KR20200002761A - 지방줄기세포유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 간 섬유증 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
지방줄기세포유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 간 섬유증 예방 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 지방줄기세포유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 간 섬유증 예방, 개선, 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 지방줄기세포유래 엑소좀은 간 섬유증 치료를 위한 유전정보, 단백질, 및 성장인자 등이 담지되어 있어 간 섬유증 동물 모델에서 우수한 간 섬유증 치료효과를 나타내었으며, 상기 엑소좀은 세포유래 물질이므로 생체적합성이 좋고 흡수율 또한 뛰어난 장점이 있다.
따라서, 현재 사용되고 있는 치료 약물의 한계점 또는 줄기세포 자체를 이용한 치료에서 발생할 수 있는 줄기세포의 암세포화 또는 세포 노폐물에 의한 부작용을 최소화 할 수 있으며, 수술 없이 간단하게 적용 가능한 정맥주사요법 또는 국소투여방식 등을 통해 자연적으로 간에 전달할 수 있으므로 경제적 비용 절감 및 환자의 부담감도 줄일 수 있다. 결국, 본 발명에 따른 지방줄기세포유래 엑소좀은 간 섬유증의 예방, 개선, 또는 치료용도로 유용하게 이용될 수 있을 것이다.
따라서, 현재 사용되고 있는 치료 약물의 한계점 또는 줄기세포 자체를 이용한 치료에서 발생할 수 있는 줄기세포의 암세포화 또는 세포 노폐물에 의한 부작용을 최소화 할 수 있으며, 수술 없이 간단하게 적용 가능한 정맥주사요법 또는 국소투여방식 등을 통해 자연적으로 간에 전달할 수 있으므로 경제적 비용 절감 및 환자의 부담감도 줄일 수 있다. 결국, 본 발명에 따른 지방줄기세포유래 엑소좀은 간 섬유증의 예방, 개선, 또는 치료용도로 유용하게 이용될 수 있을 것이다.
Description
본 발명은 지방줄기세포유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 간 섬유증 예방, 개선, 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
간 섬유화는 만성 염증으로 인한 세포외 기질(extracellular matrix)의 과다한 침착에 의해 유발되는 것으로서, 이러한 만성 간질환이 지속되는 경우 결국 간 내 구조의 변형과 간세포수의 감소로 인해 간경변(liver cirrhosis)으로 진행된다. 이러한 만성 간질환은 하나의 독립적인 질환이기보다는 만성 B형 또는 C형 간염, 지속적인 과음과 간 독성 물질의 사용 등으로 인해 만성 간염에서부터 섬유화를 거쳐 간경변증으로 진행되는 연속적인 질환으로 볼 수 있다.
현재 간염 및 간경변증에 대한 치료는 증상의 진행 및 그로 인간 간 기능의 저하를 최대한 늦추는데 있으며, 간경변증의 경우 원인에 따라 페그인터페론(Peginterferon)이나 항바이러스제와 같은 약물을 사용하고 심할 경우 간 이식을 통해 완치에 이르는 방법이 있다. 그러나, 약물치료의 경우 치료저항성이 나타날 수 있고 간 이식은 공여자의 부족 및 수술에 따른 위험과 비용을 감수 해야 하는 한계점이 있어 새로운 치료법의 필요성이 대두되고 있다.
줄기세포를 이용한 간 재생 치료법은 최근 들어 많은 주목을 받고 있는 치료법으로서, 주입된 줄기세포가 손상 받은 간에서 기능적 간세포로 분화하여 재구성됨으로써 치료 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 현재까지 시험관 내에서는 높은 효율로 줄기세포를 기능성 간세포 분화시킨 결과들이 보고되어 왔으나(한국 등록특허10-1542849), 줄기세포를 동물 모델 또는 사람에 이식하는 경우 실제로 간세포 분화의 효율성이 낮다는 문제점이 존재하였다. 더욱이 간 줄기세포의 정확한 표지자가 규정되어 있지 않아 간세포로 증식, 분화하는 줄기세포를 정확히 알지 못하는 단점이 존재하였다.
이외에도 일반적으로 종래의 줄기세포를 이용한 치료의 가장 큰 문제점은 세포의 체내 생착률 및 생존률이 환자에 따라 일정하지 않아 정확한 효능을 입증하지 못한다는 것이고, 또한 줄기세포의 암세포화에 대한 가능성을 배제할 수 없으며 줄기세포로부터 분비된 다양한 성장인자를 포함한 배양액은 성장인자뿐 아니라 여러 가지 세포 노폐물들이 포함되어 있으므로 잠정적인 문제들을 초래할 수 있다.
이에, 줄기세포를 이용한 간질환 치료의 한계점을 해결할 수 있는 새로운 치료적 접근방법이 필요한 실정이었다.
