CN105769846A

CN105769846A - 一种gpr35激动剂及其应用

Info

Publication number: CN105769846A
Application number: CN201410821416.XA
Authority: CN
Inventors: 梁鑫淼; 侯滔; 张秀莉; 史丽颖; 王纪霞; 魏来
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2014-12-25
Filing date: 2014-12-25
Publication date: 2016-07-20

Abstract

本发明涉及黄酮类化合物作用靶点的发现，具体地说是黄酮类化合物草质素及其衍生物的作用靶点的发现。体外细胞实验表明本发明的草质素及其衍生物是激动GPR35受体。所述GPR35激动剂以草质素、草质素衍生物、草质素药学上可接受的盐及草质素衍生物药学上可接受的盐中的一种或两种以上的活性成分，GPR35激动剂中还可添加有药学上可接受的载体或赋形剂，目前研究表明GPR35与哮喘、心力衰竭、高血压、炎症、冠状动脉性心脏病、代谢综合症、疼痛和癌症等疾病相关，本发明提供的GPR35激动剂制备的药物可以在此类疾病上应用，为相关疾病的作用靶点提供新的高效的配体。

Description

一种GPR35激动剂及其应用

技术领域

本发明涉及黄酮类化合物作用靶点的发现，具体地说是黄酮类化合物中草质素及其衍生物的作用靶点的发现。所述黄酮类化合物为草质素及其衍生物和它药学上可接受的成盐化合物；所述靶点为GPR35；所述应用为哮喘、心力衰竭、高血压、炎症、冠状动脉性心脏病、代谢综合症和疼痛等疾病的预防和治疗。

背景技术

黄酮类化合物(flavonoidscompounds)是植物的次生代谢产物存在于大量自然植物中，种类繁多，结构类型复杂多样，表现出多种的药理活性，如抗肿瘤、抗心血管疾病、消炎、抗过敏、抗氧化、抗衰老、抗骨质疏松、镇痛和免疫调节等活性，但是目前对于此类化合物研究大多集中在细胞水平，对于纯化合物作用靶点研究甚少(延玺,刘会青,邹永青,任占华.ChineseJournalofOrganicChemistry28(2008)1534-1544；曹纬国,刘志勤,邵云,陶燕铎.西北植物学报23(2003)2241-2247；HUANGHY,CHAXL.ChineseJournalofNewDrugsandClinicalRemedies21(2002)428-433；DUANCHG,LIHW,XULN.ChineseMedicalJournal71(1991)516-517；ZHUXM,ZHAOZHD.ClinicalFocus11(1996)416-418；SONGZHJ,LIUW,LIANGNC,YUJ,MOLE.ChineseTraditionalandHerbalDrugs28(1997)477-479；JIAGH,JIASHSH.ChinesePharmaceuticalJournal33(1998)513-516；HUOSM,LEAVITTPS,LINCP.Biol.TraceElem.Res62(1998)135-153)。

GPR35是一个含有309个氨基酸的G蛋白偶联受体家族中的一个孤儿受体。GPR35在包括白细胞、单核细胞、噬中性粒细胞、T细胞、树突细胞等免疫细胞，胰腺，小肠，结肠和脾脏等各种组织中表达，其中在人结肠癌细胞HT-29细胞中表达水平较高。犬尿喹啉酸、敏喘宁、2-油酰LPA、迷迭香酸、5,6-二羟基吲哚-2-羧酸(DHICA)、帕莫酸、色甘酸二钠等都是GPR35激动剂，目前研究表明孤儿受体GPR35与哮喘、心力衰竭、高血压、炎症、冠状动脉性心脏病、代谢综合症、疼痛和癌症等疾病相关。GPR35受体的新配体的发现和确认，对于阐述其药理学和生物学功能有非常大的意义，这将为疾病的靶向治疗提供新的方向(O’DowdBF,NguyenT,MarcheseA,ChengR,LynchKR,HengHHQ,KolakowskiLF,GeorgeSR.Genomics47(1998)310-313；TaniguchiY,Tonai-KachiH,ShijoK.FEBSLett580(2006)5003-5008；WangJ,SimonaviciusN,WuX,SwaminathG,ReaganJ,TianH,LingL.JBiolChem281(2006)22021-22028；YYang,JYLLu,XWu,SSummer,JWhoriskey,CSaris,JDReagan.Pharmacology86(2010)1-5；HDeng,YFang.Pharmacology89(2012)211-219；HuayunDeng,YeFang.MedChemCommun3(2012)1270-1274)。

目前关于黄酮类化合物中草质素及其衍生物作用于孤儿受体GPR35的内容尚未报道。

发明内容

本发明涉及黄酮类化合物中草质素及其衍生物的作用靶点的发现及此类化合物的应用，目的之一是提供草质素及其衍生物的作用靶点为孤儿受体GPR35；目的之二是提供此类化合物在临床上的应用范围。

