CN105878233B - 青蒿素衍生物在制备治疗肝纤维化药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于制药领域，公开了青蒿素衍生物双氢青蒿素(Dihydroartemisinin，DHA)在制备抗肝纤维化药物中的应用。该青蒿素衍生物的化学名为(3R，5aS，6R，8aS，9R，12S，12aR)‑八氢‑3.6，9‑三甲基‑3，12‑桥氧‑12H‑吡喃并[4，3‑j]‑1，2‑苯并二氧七环‑10(3H)‑醇，分子式为C15H24O5。本发明研究发现该青蒿素衍生物在体内和体外实验中均表现出优良的抗肝纤维化作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种青蒿素衍生物——双氢青蒿素(Dihydroartemisinin，DHA)，其化学名为(3R，5aS，6R，8aS，9R，12S，12aR)-八氢-3，6，9-三甲基-3，12-桥氧-12H-吡喃并[4，3-j]-1，2-苯并二氧七环-10(3H)-醇，尤其是涉及DHA在制备抗肝纤维化药物中的应用。
背景技术
肝纤维化是继发于各种形式慢性肝损伤，包括病毒性肝炎、酗酒、药物作用、代谢性疾病等之后组织修复过程中的代偿反应，也是各种慢性肝病发展为肝硬化及肝细胞癌必经的病理过程。我国是病毒性肝炎的高发地区，发病率高，位居传染病发病之首，其中乙肝占所有肝炎病例的80％，如无有效治疗，将发展为肝纤维化及肝硬化。因此发明有效的抗肝纤维化药物刻不容缓，具有重大价值。
肝纤维化的实质是肝组织内细胞外基质(ECM)的合成大于降解，导致大量ECM过度沉积。ECM主要来源于肝星状细胞(HSC)，又称储脂细胞、Ito细胞、维生素A储存细胞等，是肝脏间质细胞之一，位于肝细胞与肝窦内皮细胞之间的Disse间隙内，约占肝脏非实质细胞总数的1/3，与肝窦内皮细胞和肝细胞紧密接触。正常时呈静息状态，不合成或仅合成少量基质，但在肝组织损伤时HSC活化并转变为肌成纤维细胞，大量增殖并获得迁移、收缩能力。活化的HSC形态和功能的改变奠定了HSC在肝纤维化形成中的关键作用。HSC的活化和增殖是肝纤维化发生、发展的中心环节。探讨抑制HSC活化并诱导其凋亡的机制对于寻找有效的抗纤维化的药物至关重要，已引起国内外学者越来越多的关注。
近年来，针对肝纤维化的形成机制，人们提出了一系列抗肝纤维化治疗药物和方法，如肾上腺皮质素、干扰素等，但疗效不佳。秋水仙碱在抗肝纤维化方面有一定疗效，但毒副作用大，不宜长期使用。中药复方及单体药物的抗肝纤维化作用一直是国内外科研及临床研究的重点和热点。目前，我国已出现相关抗肝纤维化的复方，但其均为中药大复方粗制剂，具有服用量大，服用周期长，疗效不确切，治疗机理不明确等缺点。中药单体的研究近年来取得了较大成果，如姜黄素抗肝纤维化的机制已经明确，但胃肠道不易吸收。这就迫使我们需要寻求一种新的易吸收的、适合于临床应用的药物。
青蒿素(Artemisinin)是我国药学工作者从菊科植物黄花蒿叶中提取分离到的一种具有过氧桥的倍半萜内酯类化合物，其化学结构经过改造、修饰，先后发展了青蒿琥酯、蒿甲醚、双氢青蒿素(Dihydroartemisinin，DHA)等多种衍生物。DHA也是青蒿素及其衍生物蒿甲醚和青蒿琥酯在体内的有效活性代谢产物，其进入体内后具有吸收好、分布广、排泄和代谢迅速等特点。目前研究显示，DHA具有抗疟疾、抗弓形虫、抗肺孢子虫肺炎、抗肿瘤以及调节免疫等多种作用。
双氢青蒿素(DHA)的抗肝纤维化活性，还未见任何报道。
发明内容
发明目的：为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种青蒿素衍生物(3R，5aS，6R，8aS，9R，12S，12aR)-八氢-3，6，9-三甲基-3，12-桥氧-12H-吡喃并[4，3-j]-1，2-苯并二氧七环-10(3H)-醇(DHA)在制备抗纤维化药物中的应用，所述疾病为肝纤维化。