상기와 같은 종래의 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명자들은 인간 지방줄기세포에서 분리한 엑소좀을 이용하여 간 섬유증에 대한 치료효과를 평가하였으며, 인간 간성상세포주와 간 섬유증 동물 모델에서 상기 엑소좀 투여에 의한 우수한 치료효과를 확인하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 지방줄기세포유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 간 섬유증 예방, 개선, 또는 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 지방줄기세포유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 간 섬유증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 지방줄기세포유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 간 섬유증 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 지방줄기세포는 인간 지방줄기세포일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 조성물은 혈중 아스파르트산염 아미노기 전달 효소(Aspartate aminotransferase; AST), 혈중 알라닌 아미노기전달효소(Alanine aminotransferase; ALT), 알칼리성 인산가수분해효소(Alkaline phosphatase; ALP), 총 빌리루빈(Total bilirubin; TP), 또는 LW/BW(Ratio of liver weight to body weight) 수준을 감소시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 지방줄기세포유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 간 섬유증 예방 또는 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 지방줄기세포유래 엑소좀의, 간 섬유증 예방 또는 치료용도를 제공한다.
본 발명에 따른 지방줄기세포유래 엑소좀은 간 섬유증 치료를 위한 유전정보, 단백질, 및 성장인자 등이 담지되어 있어 간 섬유증 동물 모델에서 우수한 간 섬유증 치료효과를 나타낼 수 있고, 상기 엑소좀은 세포유래 물질이므로 생체적합성이 좋고 흡수율 또한 뛰어난 장점이 있다.
따라서, 현재 사용되고 있는 치료 약물의 한계점을 극복할 수 있고, 줄기세포 자체를 이용한 치료에서 발생할 수 있는 줄기세포의 암세포화 또는 세포 노폐물에 의한 부작용을 최소화 할 수 있다. 또한, 수술 없이 간단하게 적용 가능한 정맥주사요법 또는 국소투여방식 등을 통해 자연적으로 간에 전달할 수 있으므로 치료 비용 절감의 효과도 가질 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 지방줄기세포유래 엑소좀은 간 섬유증의 예방, 개선, 또는 치료용도로 유용하게 이용될 수 있을 것이다.
도 1은, 인간 지방줄기세포로부터 추출된 엑소좀의 물리, 생화학적 특성을 전자현미경 및 나노입자추적분석기를 이용하여 확인한 결과이다.
도 2는, TGF-β1에 의해 유도된 활성화된 간성상세포인 LX-2에 발현된 α-smooth muscle actin(α-SMA)를 확인하기 위하여, 인간 지방줄기세포유래 엑소좀(A-Exosome)을 농도별로 처리하여 α-SMA발현량이 줄어드는 것을 면역 형광법을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은, 간섬유증과 관련된 간성상세포주인 LX-2의 정량적인 mRNA 변화를 확인하기 위해, 실시간 중합효소 연쇄반응 평가를 진행한 결과이다.
도 4는, 인간 지방줄기세포유래 엑소좀과 타조직줄기세포유래 엑소좀과의 효능을 비교 평가하기 위하여, 면역형광 평가를 진행하여 α-SMA의 발현량을 확인한 결과이다.
도 5는, 인간 지방줄기세포유래 엑소좀과 타조직줄기세포유래 엑소좀과의 효능을 비교 평가하기 위하여, 실시간 중합효소 연쇄반응 평가를 진행하여 α-SMA, Collagen 1의 발현량을 확인한 결과이다.
도 6은, 정상 모델과 간섬유증 유발모델을 대상으로 한 인간 지방줄기세포유래 엑소좀의 생체 내 거동을 확인하기 위하여, 형광으로 표지한 인간 지방줄기세포유래 엑소좀을 각각의 모델에 정맥 투여한 후 24시간 째에 주요 장기를 확보하여 형광량을 확인한 결과이다.
도 7은, 인간 지방줄기세포유래 엑소좀의 간섬유증 마우스 모델을 대상으로 한 항섬유화 효과를 확인하기 위하여 수립한 동물 실험 모식도를 나타낸 것이다.
도 8은, 정상모델 및 간 섬유증 마우스 모델에 엑소좀을 3회 투여하고, 처음 투여한지 5일 후 혈액을 채취하여 혈중 AST(Aspartate aminotransferase), ALT(Alanine aminotransferase), ALP(Alkaline phosphatase), TBIL(Total bilirubin), TP(Total protein) 및 LW/BW (Ratio of liver weight to body weight) 수준을 측정한 결과이다.
도 9a는, 정상모델 및 간 섬유증 마우스 모델에 엑소좀을 일정 횟수 투여하고, 처음 투여한지 5일 후 간을 적출하여 육안으로 관찰한 이미지이다.
