼠的基因型。Pkd1flox/flox小鼠对应的野生型C57BL/6小鼠记为Pkd1+/+小鼠。
将野生型小鼠(Pkd1+/+；Ksp-Cre)和PKD小鼠(Pkd1flox/flox；Ksp-Cre)均随机分为两组，空白对照组(空溶剂组，即注射DMSO水溶液，DMSO水溶液由生理盐水与DMSO组成，DMSO与生理盐水的体积比为1：500)及给药组(每千克体重每天给药剂量为100mg灵芝总三萜)，每组小鼠不少于5只。每只小鼠从出生后第一天开始，每12小时使用胰岛素注射器背部皮下注射进行给药(每次注射量均为20μl)，空白对照组每只小鼠每次注射20μl DMSO水溶液，给药组每只小鼠每次注射20μl灵芝总三萜溶液(灵芝总三萜溶液为将实施例1的灵芝总三萜溶于DMSO水溶液得到的溶液)，一直给药持续到出生后第4天。称重，处死，取组织。从小鼠的大小及体重(图10：左侧上为小鼠个体照片，右侧为各组小鼠体重统计图)来看，各组之间没有显著性差异。从肾脏大小来看(图10：左侧下为小鼠肾脏照片)，出生后第4天，基因敲除PKD小鼠中，发生明显的多囊肾，给予灵芝总三萜治疗以后，肾脏体积明显变小。而灵芝总三萜对正常肾脏大小无明显影响。各组小鼠之间肝重指数(肝重/体重)无明显差异(图11左侧统计图)，但是在PKD小鼠中，给予灵芝总三萜治疗显著降低了多囊肾小鼠的肾重指数(双侧肾重/体重)(图11右侧统计图)。小鼠肾脏切片HE染色的结果显示，在PKD小鼠中，小鼠肾脏中有大量囊泡，给予灵芝总三萜，小鼠肾脏明显变小，肾脏组织结构得到改善(图12左侧肾脏HE染色图片)。对囊性指数(囊泡面积/肾脏面积)进行统计的结果(图12右侧统计图)也显示灵芝总三萜显著降低了肾脏的囊泡面积(p<0.01)。图10中，“野生型小鼠+灵芝总三萜”表示注射灵芝总三萜溶液的野生型小鼠，“野生型小鼠”表示注射DMSO水溶液的野生型小鼠，“PKD小鼠”表示注射DMSO水溶液的Pkd1flox/flox；Ksp-Cre小鼠，“PKD小鼠+灵芝总三萜”表示注射灵芝总三萜溶液的Pkd1flox/flox；Ksp-Cre小鼠。图11中，对照表示空白对照。图12中，“PKD小鼠”与“PKD”均表示注射DMSO水溶液的Pkd1flox/flox；Ksp-Cre小鼠，“PKD小鼠+灵芝总三萜”与“PKD+灵芝总三萜”均表示注射灵芝总三萜溶液的Pkd1flox/flox；Ksp-Cre小鼠。
2.所用小鼠按照如下方法得到：将Pkd1flox/flox小鼠与Aqp2-Cre小鼠交配得到Pkd1flox/+；Aqp2-Cre小鼠，将Pkd1flox/+；Aqp2-Cre小鼠的公鼠与母鼠进行交配，从而获得野生型小鼠(Pkd1+/+；Aqp2-Cre)及PKD小鼠(Pkd1flox/flox；Aqp2-Cre)。其中Aqp2-Cre小鼠记载在文献(Wu H,Chen L,Zhou Q,et al.Aqp2-expressing cells give rise to renalintercalated cells.J Am Soc Nephrol.2013；24(2):243-252.)中，Aqp2-Cre小鼠的遗传背景为C57BL/6小鼠。Pkd1flox/flox；Aqp2-Cre为在C57BL/6小鼠背景下进行集合管特异性敲除Pkd1基因，使小鼠出生后发生PKD，并进行性发展，与Pkd1flox/flox；Ksp-Cre小鼠相比，Pkd1flox/flox；Aqp2-Cre小鼠PKD进展相对缓慢，小鼠出生后可存活15-20天左右，在小鼠出生后的第一天进行基因鉴定，确定小鼠的基因型。
将Pkd1flox/flox；Aqp2-Cre小鼠随机分为两组，空白组(空溶剂组，即注射DMSO水溶液)及给药组(每千克体重每天给药剂量为100mg灵芝总三萜，溶剂为DMSO水溶液)，每组小鼠不少于5只。从小鼠出生后第一天开始，每12小时使用胰岛素注射器背部皮下注射进行给药(每次注射量均为20μl)，一直给药持续到出生后第8天。称重，处死，取组织。以野生型小鼠(Pkd1+/+；Aqp2-Cre)作为对照(野生型小鼠未给药)。