技术方案：本发明的技术方案是体内实验测定双氢青蒿素(DHA)对大鼠肝功能及肝纤维化相关指标的影响。本发明采用大鼠肝纤维化模型及肝星状细胞细胞株HSC-T6，研究DHA在整体、细胞与分子水平对肝组织纤维化损伤及HSC增殖、凋亡和相关信号转导通路中关键蛋白等的作用效果，明确DHA的抗肝纤维化活性及分子机制，为将其制备为抗肝纤维化药物提供重要依据。
本发明所涉及的抗肝纤维化药物是DHA，按照常规的药物制剂工艺制备成一种适合临床上使用的药物制剂，具备显著的保肝、抑制HSC增殖并诱导其凋亡的抗肝纤维化疗效。
有益效果：所述青蒿素衍生物代号为DHA，是菊科植物黄花蒿叶中提取分离到的一种具有过氧桥的倍半萜内酯类化合物的衍生物，其化学名为(3R，5aS，6R，8aS，9R，12S，12aR)-八氢-3，6，9-三甲基-3，12-桥氧-12H-吡喃并[4，3-j]-1，2-苯并二氧七环-10(3H)-醇，分子式为C15H24O5，其结构式如下：
所述的DHA主要通过体内观察DHA对大鼠肝功能的检测及肝纤维化相关指标的测定；体外对肝星状细胞增殖、凋亡等来研究DHA的抗肝纤维化作用。实验结果表明，DHA具有优良的抗肝纤维化活性，不管是在整体对大鼠肝纤维化模型，还是体外抑制HSC增殖、诱导HSC凋亡都有很强的作用。所述的DHA是一种具有抗肝纤维化作用的新化合物，可以用于制备抗肝纤维化药物。
附图说明：
图1：DHA对HSC增殖的影响。
图2：DHA对HSC的细胞毒性作用。
图3：DHA对HSC细胞凋亡的影响。
图4：DHA对HSC的凋亡调控关键蛋白Bcl-2、Bax和Cleaved-caspase-3表达的影响。
具体实施方式
实施例1：观察DHA对大鼠肝组织损伤及肝纤维化指标的影响
雄性SD大鼠30只购自上海斯莱克实验动物有限公司，许可证号：SCXK(沪)2007-0005。动物自由进食、饮水，给予标准颗粒饲料，于标准光照周期(14小时光照、10小时黑夜)、室温22℃、恒湿环境中适应性饲养1周后开始实验。将四氯化碳(CCl4；分析纯，南京化学试剂有限公司)与橄榄油(山东鲁花集团有限公司)按体积比1∶1制成50％橄榄油剂。DHA用橄榄油配置成溶液。动物随机分为五组：正常组、模型组、阳性药物秋水仙碱组(0.1mg/kg)、DHA治疗低(40mg/kg)与高(80mg/kg)剂量组，每组6只。除正常组外的四组大鼠给予CCl4橄榄油溶液腹腔注射(1ml/kg)，每周3次，持续4周后腹腔注射剂量降低为0.5ml/kg，每周3次，再持续4周。从第5周开始口服给予秋水仙碱和DHA不同剂量治疗4周，每天给药1次。实验结束后，每只大鼠称重并腹腔注射10％水合氯醛(350mg/kg)麻醉，眼眶取血后，剖开腹腔分离完整肝脏并称重，计算肝脏/体重比率。大鼠血液静置2h后，3000转/分钟下离心15min，取上清，-20℃冻存，备用。使用半自动生化仪检测大鼠血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)含量，使用ELISA试剂盒检测大鼠血清透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、III型前胶原(PCIII)的含量。
结果(1)：DHA降低肝纤维化大鼠血清中ALT、AST、ALP的含量(表1)。在正常机体血清中这三种酶活性很低，当肝细胞损伤时，这些酶大量入血引起血液中这三种酶的活性升高，临床上也用ALT、AST、ALP作为比较敏感的肝功能检测指标，其升高标志着肝细胞膜和细胞器的损伤。
表1各组大鼠血清指标ALT、AST、ALP的检测结果(平均值±标准差)
注：与正常组相比#P＜0.05，与模型组相比*P＜0.05
结果(2)：DHA降低肝纤维化大鼠血清中纤维化指标HA、LN、PCIII的含量(表2)。HA是一种广泛存在于细胞外基质中的高分子多糖，由肝内间质细胞主要是HSC合成，HA可以反映肝脏的损伤程度和纤维化的发展变化。LN是一种大分子非胶原糖蛋白，由HSC合成后主要分布于基底膜的透明层中。PCIII是III型前胶原分泌至肝细胞外沉积前，PCIII升高反映的是肝脏纤维增生活跃。
表2各组大鼠血清肝纤维化指标HA、LN、PCIII的检测结果(平均值±标准差)