도 9b는, 확보한 간 조직에 대한 H&E 염색, Masson's trichrome (MT) 염색 및 α-SMA염색을 실시한 후 광학현미경으로 관찰한 결과이다.
도 9c는, MT에 의한 collagen의 양과 α-SMA의 양을 전체면적과 비교해 정량 그래프로 나타낸 것이다.
도 2는, TGF-β1에 의해 유도된 활성화된 간성상세포인 LX-2에 발현된 α-smooth muscle actin(α-SMA)를 확인하기 위하여, 인간 지방줄기세포유래 엑소좀(A-Exosome)을 농도별로 처리하여 α-SMA발현량이 줄어드는 것을 면역 형광법을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은, 간섬유증과 관련된 간성상세포주인 LX-2의 정량적인 mRNA 변화를 확인하기 위해, 실시간 중합효소 연쇄반응 평가를 진행한 결과이다.
도 4는, 인간 지방줄기세포유래 엑소좀과 타조직줄기세포유래 엑소좀과의 효능을 비교 평가하기 위하여, 면역형광 평가를 진행하여 α-SMA의 발현량을 확인한 결과이다.
도 5는, 인간 지방줄기세포유래 엑소좀과 타조직줄기세포유래 엑소좀과의 효능을 비교 평가하기 위하여, 실시간 중합효소 연쇄반응 평가를 진행하여 α-SMA, Collagen 1의 발현량을 확인한 결과이다.
도 6은, 정상 모델과 간섬유증 유발모델을 대상으로 한 인간 지방줄기세포유래 엑소좀의 생체 내 거동을 확인하기 위하여, 형광으로 표지한 인간 지방줄기세포유래 엑소좀을 각각의 모델에 정맥 투여한 후 24시간 째에 주요 장기를 확보하여 형광량을 확인한 결과이다.
도 7은, 인간 지방줄기세포유래 엑소좀의 간섬유증 마우스 모델을 대상으로 한 항섬유화 효과를 확인하기 위하여 수립한 동물 실험 모식도를 나타낸 것이다.
도 8은, 정상모델 및 간 섬유증 마우스 모델에 엑소좀을 3회 투여하고, 처음 투여한지 5일 후 혈액을 채취하여 혈중 AST(Aspartate aminotransferase), ALT(Alanine aminotransferase), ALP(Alkaline phosphatase), TBIL(Total bilirubin), TP(Total protein) 및 LW/BW (Ratio of liver weight to body weight) 수준을 측정한 결과이다.
도 9a는, 정상모델 및 간 섬유증 마우스 모델에 엑소좀을 일정 횟수 투여하고, 처음 투여한지 5일 후 간을 적출하여 육안으로 관찰한 이미지이다.
도 9b는, 확보한 간 조직에 대한 H&E 염색, Masson's trichrome (MT) 염색 및 α-SMA염색을 실시한 후 광학현미경으로 관찰한 결과이다.
도 9c는, MT에 의한 collagen의 양과 α-SMA의 양을 전체면적과 비교해 정량 그래프로 나타낸 것이다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 발명자들은 간 섬유증 치료에 있어서 현재 사용되고 있는 치료약물 또는 줄기세포 자체를 이용한 세포치료의 문제점을 극복하기 위한 방안을 예의 연구한 결과, 인간 지방줄기세포유래 엑소좀의 간 섬유증 치료효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
이하 발명의 구체적인 구현예에 따른 간 섬유증 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관하여 보다 상세하게 설명하기로 한다.
구체적으로, 본 발명의 일 구현예에서는, 인간 지방줄기세포를 배양하고 세포 배양 상층액을 회수하고 상기 세포로부터 분비된 엑소좀을 분리 및 정제하여(실시예 1 참조), 상기 엑소좀의 항섬유화 효과를 in vitro 세포 실험 및 in vivo 마우스 모델을 통해 확인하였다.
또한, α-SMA의 발현량을 광학현미경을 이용한 면역형광 평가를 통해 확인하였고, 실시간 중합효소 연쇄반응을 통해 섬유화 관련 mRNA의 양을 정량적으로 검증하여, TGF-β1을 처리하여 활성화된 간성상세포에서는 α-SMA의 발현량이 크게 증가하였음을 확인하였으며, 인간 지방줄기세포유래 엑소좀의 처리 농도가 높아짐에 따라 α-SMA의 발현량이 현저히 줄어드는 것을 증명하였다(실시예 2 참조).
아울러, 섬유화관련 인자인 α-SMA, Collagen 1, MMP-2의 RNA양이 TGF-β1을 처리하여 간성상세포를 활성화시킨 경우 크게 증가하였지만, 동일 조건에서 인간 지방줄기세포유래 엑소좀을 농도별로 처리하였을 때, 유의하게 감소하는 것을 확인하였고 이러한 경향은 엑소좀의 농도가 높아짐에 따라 더 효과적임을 확인하였다(실시예 2 참조).