本发明的技术方案为：

所述GPR35激动剂为草质素、草质素衍生物、草质素对应的药学上可接受的盐及草质素衍生物对应的药学上可接受的盐中的一种或两种以上为活性成分，GPR35为靶点。

GPR35是一个含有309个氨基酸的G蛋白偶联受体家族中的一个孤儿受体。

草质素及其衍生物化学结构如下：

R＝OH：草质素；

R＝H：山奈酚；

R＝Cl：3,4',5,7-四羟基-8-氯黄酮；

R＝F：3,4',5,7-四羟基-8-氟黄酮；

R＝Br：3,4',5,7-四羟基-8-溴黄酮；

R＝I：3,4',5,7-四羟基-8-碘黄酮；

R＝CH₃O：3,4',5,7-四羟基-8-甲氧基黄酮；

R＝C₂H₁O₄：3,4',5,7-四羟基-8-乙二酸黄酮；

R＝C₂H₅O：3,4',5,7-四羟基-8-乙氧基黄酮；

所述GPR35激动剂是以草质素、草质素衍生物、草质素药学上可接受的盐及草质素衍生物药学上可接受的盐中的一种或两种以上的活性成分，其中还可添加有药学上可接受的载体或赋形剂，如：淀粉、氯化钠、微晶纤维素、山梨酸和/或甘露醇等。该组合物的给药方式可以是但不限于经静脉注射、口服、肌肉、皮下、皮肤表面、局部注射等方式给药，其剂型可以但不限于是注射液、冻干粉针剂、注射微球、脂质体、片剂、胶囊剂、水剂、散剂、糊剂、喷雾剂、颗粒剂、软胶囊、滴丸剂、凝胶剂、贴片、膏剂等，其中优选注射液、冻干粉针剂、片剂和胶囊剂。

本发明所述的GPR35激动剂在制备预防和/或治疗哮喘、心力衰竭、高血压、炎症、冠状动脉性心脏病、代谢综合症和疼痛等疾病药物中的应用，其中，GPR35激动剂为草质素、草质素衍生物、草质素对应的药学上可接受的盐及草质素衍生物对应的药学上可接受的盐中的一种或两种以上。

所述药物是以草质素、草质素衍生物、草质素对应的药学上可接受的盐及草质素衍生物对应的药学上可接受的盐中的一种或两种以上的活性成分，其中还可添加有药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明的有益效果：

本发明提供一种GPR35激动剂，根据体外细胞实验表明，本发明中的草质素及其衍生物作用于G蛋白偶联受体GPR35受体，GPR35受体与哮喘、心力衰竭、高血压、炎症、冠状动脉性心脏病、代谢综合症、疼痛和癌症等疾病相关，根据靶点与疾病的相关性，可以拓宽此化合物的临床应用范围。

附图说明

图1为实施例1在HT-29细胞上的DMR响应信号；

其中，图1a为草质素和3,4',5,7-四羟基-8-乙氧基黄酮各10μM在HT-29细胞上的DMR响应信号；图1b为经草质素和3,4',5,7-四羟基-8-乙氧基黄酮各10μM预处理1h之后，将1μM的敏喘宁在HT-29细胞上的DMR响应信号。

图2为实施例2中草质素和3,4',5,7-四羟基-8-乙氧基黄酮在HT-29细胞上的DMR剂量响应信号；

其中，图2a为草质素在HT-29细胞上的DMR剂量响应信号；图2b为3,4',5,7-四羟基-8-乙氧基黄酮在HT-29细胞上的DMR剂量响应信号。

图3为实施例2中在HT-29细胞上的DMR剂量响应信号；

其中，图3a为草质素和3,4',5,7-四羟基-8-乙氧基黄酮在HT-29细胞上的剂量响应曲线；图3b为不同浓度的草质素和3,4',5,7-四羟基-8-乙氧基黄酮1h预处理后，1μM的敏喘宁在HT-29细胞上的DMR剂量响应信号。

图4为实施例2中不同浓度的ML145预处理10min之后，草质素和3,4',5,7-四羟基-8-乙氧基黄酮在HT-29细胞上的剂量响应曲线。

具体实施方式

现结合实例(草质素和3,4',5,7-四羟基-8-乙氧基黄酮)，对本发明做进一步说明，实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。

实施例1：黄酮类化合物草质素和3,4',5,7-四羟基-8-乙氧基黄酮在HT-29细胞上初步药理学表征

HT-29细胞购于中国科学院上海细胞库；敏喘宁购于Sigma公司；ML145购于Tocris公司。检测平台为康宁第三代成像仪，检测的信号为细胞动态质量重置(DMR)引起的波长位移。

将处于对数生长期的HT-29细胞接种到384孔细胞板的不同孔中，每孔接种的细胞悬液的体积为40μL，每孔接种的HT-29细胞数目为3.2×10⁴个，将接种好的384孔细胞板置于细胞培养箱(5％的CO₂、37℃)中培养22-24h，当细胞融合度达95％左右时，在HT-29细胞上进行活性实验。首先，监测草质素和3,4',5,7-四羟基-8-乙氧基黄酮(工作浓度为10μM)作用于HT-29细胞的DMR响应信号(1h)；然后，将敏喘宁(工作浓度为1μM)加入384孔板中处理HT-29细胞，监测待测化合物对探针分子对HT-29细胞的影响。

