CN103860544A - 五味子乙素抗肝纤维化的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于中药或药物化学领域，涉及五味子乙素或五味子提取物在制备治疗和/或辅助治疗和/或预防肝纤维化或肝硬化的药物、或者治疗或辅助治疗引起肝纤维化或肝硬化的疾病的药物、或者抑制肝星形细胞增殖或DNA合成的药物中的用途。本发明还涉及在体外/体内抑制肝星形细胞增殖或抑制肝星形细胞DNA合成的方法，以及包含五味子乙素或五味子提取物的药物组合物。本发明证明了五味子乙素可以明显改善肝纤维化或肝硬化的程度，并且无明显的肝细胞毒性，具备良好的应用前景。

Description

五味子乙素抗肝纤维化的用途

技术领域

本发明属于中药或药物化学领域，涉及一种中药单体用于抗肝纤维化的用途，具体地，涉及中药单体五味子乙素在制备治疗和/或辅助治疗和/或预防肝纤维化和肝硬化的药物、或者抑制肝星形细胞增殖、或者抑制肝星形细胞DNA合成的药物中的用途。本发明还涉及包含五味子乙素的药物组合物。本发明还涉及一种在体外/体内抑制肝星形细胞增殖或抑制肝星形细胞DNA合成的方法。

背景技术

肝纤维化是以细胞外间质在肝脏过量沉积，导致肝脏结构或(和)功能异常的病理变化，是很多慢性肝病晚期共有的病理改变，是肝硬化的前驱阶段。肝纤维化的病因主要是各种损伤因素引起肝细胞损伤，受损的肝细胞、库普弗细胞（kupffer cell）、窦内皮细胞等在刺激下产生免疫介质和细胞因子，激活了肝星形细胞（Hepatic stellate cell，HSC），使得HSC合成大量细胞外基质（extracellular matrixc，ECM），ECM大量沉积在肝组织中，从而形成肝纤维化，继而肝脏假小叶及结节形成，则成为肝硬化，肝星形细胞的激活是肝纤维化和肝硬化发生的中心环节。

肝纤维化的主要治疗方法可以分为几类：病因治疗、针对肝星形细胞、针对细胞外基质、保护肝细胞等，但目前除γ-干扰素外都未被批准进入临床应用。

目前已经有文献报道中药复方可以改善肝纤维化和肝硬化的发生，但是复方药味较多，一般在3味以上，成分复杂且效果不理想。目前也已有关于中药单体如熊果酸和水飞蓟素等用于肝纤维化治疗的文献报道，但效果也都不理想。

发明内容

本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，发现中药单体五味子乙素有治疗肝纤维化和肝硬化的作用，由此提供了本发明：

本发明一方面涉及五味子乙素或五味子提取物在制备治疗和/或辅助治疗和/或预防肝纤维化和/或肝硬化的药物中的用途。

本发明另一方面涉及五味子乙素或五味子提取物在制备治疗和/或辅助治疗引起肝纤维化和/或肝硬化的疾病的药物中的用途，所述引起肝纤维化和/或肝硬化的疾病包括但不限于病毒性肝炎、酒精性肝病、血吸虫病、自身免疫性肝病、非酒精性脂肪性肝病、先天性铜代谢异常和胆石症等。

本发明再一方面涉及五味子乙素或五味子提取物在制备用于抑制肝星形细胞增殖、或者抑制肝星形细胞DNA合成的药物中的用途。

本发明还涉及一种在体外/体内抑制肝星形细胞增殖或抑制肝星形细胞DNA合成的方法，所述方法包括使用有效量的五味子乙素或五味子提取物的步骤。

本发明还涉及一种药物组合物，其包含五味子乙素或五味子提取物，以及任选的一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂；所述药物组合物用于治疗和/或辅助治疗和/或预防肝纤维化和/或肝硬化、或者用于治疗和/或辅助治疗引起肝纤维化和/或肝硬化的疾病、或者用于抑制肝星形细胞增殖、或者用于抑制肝星形细胞DNA合成。

根据本发明的药物组合物，所述引起肝纤维化和/或肝硬化的疾病包括但不限于病毒性肝炎、酒精性肝病、血吸虫病、自身免疫性肝病、非酒精性脂肪性肝病、先天性铜代谢异常和胆石症等。