한편, 본 발명의 일구현예로, 상기 지방줄기세포는 인간 지방줄기세포일 수 있다. 인간 지방줄기세포 유래 엑소좀은 탯줄줄기세포유래 엑소좀 또는 골수줄기세포유래 엑소좀과 같은 타조직줄기세포유래 엑소좀에 비해 섬유화로 인해 활성화된 간성상세포의 섬유화 관련 인자들의 수치를 낮춤에 따라 간 섬유화를 효과적으로 완화 시킬 수 있다.
또한, 본 발명에서 사용되는 인간 지방줄기세포유래 엑소좀과 타조직줄기세포유래 엑소좀과의 항섬유화 비교 평가를 위하여, 면역 형광 평가와 실시간 중합효소 연쇄반응을 통해 그 효과를 비교하기 위한 실험을 진행하여, 인간 지방줄기세포유래 엑소좀이 타조직줄기세포유래 엑소좀인 탯줄줄기세포유래 엑소좀 또는 골수줄기세포유래 엑소좀보다 α-SMA의 형광량이 현저히 감소되는 것을 관찰하였고, 인간 지방줄기세포유래 엑소좀은 타조직줄기세포유래 엑소좀에 비해 섬유화로 인해 활성화된 간성상세포의 섬유화 관련 인자들의 수치를 낮춤에 따라 간 섬유화를 효과적으로 완화시킴을 확인하였다(실시예 3 참조).
한편, 본 발명은 지방줄기세포유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 간 섬유증 예방 또는 치료방법을 제공한다.
인간 지방줄기세포유래 엑소좀의 투여는 섬유성 격막의 형성을 효과적으로 억제할 뿐만 아니라 간세포의 구조적 형태 또한 잘 유지시켜 간 조직의 섬유화를 효과적으로 억제함에 따라 정상 조직의 형태로 잘 유지시킬 수 있다.
한편, 인간 지방줄기세포 및 인간 지방줄기세포유래 엑소좀은 간 기능 개선 효과를 가지지만, 양자를 비교할 경우 인간 지방줄기세포보다 인간 지방줄기세포유래 엑소좀을 투여한 경우, 간 기능이 더욱 효과적으로 개선될 수 있다(실시예 5 참조).
또한, 본 발명에 따른 간 섬유증 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 혈중 아스파르트산염 아미노기 전달 효소 (Aspartate aminotransferase; AST), 혈중 알라닌 아미노기전달효소(Alanine aminotransferase; ALT), 알칼리성 인산가수분해효소(Alkaline phosphatase; ALP), 총 빌리루빈 (Total bilirubin; TP), 또는 LW/BW (Ratio of liver weight to body weight) 수준을 감소시킬 수 있다.
이에, 본 발명은 지방줄기세포유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 간 섬유증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 간 섬유증을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 간 섬유증에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "줄기세포"란, 개체를 구성하는 세포나 조직의 근간이 되는 세포로서 그 특징은 반복 분열하여 자가 재생(self-renewal)할 수 있고, 환경에 따라 특정한 기능을 지닌 세포로 분화할 수 있는 다분화 능력을 갖는 세포를 의미한다. 태아의 발생과정 중 모든 조직에서 생겨나며, 성인이 되어서도 골수, 상피조직 등 세포가 활발히 교체되는 일부 조직에서 발견된다. 줄기세포는 분화 가능한 세포의 종류에 따라 수정란이 첫 분열을 시작할 때 형성되는 전능성 줄기세포(totipotent stem cells)와, 이 세포들이 계속 분열해 만들어진 포배 내막에 있는 만능성 줄기세포(pluripotent stem cells), 그리고 성숙한 조직과 기관 속에 존재하는 다능성 줄기세포(multipotent stem cells)로 분류된다. 이때, 다능성 줄기세포는, 이 세포가 포함되어 있는 조직 및 기관에 특이적인 세포로만 분화할 수 있는 세포로써 태아기, 신생아기 및 성체기의 각 조직 및 장기의 성장과 발달은 물론 성체조직의 항상성 유지와 조직 손상 시 재생을 유도하는 기능에 관여하고 있다. 이러한 조직 특이적 다능성 세포들을 총칭하여 성체 줄기세포라고도 한다.