结果发现，个别敲除鼠尺寸略小(图13：左侧上小鼠个体照片)，但是统计小鼠体重，各组之间并没有显著性差异(图13:右侧小鼠体重统计图)。从肾脏大小来看(图13：左侧下为小鼠肾脏的照片)，第8天，敲除鼠中，发生明显的多囊肾，给予灵芝三萜治疗以后，肾脏体积明显变小。各组小鼠之间肝重指数(肝重/体重)无明显差异(图14左侧统计图)，但是在敲除鼠中，给予灵芝三萜治疗显著降低了多囊肾小鼠的肾重指数(双侧肾重/体重)(图14右侧统计图)。小鼠肾脏切片麦胚凝集素(WGA)免疫荧光染色细胞膜结果显示，在敲除鼠中，小鼠肾脏中有大量囊泡，组织结构被严重破坏，给予灵芝三萜治疗，小鼠肾脏明显变小，肾脏组织结构得到改善(图15肾脏免疫荧光染色图片，绿色为麦胚凝集素WGA染色，标记细胞膜)。图13-图15中，“PKD小鼠”均表示注射DMSO水溶液的Pkd1flox/flox；Aqp2-Cre小鼠，“PKD小鼠+灵芝总三萜”均表示注射灵芝总三萜溶液的Pkd1flox/flox；Aqp2-Cre小鼠。
实施例5、灵芝总三萜的细胞毒性、对细胞分化及相关信号通路的影响
1.通过CCK-8法确定灵芝三帖的细胞毒性
将对数期的MDCK细胞悬液接种于96孔培养板中，每孔含有1×103个细胞，每孔给予100μl含有10％胎牛血清(FBS，荷兰Gibco Fisher Scientific公司)的DMEM培养基(美国Invitrogen公司,商品目录号12100-046)，置于37℃的5％CO2培养箱中培养24小时。去除FBS，去血清饥饿24小时。之后向细胞培养孔(给药孔)中加入灵芝总三萜溶液，每孔加入的体积均相同，灵芝总三萜的浓度分别为0μg/ml,1.5625μg/ml,3.125μg/ml,6.25μg/ml,12.5μg/ml,25μg/ml,50μg/ml,100μg/ml和200μg/ml，每孔一种浓度，培养24小时。除去上清液，加入含有10％CCK-8试剂的DMEM培养液，37℃的5％CO2/95％空气培养箱中继续培养1小时，酶标仪检测各孔OD值(检测波长450nm),设置调零孔(含有等量的培养基、CCK-8和DMSO，不含有灵芝总三萜)和对照孔(含有等量的细胞、培养基、CCK-8和DMSO，不含有灵芝总三萜，即灵芝总三萜为0μg/ml的给药孔)，每组设定至少5个复孔。按照下述公式计算细胞活力，细胞活力＝(给药孔-调零孔)]/(对照孔-调零孔)×100％。实验重复3次。实验结果如图16所示，不同浓度给药组与对照组(0μg/ml)之间无明显差异，不同浓度的灵芝总三萜并不影响MDCK细胞的细胞活力，对MDCK细胞无毒性作用，说明灵芝总三萜抑制囊泡的作用与其细胞毒性无关。
2、MDCK小管生成实验证实灵芝总三萜能够促进MDCK细胞和囊泡形成小管样结构，作用呈剂量效应关系
在MDCK细胞小管实验中，将MDCK细胞培养于三维基质胶中，取24孔板，将约200个MDCK细胞混匀于0.4ml冷的实施例2的培养液1中，加至24孔板的一个孔中。将24孔板置于37℃细胞培养箱中约90分钟，待三维基质胶凝固后，向每孔加入3T3条件培养液(将3T3成纤维细胞在含有10％胎牛血清的DMEM培养液中培养3天，所得培养液即为3T3条件培养液，该培养液含有肝细胞生长因子)进行培养，培养至12天，由于肝细胞生长因子可以促进内皮细胞的分化，MDCK细胞会逐渐形成小管样结构。
在MDCK细胞小管实验中，在培养液中加入不同浓度的灵芝总三萜(0μg/ml，6.25μg/ml，25μg/ml，100μg/ml)，按照上述方法培养MDCK细胞12天，每24小时更换新鲜的含有相应灵芝总三萜浓度的培养液，每组至少3个孔，每孔至少跟踪10个以上细胞集落，拍照，统计每个集落上小管数目及最长小管的长度，研究不同浓度灵芝总三萜对MDCK细胞分化的影响。实验重复三次，结果如图17所示，图17上小管图片证明，加入灵芝总三萜以后，MDCK细胞形成更多更长的小管样结构。图17下侧的统计图说明给予不同浓度的灵芝总三萜可以促进MDCK细胞小管样结构的形成，并且灵芝总三萜对MDCK细胞小管样结构的形成的促进作用具有剂量效应。