将草质素和3,4',5,7-四羟基-8-乙氧基黄酮以10μM的工作浓度作用于HT-29细胞，如图1a，从图1a中可以看出草质素在HT-29细胞上能产生一个较强的DMR信号，而3,4',5,7-四羟基-8-乙氧基黄酮较弱；经草质素和3,4',5,7-四羟基-8-乙氧基黄酮对HT-29细胞预处理1h之后，加入工作浓度为1μM的敏喘宁继续监测1h，结果如图1b所示，经草质素预处理之后将敏喘宁作用于HT-29细胞的DMR响应信号至零，而3,4',5,7-四羟基-8-乙氧基黄酮对敏喘宁信号抑制较弱，已知敏喘宁是GPR35激动剂，由此可以推断草质素和3,4',5,7-四羟基-8-乙氧基黄酮与敏喘宁竞争GPR35。

实施例2：黄酮类化合物草质素和3,4',5,7-四羟基-8-乙氧基黄酮作用于GPR35受体的发现与验证

通过对比图1，推断草质素和3,4',5,7-四羟基-8-乙氧基黄酮作用靶点为GPR35受体，设计实验从激动、脱敏和拮抗三个角度去分析验证。

首先，激动分析：用不同浓度的草质素和3,4',5,7-四羟基-8-乙氧基黄酮处理于HT-29细胞，然后置于仪器上实时监测记录DMR信号，结果如图2所示，草质素和3,4',5,7-四羟基-8-乙氧基黄酮的剂量响应曲线呈单相“S”型，而且达到饱和响应，如图3a所示，其EC₅₀值分别为1.452±0.093μM和77.69±5.486μM(n＝4)。

然后使用脱敏分析的方法验证草质素和3,4',5,7-四羟基-8-乙氧基黄酮于GPR35受体的特异性。先用不同浓度的草质素和3,4',5,7-四羟基-8-乙氧基黄酮处理于HT-29细胞1h，然后再加入1μM的敏喘宁继续监测1h，结果如图3b所示，草质素和3,4',5,7-四羟基-8-乙氧基黄酮对GPR35受体脱敏且是呈现剂量依赖性，其IC₅₀值分别为0.614±0.041μM和51.35±4.633μM(n＝4)。

最后通过拮抗分析方法验证草质素和3,4',5,7-四羟基-8-乙氧基黄酮于GPR35受体的特异性。先用不同浓度的ML145预处理HT-29细胞10min，然后再加入EC₁₀₀的草质素(浓度为15.625μM)和3,4',5,7-四羟基-8-乙氧基黄酮(浓度为200μM)继续监测，结果如图4所示，其IC₅₀值分别为0.1449±0.013μM和0.028±0.003μM(n＝4)。

通过激动、脱敏和拮抗分析三个实验表明GPR35受体是草质素和3,4',5,7-四羟基-8-乙氧基黄酮的作用靶点，且草质素的活性要强于3,4',5,7-四羟基-8-乙氧基黄酮。目前研究表明GPR35受体与疼痛、高血压、糖尿病、早发性炎症性疾病、炎症、哮喘以及癌症等疾病相关，根据靶点与疾病的相关性，可以拓宽此化合物的临床应用范围。

Claims

1.一种GPR35激动剂，其特征在于：所述GPR35激动剂为草质素、草质素衍生物、草质素对应的药学上可接受的盐及草质素衍生物对应的药学上可接受的盐中的一种或两种以上为活性成分。

2.按照权利要求1所述的GPR35激动剂，其特征在于：所述草质素及其衍生物的化学结构如下：

R＝OH、H、F、Cl、Br、I、CH₃O、C₂HO₄、C₂H₅O。

3.按照权利要求1或2所述的GPR35激动剂，其特征在于：所述GPR35激动剂是以草质素、草质素衍生物、草质素药学上可接受的盐及草质素衍生物药学上可接受的盐中的一种或两种以上的活性成分，其中还可添加有药学上可接受的载体或赋形剂。

4.一种GPR35激动剂在制备预防和/或治疗哮喘、心力衰竭、高血压、炎症、冠状动脉性心脏病、代谢综合症和疼痛等疾病药物中的应用，其特征在于：GPR35激动剂为草质素、草质素衍生物、草质素对应的药学上可接受的盐及草质素衍生物对应的药学上可接受的盐中的一种或两种以上为活性成分。

5.按照权利要求4所述的应用，其特征在于：所述草质素及其衍生物的化学结构如下：

R＝OH、H、F、Cl、Br、I、CH₃O、C₂HO₄、C₂H₅O。

6.按照权利要求4或5所述的应用，其特征在于：所述药物是以草质素、草质素衍生物、草质素对应的药学上可接受的盐及草质素衍生物对应的药学上可接受的盐中的一种或两种以上的活性成分，其中还可添加有药学上可接受的载体或赋形剂。