성체 줄기세포로 분류되는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)는 재생의학의 재료로 각광받고 있는 세포로, 골수, 제대혈, 지방조직, 탯줄 등의 조직에서 채취될 수 있으며, 혈액 줄기세포와 달리 지방세포, 골세포, 연골세포, 신경세포, 심근세포 등 다양한 인체 조직을 구성하는 세포로의 분화능을 가진다. 본 발명에서는 인간 지방조직으로부터 분리한 줄기세포를 이용하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, "엑소좀(exosome)"이란, 혈액, 소변, 및 세포의 배양액을 포함하는 거의 모든 진핵세포액에 존재하는 세포유래 소포(vesicles)로서, 평균적으로 30 내지 100 nm의 직경을 갖는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포의 다소포체(multivesicular body)가 원형질막에 융합되어 분비되거나 원형질막으로부터 직접적으로 분비되며, 응집, 세포 내 신호전달, 세포 노폐물 관리 등의 과정에서 중요한 특정 기능을 수행한다고 보고되어 왔기 때문에 임상적으로 특정 질환의 바이오마커, 진단, 치료 용도로 주목받고 있다. 본 발명에 있어서, 엑소좀은 인간 지방줄기세포를 배양함으로써 상기 세포로부터 자연적으로 분비된 것일 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 지방줄기세포유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하며, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립, 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제, 흡입제, 피부 외용제, 또는 경구 섭취제 등으로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 피부, 비강, 기도에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다.
상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 kg 당 0.001 내지 150 mg, 바람직하게는 0.01 내지 100 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 지방줄기세포유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 간 섬유증 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "개선"이란, 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 건강기능식품 조성물에서 유효성분을 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 유효성분을 함유하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로오스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
상기 외에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 지방줄기세포유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 간 섬유증 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예
1 : 인간
지방줄기세포유래
엑소좀의
제조 및 물리, 생화학적 특성 분석 평가
인간 지방줄기세포로부터 엑소좀을 추출하기 위해, 상기 인간 지방줄기세포를 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 배지(Gibco, Cat#: 11995065)에서 배양하고, 엑소좀을 추출하기 24시간 전에 혈청, 항생제, 및 페놀레드(phenol red)가 포함되지 않은 DMEM 배지(Gibco Cat#: 31053028)로 교체하여 24시간 동안 배양하였다.
이후 세포 배양 상층액을 회수하여 4℃, 3000 xg 조건에서 10분 동안 원심분리를 진행 한 후, 0.2 μm 필터를 이용하여 배양배지 내 세포 잔해물 및 노폐물을 제거하였다. 다음으로, 상기 배양액을 Tangential Flow Filtration System (TFF System)을 이용해 엑소좀을 추출 및 정제하였다. 한편, 인간 지방줄기세포로부터 배양 상층액을 회수한 후, 다시 일반 배양배지 DMEM을 첨가 후 세포를 배양하였으며, 이러한 과정을 계대배양 8회까지 반복하여 엑소좀을 추출하였다.
상기의 과정을 통해 인간 지방줄기세포로부터 추출된 엑소좀(Adipose-derived stem cell exosome; A-Exo)의 물리, 생화학적 특성을 전자현미경 및 나노입자추적분석기를 통해 확인하였다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 엑소좀은 구형의 평균 200 nm 이하의 크기를 가지는 것을 확인하였고, 이를 통해 인간 지방줄기세포로부터 엑소좀이 성공적으로 추출되었음을 확인하였다.
실시예
2 : 인간
간성상
세포주를 대상으로 한 인간
지방줄기세포유래
엑소좀의
면역 형광 및 실시간 중합효소 연쇄반응 평가
상기 실시예 1에서 추출한 엑소좀이 실제 간섬유화 과정에서 간손상에 의해 활성화되어 콜라겐 및 간 섬유화 인자등의 분출에 크게 관여하는 것으로 알려진 인간 간성상 세포(human hepatic stellate cell)에 끼치는 영향을 확인하기 위해, 관련 세포주인 LX-2를 이용하여 항섬유화 효능평가를 진행하였다.
구체적으로, 인간 지방줄기세포유래 엑소좀이 간섬유화로 인해 활성화된 간성상세포로부터 발생되는 섬유화인자인 α-Smooth Muscle Actin(α-SMA) 발현량에 미치는 영향을 확인하기 위해, 면역형광(Immunofluorescence) 방법을 이용해 그 정도를 평가하였다.
α-SMA는 활성화된 간성상 세포에서 발현되는 인자 중 하나이며 간 섬유증이 유발될수록 많은 양이 발현되는 것으로 알려져 있어, 본 실험에서는 간성상세포주인 LX-2를 TGF-β1을 1ng/mL를 처리한 DMEM 배지에 2 x 105개/well의 세포를 심고, 24시간 동안 배양 후, DPBS로 1 또는 2회 세척하였다.