根据本发明任一项的药物组合物，其为注射剂、口服液、胶囊、片剂、颗粒剂、或提取物再混合剂型。

本发明还涉及一种治疗和/或辅助治疗和/或预防肝纤维化和/或的方法，包括给予有需要的受试者治疗和/或预防有效量的五味子乙素或五味子提取物。

在本发明中，肝纤维化具有本领域的通常含义，是指肝脏遭到各种致病原的损害后，肝组织修复过程过度及失控时，肝组织内细胞外基质过度增生所致肝脏结构和肝功能异常改变的一种病理过程，临床上轻者称为肝纤维化，重者使肝小叶结构改建，假小叶及结节形成，称为肝硬化。在本发明中，当肝纤维化和肝硬化联合使用时，表示临床疾病中的不同阶段；当肝纤维化单独使用时，表示肝脏的病理状态，其既包括轻度时的肝纤维化，也包括重度时的肝硬化。

在本发明中，所述五味子乙素的分子式为C₂₃H₂₈O₆，结构式为式Ⅰ所示。

在本发明中，所述药材五味子是干的药材，洗净、晒干即可。所述五味子包括南五味子、北五味子等，优选北五味子。

在本发明的实施方案中，所述的五味子提取物中含有五味子乙素，并且五味子乙素是作为有效活性成分的。

在本发明的实施方案中，所述的五味子提取物为五味子的甲醇或乙醇提取物。

在本发明的具体实施方案中，所述的五味子的甲醇或乙醇提取物的制备方法为：

五味子干品粉碎后，用80％－95％甲醇或乙醇回流提取2－4次，每次1－3h，过滤，合并滤液减压蒸除乙醇，再冷冻干燥除尽溶剂，即得到五味子的甲醇或乙醇提取物；任选地，将所得提取物粉碎，过60－100目筛。在本发明的具体实施方案中，所述五味子为北五味子（Schisandra chinensis(Turcz)Baill）。

可采用常规加工方法，制成上述中药单体五味子乙素组成的注射液、口服液、胶囊、片剂、颗粒剂、提取物再混合等剂型。

术语“组合物”意指包括包含指定量的各指定成分的产品，以及直接或间接从指定量的各指定成分的组合产生的任何产品。

通常本发明药物组合物含有0.1－90重量％的有效成分（五味子乙素）。药物组合物可根据本领域已知的方法制备。用于此目的时，如果需要，可将有效成分与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人用的适当的施用形式或剂量形式。

本发明的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、腹膜或直肠等。给药剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂、冻干粉针剂等。可以是普通制剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。为了将给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Ge l uc i re、高岭土、滑石粉等；粘合剂如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。为了将给药单元制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。为了将给药单元制成胶囊，将有效成分与上述的各种载体混合，并将由此得到的混合物置于硬的明明胶囊或软胶囊中。也可将有效成分制成微囊剂，混悬于水性介质中形成混悬剂，亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。为了将给药单元制成注射用制剂，如溶液剂、乳剂、冻干粉针剂和混悬剂，可以使用本领域常用的所有稀释剂，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。

本发明的药物组合物的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重及个体反应，给药途径及给药次数等。上述剂量可以单一剂量形式或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药。剂量水平须根据具体的给药途径、所治疗病况的严重程度以及待治疗患者的病况和既往病史等来选定。但是，本领域的做法是，给药剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。

术语“预防和/或治疗有效量”是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的剂量。

术语“受试者”可以指患者或者其它接受本发明药物组合物以治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的动物，特别是哺乳动物，例如人、狗、猴、牛、马等。

术语“疾病和/或病症”是指所述受试者的一种身体状态，该身体状态与本发明所述疾病和/或病症有关。

但应认识到，本发明的药物组合物的总日用量须由主诊医师在可靠的医学判断范围内作出决定。对于任何具体的患者，具体的治疗有效剂量水平须根据多种因素而定，所述因素包括所治疗的障碍和该障碍的严重程度；所采用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；给药时间、给药途径和排泄率；治疗持续时间；与组合使用或同时使用的药物；及医疗领域公知的类似因素。例如，本领域的做法是，给药的剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。一般说来，本发明的药物组合物以有效成分（五味子乙素）计算用于哺乳动物特别是人的剂量可以介于0.001－1000mg/kg体重/天，例如介于0.01－100mg/kg体重/天，例如介于0.01－10mg/kg体重/天。