在MDCK囊泡小管实验中，将MDCK细胞培养于三维基质胶中：取24孔板，将约200个MDCK细胞混匀于0.4ml冷的实施例2的培养液1中，加至24孔板的一个孔中。将24孔板置于37℃细胞培养箱中约90分钟；待三维基质胶凝固后，向每孔中加入1.5ml含有10μM forskolin的DMEM/F12培养液进行培养，培养4天，每12小时更换新鲜培养液，使MDCK细胞在4天左右形成MDCK囊泡；然后将培养液更换为含有不同浓度的灵芝总三萜3T3条件培养液(灵芝总三萜浓度为0μg/ml，6.25μg/ml，25μg/ml，100μg/ml)。在3T3条件培养基中加入不同浓度的灵芝总三萜(0μg/ml，6.25μg/ml，25μg/ml，100μg/ml)进行培养，培养12天，每24小时更换新鲜的含有相应浓度的灵芝三萜的培养液，每组至少3个孔，每孔至少跟踪10个以上囊泡进行拍照。灵芝总三萜浓度为0μg/ml的培养中的细胞培养至12天，MDCK囊泡也会逐渐形成小管样结构。计每个囊泡上小管数目及最长小管的长度，研究不同浓度灵芝总三萜对MDCK囊泡上皮细胞分化的影响。实验重复三次，结果如图18所示。图18第一排左侧图片为MDCK细胞培养于三维基质胶中在forskolin刺激下，形成MDCK囊泡。图18第一排中间图片为MDCK囊泡在3T3条件培养基中培养至12天，形成小管样结构。图18第一排右侧图片为MDCK囊泡在含有灵芝总三萜的3T3条件培养基中培养至12天，形成更多更长的小管样结构。图18第二排统计图说明，不通浓度的灵芝总三萜可以促进MDCK囊泡小管样结构的形成和伸长，并且灵芝总三萜对MDCK囊泡小管样结构的形成具有剂量效应。
综合以上结果，证明灵芝总三萜能够促进MDCK细胞和MDCK囊泡上皮细胞小管样结构的形成，灵芝总三萜可以通过促进肾脏囊泡上皮细胞的分化抑制肾脏囊泡发展。
3、灵芝总三萜的作用靶点和机制
利用Western印迹技术，检测灵芝总三萜对囊泡上皮细胞信号转导通路的影响。具体实验过程如下：
将MDCK细胞利用含有10％胎牛血清的DMEM培养基培养至70％-80％融合，换无血清培养液培养24小时，然后给予forskolin(FSK)刺激，forskolin在培养基中的终浓度为10μM，刺激不同时间，分别为0,15,30,45,60分钟，检测不同时间点Ras/MAPK信号通路重要分子ERK-2(ERK2，)和p-ERK(p-ERK1和p-ERK2，ERK的磷酸化形式，即ERK的活化形式)的含量。结果见图19，表明给予forskolin刺激以后，Ras/MAPK信号通路重要分子ERK的磷酸化水平在15分钟即达到峰值。图19中，ERK2代表的是ERK蛋白总的表达水平。
然后将血清饥饿24小时的MDCK细胞，分别加入forskolin和灵芝总三萜进行刺激，forskolin在培养基中的终浓度为10μM，灵芝总三萜在培养基中的终浓度分别为0μg/ml，6.25μg/ml，25μg/ml和100μg/ml，每种灵芝总三萜浓度的培养基中forskolin的浓度均为10μM，同时以不含forskolin刺激的MDCK细胞作为对照(Ctr)，上述各组均刺激15分钟。
提取上述各组细胞的总蛋白，进行Western印迹实验，检测PKD疾病中，两个关键信号通路Ras/MAPK信号通路和mTOR信号通路的重要分子水平的变化(在PKD中，存在这两个信号通路的上调)。结果发现，灵芝总三萜能够显著下调升高的Ras/MAPK信号通路(见图20)，其表现为下调H-ras的表达，上调Raf-1的表达，下调B-raf、p-MEK、p-ERK(p-ERK的结果中为p-ERK1和p-ERK2的结果)、Egr-1和c-fos，对ERK2(ERK-2)的表达水平没有显著的影响。其作用呈一定的剂量效应。而对于mTOR信号通路，forskolin可以促进mTOR信号通路的激活，其表现为p-S6水平的升高，但是灵芝总三萜对升高的mTOR信号通路中的p-S6与S6无显著影响(见图21)。图20和21中FSK表示只添加FSK不添加灵芝总三萜。