이후, 인간 지방줄기세포유래 엑소좀을 각각 1 x 106개/mL, 1x 107개/mL의 농도로 분산시킨 후 2 mL/well로 처리하고, 48시간 동안 배양시켰다. 이후, 최종적으로 Anti-actin α-Smooth Muscle (α-SMA, A2547, Sigma aldrich, USA)을 처리하여 12시간 동안 반응한 뒤, 2차 형광항체 Anti-Cyanine2를 반응시켜 조직슬라이드를 완성하였으며, 그 형태는 Confocal laser microscopy를 통해 확인하였다.
그 결과 도 2에서 나타낸 바와 같이, TGF-β1을 처리하여 활성화된 간성상세포에서는 α-SMA의 발현량이 크게 증가하였음을 확인하였으며, 인간 지방줄기세포유래 엑소좀의 처리 농도가 높아짐에 따라 α-SMA의 발현량이 현저히 줄어드는 것을 알 수 있었다(TFG-β1: TGF-β1만 처리한 군, A-Exosome (1 x 106) 및 A-Exosome (1 x 107) : 인간 줄기세포유래 엑소좀을 1 x 106∼107개/ml 로 처리한 군).
또한, 활성화된 간성상세포 LX2에 대한 인간 지방줄기세포유래 엑소좀의 항섬유화 효과를 정량적으로 확인하기 위하여, 섬유화 관련 인자인 α-SMA, Collagen 1, MMP-2를 대상으로 실시간 중합효소 연쇄반응 평가를 진행하였으며, 간 섬유증과 관련된 섬유화 인자인 α-SMA, Collagen 1, Matrix Metalloproteinase-2(MMP-2)를 대상으로 엑소좀을 처리한 후의 mRNA 발현량 변화를 확인하였다.
그 결과 도 3에서 나타낸 바와 같이, TGF-β1을 처리하여 간성상세포를 활성화시킨 경우 섬유화관련 인자인 α-SMA, Collagen 1, MMP-2의 RNA양이 크게 증가하였지만, 동일 조건에서 인간 지방유래 줄기세포 엑소좀을 농도별(106-107)로 처리하였을 때, 유의하게 감소하는 것을 확인하였고, 이러한 경향은 엑소좀의 농도가 높아짐에 따라 더 효과적임을 확인하였다(Control : PBS를 처리한 군, TFG-β1 : TGF-β1만 처리한 군, A-Exosome (1 x 106) ∼ A-Exosome (1 x 107) : 인간 줄기세포유래 엑소좀을 1 x 106∼107개/ml 로 처리한 군).
실시예
3 : 인간
지방줄기세포유래
엑소좀과
인간
타조직줄기세포유래
엑소좀의
in vitro 항섬유화 효능 비교 평가
본 발명에 따른 인간 지방줄기세포유래 엑소좀이 인간 타조직줄기세포유래 엑소좀과 비교하여 항섬유화 효과가 뛰어남을 비교 실험하기 위하여, 실험군으로 인간 골수줄기세포(Bone-marrow stem cell exosome : B-Exosome)와 인간 탯줄줄기세포(Umbilical-cord stem cell exosome : U-Exosome)로부터 각각 추출된 엑소좀들을 제조하여, 상기 실시예 2의 면역 형광 및 실시간 중합효소 연쇄반응 실험을 통해 비교 평가하였다.
그 결과 도 4에서 나타낸 바와 같이, 인간 지방줄기세포유래 엑소좀이 인간 탯줄줄기세포유래 엑소좀 또는 인간 골수줄기세포유래 엑소좀보다 α-SMA의 형광량이 현저히 감소되는 것을 관찰하였으며, 이러한 형광량의 감소는 엑소좀의 농도가 높아짐에 따라 뚜렷하게 나타남을 확인하였다(A-Exosome (1 x 106) ∼ A-Exosome (1 x 107): 인간 지방줄기세포유래 엑소좀을 1 x 106∼107개/ml 로 처리한 군, B-Exosome (1 x 106) ∼ B-Exosome (1 x 107) : 인간 골수줄기세포유래 엑소좀을 1 x 106∼107개/ml 로 처리한 군, U-Exosome (1 x 106) ∼ U-Exosome (1 x 107) : 인간 탯줄줄기세포유래 엑소좀을 1 x 106∼107개/ml 로 처리한 군).
아울러, 이러한 경향은 정량적인 RNA 양 비교를 통해 추가로 검증하였다. 특히 도 5에서 나타낸 바와 같이, α-SMA와 Collagen 1의 RNA 양은 인간 지방줄기세포유래 엑소좀(107)을 처리하였을 경우에 인간 타조직줄기세포유래 엑소좀에 비해 더 효과적으로 감소되는 것을 확인하였다(A-Exosome (1 x 106): 인간 지방줄기세포유래 엑소좀을 1 x 106/ml 로 처리한 군, B-Exosome (1 x 106): 인간 골수줄기세포 유래 엑소좀을 1 x 106개/ml 로 처리한 군, U-Exosome (1 x 106): 인간 탯줄줄기세포 유래 엑소좀을 1 x 106개/ml 로 처리한 군).