注：与正常组相比#P＜0.05，##P＜0.01，与模型组相比*P＜0.05，*P＜0.01
以上结果表明：肝纤维化模型组动物ALT、AST、ALP、HA、LN、PCIII较正常组明显升高，具有显著意义；DHA具有良好的抗肝纤维化作用，随着DHA剂量的增加，ALT、AST、ALP、HA、LN、PCIII等肝损伤与纤维化指标下降明显，具有显著性差异。
结论：DHA体内能够明显改善大鼠肝纤维化。
实施例2：大鼠HSC体外培养，观察DHA对HSC增殖的抑制作用(细胞增殖活性的检测)
取对数生长期的大鼠HSC接种于96孔板，调整细胞悬液浓度使每孔1×104个细胞，以含10％胎牛血清的DMEM培养基，于37℃、5％CO2培养条件下培养24h使贴壁。细胞分为11组，除正常对照组外，其余10组细胞以DHA(0.01、0.1、0.5、1、5、10、15、20、25、30μM)处理24h。每组设6个复孔。作用结束后，每孔加入0.5％浓度的噻唑蓝(MTT)溶液20μl，继续孵育4h。然后吸掉上清，每孔加入200μl DMSO，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶标仪490nm处测定各孔的吸光值。
实验结果显示，DHA在很小的剂量0.01μM时即可显著抑制HSC的增殖，抑制作用随着剂量的增大而增强，呈现明显的剂量依赖性(图1)。得出结论：DHA能够显著抑制肝星状细胞的增殖。
实施例3：DHA对肝星状细胞的细胞毒作用(细胞毒性测定)。
取对数生长期的HSC接种于96孔板，调整细胞悬液浓度使每孔1×104个细胞，以含有10％FBS的DMEM培养基，于37℃、5％CO2培养条件下培养24h使贴壁。细胞分为10组，除正常对照组外，其余9组细胞以DHA(0.01、0.1、0.5、1、5、10、15、20、25μM)处理24h。每组设6个复孔。用乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒以微量酶标法检测细胞培养上清中LDH的活力，操作按照说明书方法进行。实验重复3次。
结果表明，DHA在0.01至20μM剂量范围内与对照组相比，没有引起细胞上清中乳酸脱氢酶的活性的显著增高，提示在这一剂量范围内没有产生明显的细胞毒作用；而DHA在25μM剂量下使乳酸脱氢酶活性显著增高，产生了较为明显的细胞毒作用(图2)。得出结论：DHA在一定剂量范围内抑制肝星状细胞增殖的作用不是由于其直接细胞毒作用。
实施例4：DHA诱导肝星状细胞凋亡的检测(流式细胞仪测定细胞凋亡率)
取对数生长期HSC接种于6孔板，用含10％FBS的DMEM培养基培养24h使细胞贴壁。细胞分为6组，除正常对照组外，其余5组细胞以DHA(1、5、10、15、20μM)处理24h。使用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)经流式细胞仪测定细胞凋亡率，操作按照说明书方法进行。在细胞发生凋亡的早期，细胞膜内侧的磷酯酰丝氨酸外翻到细胞膜外侧，FITC标记的Annexin V可与之选择性结合。碘化丙啶(PI)可以染色坏死细胞或凋亡晚期丧失细胞膜完整性的细胞，呈现红色荧光。对于坏死细胞，由于细胞膜的完整性已经丧失，Annexin V-FITC可以进入到细胞浆内，与位于细胞膜内侧的磷酯酰丝氨酸结合，从而也使坏死细胞呈现绿色荧光。
检测结果表明，DHA能够剂量依赖性地诱导肝星状细胞凋亡，随着DHA的剂量增加，分布在第二和第四象限的细胞数目逐渐增多，提示越来越多的细胞发生早期或晚起凋亡(图3)。得出结论：DHA体外能够通过促进肝星状细胞凋亡发挥抗肝纤维化作用。
实施例5：DHA对肝星状细胞中调控凋亡的关键蛋白Bax、Bcl-2和裂解型Caspase-3蛋白表达的影响
HSC经药物处理后，用冰冷的RIPA裂解缓冲液进行细胞裂解，收集细胞裂解物，-80℃储藏过夜。蛋白混合液融化，于4℃、12000rpm下离心15min，吸取上清以BCA法测定蛋白浓度。蛋白上样量为50μg，进行12％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，PVDF转膜，非特异性封闭；加入相应一抗，4℃过夜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗进行杂交。加入ECL发光液，以凝胶成像仪(Bio-Rad)进行成像与分析。