根据本发明的药物组合物可以有效地预防和/或治疗本发明所述的各种疾病或病症。

本发明人对五味子乙素的活性进行了深入研究。发明人分离大鼠原代肝星形细胞和肝细胞，并采用血小板衍生生长因子-BB（platelet-derived growth factor-BB，PDGF-BB）诱导肝星形细胞增殖模型，进行以下观察：

1、分离原代大鼠肝星形细胞和肝细胞，建立PDGF-BB诱导肝星形细胞增殖模型；

2、五味子乙素对肝星形细胞增殖模型的DNA合成的作用，证明五味子乙素有抑制肝星形细胞增殖的作用；

3、五味子乙素对肝星形细胞的毒性作用，证明五味子乙素对肝星形细胞有一定的毒性作用；

4、五味子乙素对原代肝细胞的毒性作用，证明五味子乙素无明显肝细胞毒性。

5、五味子乙素对肝纤维化大鼠模型的治疗作用，证明五味子乙素对肝纤维化有治疗作用。

发明的有益效果

本发明证明了五味子乙素或含有五味子乙素的五味子提取物可明显改善肝纤维化或肝硬化的程度，其药效强，且对肝细胞无明显的毒副作用，具有良好的应用前景。

附图说明

图1：原代大鼠肝星形细胞增殖模型的建立。均数±标准差，n=3，单因素方差分析，组间比较采用Dunnett-t检验，＊P＜0.05，＊＊＊P<0.001，和Con比较。

图2：五味子乙素对原代培养的HSC DNA合成的影响。均数±标准差，n=3，单因素方差分析，组间比较采用Dunnett-t检验，＊＊＊P<0.005，和Con比较；###P<0.005，和PDGF-BB比较。

图3.五味子乙素对原代培养的HSC的毒性作用。单因素方差分析，n=3，组间比较采用Dunnett-t检验，＊P<0.05，＊＊＊P<0.001，和Con比较。

图4.五味子乙素对原代培养的肝细胞的毒性作用。均数±标准差，n=3，单因素方差分析，组间比较采用Dunnett-t检验，＊＊＊P<0.001，和Con比较。

图5.五味子乙素对TAA诱导的肝纤维化大鼠模型的ALT和AST水平的影响。均数±标准差，n=10，单因素方差分析，组间比较采用Dunnett-t检验；＊＊＊P<0.001，和Con比较；#P<0.05，##P<0.01，###P＜0.001，和TAA比较。

图6.五味子乙素对肝纤维化大鼠肝脏纤维沉积的影响；

A：正常，B：TAA，C：五味子乙素25mg/kg，D：五味子乙素50mg/kg；E：标本中胶原沉积的面积占总面积的百分比，均数±标准差，n=10，单因素方差分析，组间比较采用Dunnett-t检验；＊＊＊P<0.001，和Con比较；#P<0.05，##P＜0.01，###P<0.001，和TAA比较。

图7.五味子乙素对TAA诱导的肝纤维化大鼠模型的羟脯氨酸水平的影响。n=10，均数±标准差，单因素方差分析，组间比较采用Dunnett-t检验；＊＊＊P<0.001，和Con比较；##P＜0.01，##P<0.01，###P＜0.001，和TAA比较。

图8.五味子乙醇提取物对原代培养的HSC的毒性作用。均数±标准差，n=3，单因素方差分析，组间比较采用Dunnett-t检验，＊＊＊P<0.001，和Con比较。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：原代大鼠肝星形细胞增殖模型的建立

1.试剂和细胞

雄性Wistar大鼠，400g左右，军事医学科学院实验动物中心提供。

96孔板，Corning；Ⅳ型胶原酶，sigma公司；Pronase E，Roche公司；Dnase Ⅰ，Roche公司；DMEM培养液，北京天润善达生物科技有限责任公司；肝素钠，国药集团化学试剂有限公司；PDGF-BB，Peprotech公司。