实施例6、灵芝三萜单体的研究
灵芝总三萜和15种灵芝三萜单体按照实施例1的方法制备，其具体信息见图22和23，15种灵芝三萜单体分别为赤芝酮B(CBLZ-1)，赤芝酮D(CBLZ-2)，灵芝烯酸H(CBLZ-3)，赤芝酮F(CBLZ-4)，灵芝酸AP3(CBLZ-5)，灵芝酸C2(CBLZ-6)，灵芝酸C2乙酯(CBLZ-7)，3β，7β-二羟基-11,15,23-三氧基羊毛甾-8,16-二烯-26-羧酸(CBLZ-8)；7-氧-灵芝酸Z(CBLZ-9)；3β,5α，7ξ-三羟基-9(11)，22-二烯-二氧麦角甾(CBLZ-10)；灵芝酸XL1(CBLZ-11)；灵芝酸C(CBLZ-12)；灵芝酸XL2(CBLZ-13)；7-氧-灵芝酸Z2(CBLZ-14)；紫芝碱(CBLZ-15)，在细胞实验中，将药物溶于二甲基亚砜(DMSO)制成50mM的储存液，在实验中根据所使用剂量的不同加以稀释。
1、利用MDCK囊泡模型筛选有效单体
按照实施例2的囊泡生长抑制实验，取24孔板，将MDCK细胞混匀于0.4ml冷的培养液1中，加入24孔板的一个孔中，每孔细胞数相同。将24孔板置于37℃细胞培养箱中约90分钟，待三维基质胶凝固后，向每孔加入1.5ml培养液2，置于37℃的5％CO2培养箱中培养，培养4天左右即可在显微镜下观察到单层上皮包被的单囊腔囊泡；在MDCK囊泡生长过程中第6天(培养液2培养第6天，即forskolin刺激第6天)开始，在forskolin刺激的基础上，给予12.5μM不同的灵芝三萜单体，给予等量的DMSO作为对照(Ctr)，观察不同的灵芝三萜单体对MDCK囊泡生长的抑制作用，每组至少3个复孔，每孔跟踪拍照10个以上囊泡，至12天，测量囊泡的直径，绘制囊泡生长曲线。
结果如图24左侧生长曲线图所示，在15种单体中，灵芝三萜单体CBLZ-2，6，7能够明显抑制MDCK囊泡的生长，另外12种灵芝三萜单体均对MDCK囊泡的生长无显著影响；图24右侧为MDCK细胞活力检测结果，结果显示，12.5μM的灵芝三萜单体CBLZ-2，6，7均不影响MDCK细胞的活力，对MDCK细胞不产生毒性作用。
之后，进行MDCK囊泡形成抑制实验，在MDCK囊泡培养的0-6天(即forskolin刺激的0-6天)，在forskolin刺激的基础上，给予12.5μM灵芝三萜单体CBLZ-2，6，7进行处理，每组至少3个复孔，囊泡培养第6天，计数囊泡数目和总的细胞集落数，计算囊泡占总的细胞集落数的百分比，结果如图25所示。图25左侧统计图：CBLZ-2，6，7均不影响总的细胞集落数，不毁坏MDCK细胞，图25右侧统计图：CBLZ-2，6不影响MDCK囊泡的形成，但灵芝三萜单体CBLZ-7显著抑制MDCK囊泡的形成。
这部分结果证明，在15种灵芝三萜单体中，CBLZ-7(灵芝酸C2乙酯)在灵芝三萜抑制多囊肾发展过程中发挥重要作用。
2、灵芝三萜单体CBLZ-7对Ras/MAPK信号通路的影响
用Western印迹技术，检测灵芝三萜单体CBLZ-7对囊泡上皮细胞Ras/MAPK信号通路的影响。具体实验过程如下：
将MDCK细胞利用含有10％胎牛血清的DMEM培养基培养至70％-80％融合，换无血清培养液培养24小时，然后分别加入forskolin和CBLZ-7进行刺激，forskolin在培养基中的终浓度为10μM，CBLZ-7在培养基中的终浓度分别为0μM，3.125μM，12.5μM和50μM，每种CBLZ-7浓度的培养基中forskolin的浓度均为10μM，同时以不含forskolin刺激的MDCK细胞作为对照(Ctr)，上述各组均刺激15分钟。