상기 실험을 통해, 인간 지방줄기세포유래 엑소좀은 인간 타조직줄기세포유래 엑소좀에 비해 섬유화로 인해 활성화된 간성상세포의 섬유화 관련 인자들의 수치를 낮춤에 따라 간 섬유화를 효과적으로 완화시키는 것을 알 수 있었다.
실시예
4 : 간 섬유증 동물모델에서의 인간
지방줄기세포유래
엑소좀의
생체 내 분포 거동 평가
인간 지방줄기세포유래 엑소좀의 생체 내 분포 거동을 평가하기 위해, 정상모델과 간 섬유증 유발 모델 마우스에 DiR ; 1,1'-다이오타데실-3,3,3',3'-테트라메틸인도트리카보시아닌 로다이드(1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'- Tetramethylindotricarbocyanine lodide) 형광물질로 표지된 인간 지방줄기세포유래 엑소좀을 배양액 100μL에 분산시켜 꼬리정맥 주사 하였다. 이후, 24시간이 지났을 때 각각의 집단의 마우스를 해부하여 주요 장기들을 잘라내어 그 형광을 확인하였다.
그 결과 도 6에 나타낸 바와 같이, 정상모델, 간섬유증 유발 모델 모두 간에서 단위면적 당 가장 많은 양의 엑소좀이 축적됨을 확인하였고, 특히 정상모델에 비해 간섬유증 모델에서 더 많은 양의 엑소좀의 양을 확인하였다. 이는 섬유화로 인한 활성화 과정 동안 분화된 많은 수의 간성상세포로 인한 것으로 판단된다(Hien T. T et al., Small 2015;19:2291-2304).
실시예
5 : 간 섬유증 동물모델에서 인간
지방줄기세포유래
엑소좀의
치료 효능 평가
상기 실시예 1의 인간 지방줄기세포유래 엑소좀을 이용하여 실제 간섬유증 동물모델에서 항섬유화 효과가 있는지를 확인하였고, 인간 지방줄기세포(Adipose Derived Stem Cells, ADSC)보다 인간 지방줄기세포유래 엑소좀(A-Exosome)을 투여한 경우, 간 기능이 더욱 효과적으로 개선되었음을 확인하였다.
구체적으로, 도 7의 동물 실험 모식도와 같이 정상 C57BL/6 마우스와 간 섬유화를 유발한다고 알려진 약물인 TAA(Thioacetamine)를 200㎎/㎏의 농도로 일주일에 3회씩 12주 동안 복강 투여하여 간 섬유증 모델을 제작하였다. 12주 후, 엑소좀 샘플을 농도를 1 x 107, 1 x 108개로 설정하여 3회 정맥투여한 후 간 섬유증 치료효과를 검증하였다.
먼저, 엑소좀 투여에 따른 간기능 검사를 실시하기 위하여, 간 섬유증 마우스 모델에 1 x 107 과 1 x 108 개 엑소좀을 각각 3회 투여한 후, 5일 뒤에 혈액을 채취하여 혈액생화학분석을 진행하였다. 채취한 혈액은 4500rpm으로 15분 동안 4℃에서 원심분리한 후 상층액을 회수하여, 주식회사 켐온에 간 기능검사를 의뢰하였다.
보다 구체적으로, 자동혈액분석기(ADVIA2120, SIEMENS, USA)를 이용하여 생화학적 지표인 AST(Aspartate aminotransferase), ALT(Alanine aminotransferase), ALP(Alkaline phosphatase), TBIL(Total bilirubin) 및 TP(Total protein) 수치를 측정하였다. 또한, 채취한 간 조직의 무게를 측정하여 전체 몸무게 대비 간 조직의 무게 비(Ratio of LW/BW)를 계산하여 그 효능을 도시화하였다.
혈액 내 상기 효소들의 수치를 측정한 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 정상 모델에 인간 지방줄기세포 및 인간 지방줄기세포유래 엑소좀을 투여하였을 경우, 대조군과 마찬가지로, 간 기능에는 크게 영향을 미치지 않는 것을 상기의 효소들에 걸쳐 확인하였다(Normal : 정상 마우스 모델, Fibrosis : 간 섬유증 유발모델, PBS : PBS를 투여한 군, ADSC (1 x 105) : 인간 지방줄기세포 1 x 105개를 투여한 군, A-Exosome (1 x 107) ∼ A-Exosome (1 x 108) : 인간 지방줄기세포유래 엑소좀을 1 x 107∼108개를 투여한 군).