蠕动泵，保定兰格恒流泵有限公司；多头细胞样品收集器，浙江绍兴ZT-2型；液体闪烁计数仪，PerkinElmer公司，型号：1450-024。

2.实验方法

采用³H-TdR掺入法观察了不同浓度PDGF-BB对HSC DNA合成的影响。方法为采用原位灌流法分离得到原代大鼠HSC（江涛，梁立武，郭顺根，等.肝星形细胞的分离与培养.武警医学院学报，2001,11(1):7.），按1×10⁵个/ml的密度接种于96孔板中，培养72h后，加入PDGF-BB，使其加入反应体系后的浓度分别为1、5、25ng/ml，正常对照组（Con组）加入DMEM高糖培养基，培养20h。每孔加入20μl ³H-TdR，继续培养4h，采用多头细胞收集仪收集细胞于玻璃纤维滤纸上，待滤纸干后，在液体闪烁计数仪上检测其闪烁值。

3.结果。

如图1所示。结果显示，25ng/ml PDGF-BB可以明显促进HSC的DNA合成，从而刺激HSC的增殖，故选择25ng/ml为PDGF-BB刺激HSC增殖模型的造模浓度。

实施例2：五味子乙素对原代培养的HSC增殖模型DNA合成的 影响

1.试剂和细胞

五味子乙素可以商购（购于上海同田生物技术有限公司，货号E-0133，纯度大于97%。）或者参考实施例7的方法制备。以下各实施例中，五味子乙素均为商购。

2.实验方法

采用³H-TdR掺入法观察了五味子乙素对原代HSC增殖模型的DNA合成的影响。方法为采用原位灌流法分离得到原代大鼠肝星形细胞，按1×10⁵个/ml的密度接种于96孔板中，培养72h后，采用PDGF-BB25ng/ml造成肝星形细胞增殖模型，同时加入五味子乙素，使其加入反应体系后的浓度分别为3、10、30μM，培养20h，每孔加入20μl ³H-TdR，继续培养4h，采用多头细胞收集仪收集细胞于玻璃纤维滤纸上，待滤纸干后，在液体闪烁计数仪上检测其闪烁值。正常对照组（Con组）不加入PDGF-BB，仅加入DMEM高糖培养基。

3.实验结果

如图2所示。结果显示，五味子乙素10、30μM可以抑制原代肝星形细胞的DNA合成，提示五味子乙素具有抑制肝星形细胞增殖的作用。

实施例3：五味子乙素对原代培养的HSC的毒性作用

1.实验材料

噻唑蓝（Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide，MTT），Amreaco公司；Ensipire多功能酶标仪，PerkinElmer，型号：2300；其它试剂来源同实施例1。

2.实验方法

采用MTT法观察了五味子乙素对原代HSC的毒性作用。方法为采用原位灌流法分离得到原代大鼠肝星形细胞，按1×10⁵个/ml的密度接种于96孔板中，培养72h后，采用PDGF-BB 25ng/ml造成肝星形细胞的增殖模型，同时加入五味子乙素，使其加入反应体系后的浓度分别为3、10、30μM，培养20h，每孔加入20μl 0.25％MTT，继续培养4h，加入10％SDS 150μl培养过夜，采用酶标仪在570nm检测其吸光度。其中对照组（Con组）为不加药物组。

3.结果。

如图3所示。结果显示，五味子乙素对HSC有一定细胞毒的作用，提示五味子乙素可降低HSC的活力，从而减缓肝纤维化的程度。

实施例4：五味子乙素对原代培养肝细胞的毒性作用

1.实验材料

MTT，Amresco公司，Ensipire多功能酶标仪，PerkinElmer，型号：2300；其它试剂来源同实施例1。

2.实验方法

采用MTT法观察了五味子乙素对原代培养的大鼠肝细胞的毒性作用，方法为采用原位灌流法分离得到原代大鼠肝细胞，按5×10⁵个/ml的密度接种于96孔板中，培养24h，换用新鲜培养基，同时加入五味子乙素3、10、30μM，继续培养20h，每孔加入20μl 0.25％MTT，继续培养4h，加入10％SDS 150μl培养过夜，采用酶标仪在570nm检测其吸光度。其中对照组（Con组）为不加药物组。

3.结果。

如图4所示。结果显示，五味子乙素对肝细胞活力无明显影响，提示五味子乙素无肝细胞毒性。

实施例1-4的实验结果显示，五味子乙素可以有效抑制HSC的DNA合成，对HSC发挥细胞毒作用，且对原代肝细胞无明显影响，从而可能在治疗肝纤维化方面具有一定作用。

实施例5：五味子乙素对肝纤维化大鼠模型的治疗作用

1.实验材料

Wistar大鼠，清洁级，雄性，周龄4-5w，体重180-220g；自由饮水，光照时间随昼夜变化。

硫代乙酰胺（thioacetamide，TAA），百灵威生物科技有限公司；谷丙转氨酶（Alanine Aminotransferase，ALT）测定试剂盒（赖氏法），南京建成生物工程研究所；谷草转氨酶（AST/GOT）测定试剂盒（赖氏法），南京建成生物工程研究所；羟脯氨酸测试盒（碱水解法），南京建成生物工程研究所。