提取上述各组细胞的总蛋白，进行Western印迹实验，检测CBLZ-7对Ras/MAPK信号通路的重要分子水平的影响，结果发现，CBLZ-7能够显著下调升高的Ras/MAPK信号通路(见图26)，其表现为下调H-ras的表达，上调Raf-1的表达，下调B-raf、p-MEK、p-ERK(p-ERK1和p-ERK2)、Egr-1和c-fos，不影响ERK2的表达水平。其作用呈一定的剂量效应，与总的灵芝三萜作用效果相似。因此，灵芝三萜单体CBLZ-7(灵芝酸C2乙酯)是灵芝总三萜抑制多囊肾囊泡发展的有效单体，其也能够通过调节Ras/MAPK信号通路发挥作用。图26中FSK表示只添加FSK不添加CBLZ-7。

Claims (10)

1.灵芝提取物的下述任一应用：
X1、制备治疗和/或预防常染色体显性遗传多囊肾病产品；
X2、治疗和/或预防常染色体显性遗传多囊肾病；
X3、制备治疗和/或预防Pkd1基因和Pkd2基因引发的常染色体显性遗传多囊肾病产品；
X4、治疗和/或预防Pkd1基因和Pkd2基因引发的常染色体显性遗传多囊肾病；
X5、制备抑制肾脏囊泡产生产品；
X6、抑制肾脏囊泡产生；
X7、制备抑制Ras/MAPK信号通路产品；
X8、抑制Ras/MAPK信号通路；
X9、制备促进肾脏细胞形成小管样结构产品；
X10、促进肾脏细胞形成小管样结构；
X11、制备促进肾脏囊泡小管样结构的形成和/或生长产品；
X12、促进肾脏囊泡小管样结构的形成和/或生长；
X13、制备促进肾脏囊泡上皮细胞的分化产品；
X14、促进肾脏囊泡上皮细胞的分化；
所述灵芝提取物按照灵芝提取物制备方法制备；所述灵芝提取物制备方法包括：
1)利用乙醇水溶液对灵芝进行回流提取，得到乙醇提取物；
2)利用乙酸乙酯对所述乙醇提取物进行萃取，收集乙酸乙酯相得到乙酸乙酯提取物；
3)利用碳酸氢钠水溶液对所述乙酸乙酯提取物进行萃取，收集水相得到碳酸氢钠提取物；
4)利用乙酸乙酯对所述碳酸氢钠提取物进行萃取，收集乙酸乙酯相得到所述灵芝提取物。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述灵芝为灵芝子实体。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述乙醇水溶液中乙醇的体积百分比为95％；
和/或，所述碳酸氢钠水溶液为饱和碳酸氢钠水溶液。
4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：所述灵芝提取物制备方法还包括在利用乙酸乙酯对所述碳酸氢钠提取物进行萃取前调节所述碳酸氢钠提取物的PH至2～3。
5.权利要求1-4中任一所述灵芝提取物。
6.权利要求1-4中任一所述灵芝提取物制备方法。
7.包含权利要求1-4中任一所述灵芝提取物的产品，所述产品具有如下功能：
Y1、治疗和/或预防常染色体显性遗传多囊肾病；
Y2、治疗和/或预防Pkd1基因和Pkd2基因引发的常染色体显性遗传多囊肾病；
Y3、抑制肾脏囊泡产生；
Y4、抑制Ras/MAPK信号通路；
Y5、促进肾脏细胞形成小管样结构；
Y6、促进肾脏囊泡小管样结构的形成和/或生长；
Y7、促进肾脏囊泡上皮细胞的分化。
8.灵芝三萜单体的下述任一应用：
A1、制备治疗和/或预防常染色体显性遗传多囊肾病产品；
A2、治疗和/或预防常染色体显性遗传多囊肾病；
A3、制备抑制肾脏囊泡产生和/或生长产品；
A4、抑制肾脏囊泡产生和/或生长；
A5、制备抑制Ras/MAPK信号通路产品；
A6、抑制Ras/MAPK信号通路；
所述灵芝三萜单体为灵芝酸C2乙酯、赤芝酮D或/和灵芝酸C2。
9.包含权利要求8中所述灵芝三萜单体的产品，所述产品具有如下功能：
B1、治疗和/或预防常染色体显性遗传多囊肾病；
B2、抑制肾脏囊泡产生和/或生长；
B3、抑制Ras/MAPK信号通路。
10.根据权利要求1-4或8中任一所述的应用或权利要求7或9所述的产品，其特征在于：所述肾脏细胞为犬肾细胞。
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