实验结果表明，DHA能够剂量依赖性地增加促凋亡的Bax蛋白表达，抑制抗凋亡的Bcl-2蛋白表达，从而上调Bax/Bcl-2比率，同时还增加凋亡执行蛋白Caspase-3的裂解形式Cleaved-caspase-3的表达量(图4)。得出结论：DHA通过调控凋亡关键蛋白Bax、Bcl-2和Caspase-3诱导肝星状细胞发生凋亡，发挥潜在的抗肝纤维化作用。
Claims (5)
1.(3R，5aS，6R，8aS，9R，12S，12aR)-八氢-3，6，9-三甲基-3，12-桥氧-12H-吡喃并[4，3-j]-1，2-苯并二氧七环-10(3H)-醇在制备抗肝纤维化药物中的应用。
2.如权利要求1所述的在制备抗肝纤维化药物中的应用，其特征在于，所述(3R，5aS，6R，8aS，9R，12S，12aR)-八氢-3，6，9-三甲基-3，12-桥氧-12H-吡喃并[4，3-j]-1，2-苯并二氧七环-10(3H)-醇降低肝纤维化大鼠血清中ALT、AST、ALP含量。
3.如权利要求1所述的在制备抗肝纤维化药物中的应用，其特征在于，所述(3R，5aS，6R，8aS，9R，12S，12aR)-八氢-3，6，9-三甲基-3，12-桥氧-12H-吡喃并[4，3-j]-1，2-苯并二氧七环-10(3H)-醇降低肝纤维化大鼠血清中纤维化指标HA、LN、PCIII含量。
4.如权利要求1所述的在制备抗肝纤维化药物中的应用，其特征在于，所述(3R，5aS，6R，8aS，9R，12S，12aR)-八氢-3，6，9-三甲基-3，12-桥氧-12H-吡喃并[4，3-j]-1，2-苯并二氧七环-10(3H)-醇抑制肝星状细胞增殖。
5.如权利要求1所述的在制备抗肝纤维化药物中的应用，其特征在于，所述(3R，5aS，6R，8aS，9R，12S，12aR)-八氢-3，6，9-三甲基-3，12-桥氧-12H-吡喃并[4，3-j]-1，2-苯并二氧七环-10(3H)-醇通过调控凋亡关键蛋白Bax、Bcl-2和Caspase-3诱导肝星状细胞发生凋亡。
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Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| ROS-JNK1/2-dependent activation of autophagy is required for the induction of anti-inflammatory effect of dihydroartemisinin in liver fibrosis;Zili Zhang等;《Free Radical Biology and Medicine》;20161231;第101卷;第272–283页 |
| 双氢青蒿素对实验性小鼠肝纤维化的抑制作用;郭永泽等;《河北医药》;20160331;第28卷(第6期);第824-826页 |
| 双氢青蒿素对小鼠肝纤维化Ⅰ型胶原表达的影响;郭永泽;《临床合理用药》;20161231;第9卷(第12期);第1、2、10页 |
| 双氢青蒿素对小鼠肝纤维化形成的影响;李校天等;《河北中医》;20150331;第37卷(第3期);第400-403页 |
| 双氢青蒿素对胆管结扎致大鼠肝纤维化的治疗作用研究;许霞等;《南京中医药大学学报》;20170731;第33卷(第4期);第376-381页 |
| 青蒿琥酯抗大鼠免疫性肝纤维化的作用及机制研究;来丽娜等;《中国药理学通报》;20110131;第27卷(第1期);第125-129页 |
| 青蒿素抗肺纤维化的研究进展;陈冰燕等;《中国医药指南》;20120331;第10卷(第9期);第369-370页 |
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