2.实验方法

大鼠共分为4组，分别为正常组（Con组）、模型组、五味子乙素25mg/kg组、五味子乙素50mg/kg组，每组10只大鼠，正常饲养。造模方法为TAA 200mg/kg腹腔注射，每周3次，共持续6周，五味子乙素给药方法为灌胃给药，每日1次，从造模后第3周开始，至造模后第6周结束，共持续4周，模型组造模后不给药。实验结束时，取大鼠血液，检测其血清ALT、AST水平；处死大鼠，取其部分肝脏，采用4％多聚甲醛固定，天狼猩红染色观察动物肝脏的胶原沉积情况，并采用图片分析软件测量肝脏内胶原沉积的面积占肝脏总面积的百分比，以了解肝纤维化的程度，部分肝脏检测羟脯氨酸水平；

3．实验结果

观察五味子乙素对肝纤维化大鼠生化指标、胶原沉积和羟脯氨酸含量的影响

3.1五味子乙素对肝纤维化大鼠血清生化指标的影响

如图5所示，结果表明，五味子乙素能降低肝纤维化大鼠的ALT和AST水平，表明五味子乙素能减轻TAA诱导的肝纤维化大鼠模型的肝细胞损伤，减轻TAA诱导的肝纤维化大鼠模型的肝脏损伤的程度。

3.2五味子乙素对肝纤维化大鼠肝脏纤维沉积的影响。

天狼猩红染色病理切片如图6所示，对其结果采用Image Plo Plus图像分析软件处理，每个标本随机选取5个视野，计算标本中胶原沉积的面积占总面积的百分比（图6E）。结果表明，五味子乙素组大鼠肝脏胶原沉积明显减少，尤其五味子乙素大剂量组胶原沉积几乎完全消失，表明五味子乙素可明显减少肝纤维化大鼠肝脏的纤维化程度。

3.3五味子乙素对肝纤维化大鼠肝脏羟脯氨酸含量的影响

羟脯氨酸为胶原纤维所独有，测定羟脯氨酸的含量，可反映肝纤维化的程度。采用碱水解法观察了五味子乙素对肝纤维化大鼠肝脏羟脯氨酸含量的影响，如图7所示，结果发现五味子乙素低、高浓度都能明显降低大鼠肝脏羟脯氨酸的含量，提示五味子乙素能降低大鼠的肝纤维化程度。

实施例5的实验结果表明，五味子乙素能降低TAA诱导的肝纤维化大鼠模型的ALT和AST水平，从而降低大鼠肝脏损伤的程度，也能降低肝纤维化大鼠模型的胶原沉积及羟脯氨酸的含量，从而减轻肝纤维化的程度，以上结果表明五味子乙素对肝纤维化有治疗作用。

综合实施例1-5的实验结果，五味子乙素可以有效抑制HSC的DNA合成，对原代肝细胞无明显毒性作用，能降低TAA诱导的肝纤维化大鼠模型的纤维化程度，从而在治疗肝纤维化方面具有一定作用。

实施例6：五味子乙醇提取物对原代HSC的毒性作用

1.实验材料

MTT，Amresco公司；Ensipire多功能酶标仪，PerkinElmer，型号：2300；其它试剂来源同实施例1。

2.五味子提取物的制备

五味子干品粗粉1kg，用90％乙醇回流提取3次，每次2h，过滤，合并滤液减压蒸除乙醇，残留物（乙醇总提取物）冷冻干燥除尽溶剂，得到五味子干燥提取物，粉碎，过80目筛，即得，其得率约为20%。