간 섬유증 모델에서는 PBS만 투여한 군과 비교하였을 때, 인간 지방줄기세포(Adipose Derived Stem Cells, ADSC)와 인간 지방줄기세포유래 엑소좀(A-Exosome) 투여에 의해 간 기능이 개선되었음을 확인하였고, 특히 ADSC(1x105개) 보다 A-Exosome을 1 x 108 개로 3번 투여한 경우, 간 기능이 더욱 효과적으로 개선되었음을 확인할 수 있었다. 또한, 전체 무게 대비 간의 무게 역시 정상 동물모델에 근접한 비의 값을 가지는 것을 관찰함에 따라 효과적으로 간 조직의 섬유화를 억제하는 것을 확인하였다.
한편, 간 조직 육안 검사 및 병리학적 분석을 진행하기 위해 실험 후 상기 마우스의 간을 적출하여 4% 중성 완충 포르말린으로 고정시키고 파라핀으로 포매한 후 4 ㎛ 두께의 조직절편을 제작하여 H&E(Hematoxilin-Eosin) 염색, α-Smooth Muscle Actin(α-SMA) 및 Masson's trichrome 염색을 실시한 후 광학현미경으로 관찰하였다.
그 결과 도 9a에 나타낸 바와 같이, 적출한 간을 육안으로 관찰하였을 때, 정상 모델에 투여한 인간 지방줄기세포(ADSC (1 x 105)) 및 인간 지방줄기세포유래 엑소좀 (A-Exosome (1 x 107-108))은 간의 조직 형태에 영향을 주지 않는 것을 확인하였다. 또한, 간 섬유증 모델에서 PBS만을 투여한 군에서 관찰할 수 있었던 표면의 색과 형태적 변화가 인간 지방줄기세포유래 엑소좀을 1 x 108 개로 투여한 군 (A-Exosome (1 x 108))에서는 효과적으로 정상 간 조직의 형태와 유사하게 유지되는 것을 확인할 수 있었다.
한편, 간 섬유증 모델의 간 조직에 세포의 구조적 특성을 확인할 수 있는 H&E 염색, collagen을 검출할 수 있는 Masson's Trichrome (MT)염색과 섬유화 과정에서 발견되는 근섬유아세포(myofibroblast)를 검출하기 위한 α-SMA 염색을 진행하였다.
그 결과 도 9b에서 나타낸 바와 같이, 간섬유증이 유발된 경우 구조학적으로 세포의 세포막이 형태를 잃거나 붕괴됨에 따라 괴사가 진행되는 것을 확인할 수 있었으나, 도 9c에서 나타낸 바와 같이, 간섬유증에 의해 증가하는 collagen 수치와 α-SMA 발현량은 정상모델은 거의 확인되지 않았고, 인간 지방줄기세포유래 엑소좀을 1 x 108 개로 투여한 군(A-Exosome (1 x 108))에서 α-SMA와 Collagen의 양이 줄어든 것을 관찰하였다.
이를 통해 인간 지방줄기세포유래 엑소좀의 투여가 섬유성 격막의 형성을 효과적으로 억제할 뿐만 아니라 간세포의 구조적 형태 또한 잘 유지시켜 간 조직의 섬유화를 효과적으로 억제함에 따라 정상 조직의 형태로 잘 유지시키는 것을 알 수 있었다.
상기와 같은 실험을 통해, 본 발명에 따른 지방줄기세포유래 엑소좀은 간 섬유증 치료를 위한 유전정보, 단백질, 및 성장인자 등이 담지되어 있어 간 섬유증 동물 모델에서 우수한 간 섬유증 치료효과를 나타낼 수 있고, 상기 엑소좀은 세포유래 물질이므로 생체적합성이 좋고 흡수율 또한 뛰어난 장점이 있음을 알 수 있었고, 본 발명에 따른 지방줄기세포유래 엑소좀은 간 섬유증의 예방, 개선, 또는 치료용도로 유용하게 이용될 수 있음을 알 수 있었다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
Claims (5)
- 지방줄기세포유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 간 섬유증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 지방줄기세포는 인간 지방줄기세포인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 약학적 조성물은 혈중 아스파르트산염 아미노기 전달 효소(Aspartate aminotransferase; AST), 혈중 알라닌 아미노기전달효소(Alanine aminotransferase; ALT), 알칼리성 인산가수분해효소(Alkaline phosphatase; ALP), 총 빌리루빈(Total bilirubin; TP), 또는 LW/BW(Ratio of liver weight to body weight) 수준을 감소시키는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물. - 지방줄기세포유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 간 섬유증 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제4항에 있어서,
상기 지방줄기세포는 인간 지방줄기세포인 것을 특징으로 하는, 건강기능식품 조성물.
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