3.实验步骤

采用原位灌流法分离得到原代大鼠肝星形细胞，按1×10⁵个/ml的密度接种于96孔板中，培养基为含20％FBS的DMEM高糖培养基，37℃、5％CO₂培养箱培养24h，换为含0.5％FBS的DMEM高糖培养基，37℃、5％CO₂培养箱培养48h，加入五味子的乙醇提取物，使其加入反应体系后的药物浓度为0.2、2、20μg/ml，正常对照（Con）组加入DMEM高糖培养基。培养20h，每孔加入20μl 0.25％MTT，继续培养4h，加入10％SDS 150μl培养过夜，采用酶标仪在570nm检测其吸光度。

4.结果

由图8可见，五味子乙醇提取物有一定抑制HSC活力的作用。

实施例7：从五味子中提取五味子乙素的提取工艺

取五味子的干燥果实，粉碎机进行粉碎后，过40目筛，取过筛之后的五味子粉末10g，加入90％的乙醇50ml，回流提取2.5h，提取次数为3次，合并滤液，减压蒸除乙醇，将残留物溶于200ml甲醇中，以1.0mL/min的流速上柱，大孔树脂AB-8吸附150min，吸附之后利用蒸馏水60ml以0.5mL/min的流速进行洗脱，收集过柱流出液，干燥得纯度为97％的白色粉末。其结构经NMR和MS测定即为目的化合物五味子乙素。

实施例8：五味子乙素注射剂的制备

（1）将吐温-800.1ml、司盘-80、胆固醇及脑磷脂溶于适量的磷酸盐缓冲液中，制成未包封药物的多相脂质体。

（2）将五味子乙素3g、吐温-8000.1ml、聚乙烯毗咯烷酮（PVP）溶于60ml磷酸盐缓冲液中。

（3）将上述制备的脂质体、五味子乙素磷酸盐缓冲液经流通蒸汽灭菌处理后，再将灭菌液经超声法处理两次，每次10min。

（4）在无菌条件下，往65℃熔融状态的脂质体中加入五味子乙素磷酸盐缓冲溶液和海藻糖、冻结保护剂。

（5）加入磷酸盐缓冲液至100ml后，过滤灌注安瓿中，每支1ml。快速冷冻，再升温至一定温度，最后在真空条件下冻干即得。

实施例9：五味子乙素胶囊的制备

将五味子乙素（粉末），混合均匀，装入胶囊即得。

实施例10：五味子乙素片剂的制备

取五味子乙素3g，与PEG4000.1ml、PVP和β-CD，混合均匀，制成固定分散物，粉碎过80目筛，采用干法粉末直接压片。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (8)

1.五味子乙素或五味子提取物在制备治疗和/或辅助治疗和/或预防肝纤维化和/或肝硬化的药物中的用途。

2.五味子乙素或五味子提取物在制备治疗和/或辅助治疗引起肝纤维化和/或肝硬化的疾病的药物中的用途，所述引起肝纤维化和/或肝硬化的疾病包括但不限于病毒性肝炎、酒精性肝病、血吸虫病、自身免疫性肝病、非酒精性脂肪性肝病、先天性铜代谢异常和胆石症。

3.五味子乙素或五味子提取物在制备用于抑制肝星形细胞增殖、或者抑制肝星形细胞DNA合成的药物中的用途。

4.一种在体外/体内抑制肝星形细胞增殖或抑制肝星形细胞DNA合成的方法，所述方法包括使用有效量的五味子乙素或五味子提取物的步骤。

5.药物组合物，其包含五味子乙素或五味子提取物，以及任选的一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂；所述药物组合物用于治疗和/或辅助治疗和/或预防肝纤维化和/或肝硬化、或者用于治疗和/或辅助治疗引起肝纤维化和/或肝硬化的疾病、或者用于抑制肝星形细胞增殖、或者用于抑制肝星形细胞DNA合成。

6.权利要求5的药物组合物，其为注射剂、口服液、胶囊、片剂、颗粒剂、或提取物再混合剂型。

7.根据权利要求1-3任一项的用途、权利要求4的方法或权利要求5-6的药物组合物，其中所述的五味子提取物为五味子的甲醇或乙醇提取物。

8.根据权利要求7的用途、方法或药物组合物，其中所述的五味子的甲醇或乙醇提取物的制备方法为：

五味子干品粉碎后，用80％－95％甲醇或乙醇回流提取2－4次，每次1－3h，过滤，合并滤液减压蒸除乙醇，再冷冻干燥除尽溶剂，即得到五味子的甲醇或乙醇提取物；任选地，将所得提取物粉碎，过60－100目筛。

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