KR20230026096A - 줄기세포 유래 세포외소포체를 유효성분으로 포함하는 조성물 - Google Patents

줄기세포 유래 세포외소포체를 유효성분으로 포함하는 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR20230026096A
KR20230026096A KR1020210108064A KR20210108064A KR20230026096A KR 20230026096 A KR20230026096 A KR 20230026096A KR 1020210108064 A KR1020210108064 A KR 1020210108064A KR 20210108064 A KR20210108064 A KR 20210108064A KR 20230026096 A KR20230026096 A KR 20230026096A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
mir
stem cells
extracellular vesicles
pharmaceutical composition
chronic kidney
Prior art date
Application number
KR1020210108064A
Other languages
English (en)
Inventor
이상훈
Original Assignee
주식회사 스템바이오
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 스템바이오 filed Critical 주식회사 스템바이오
Priority to KR1020210108064A priority Critical patent/KR20230026096A/ko
Priority to PCT/KR2022/012195 priority patent/WO2023022473A1/ko
Publication of KR20230026096A publication Critical patent/KR20230026096A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1017—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by filtration, e.g. using filters, frits, membranes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0667—Adipose-derived stem cells [ADSC]; Adipose stromal stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/50—Biochemical production, i.e. in a transformed host cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 송과선 호르몬이 처리된 중간엽 줄기세포 유래의 세포외소포체를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 송과선 호르몬이 처리된 중간엽 줄기세포 또는 이의 배양액으로부터 추출된 세포외소포체는 항섬유화 및 항염증 관련 마이크로 RNA인 miR-29b-3p, let-7a-3p, let-7b-5p, let-7c-3p, miR-153-3p, miR-26a-2-3p 및 miR-486-5p의 발현이 증가되어 있는 것으로 나타났으며, 이를 만성 콩팥병 마우스 모델에 투여시 항염증 및 항섬유화 효과를 나타냈고, 신장 조직 내 섬유아세포 증식 및 세포자멸을 억제하였으며, 신장 기능이 회복되으므로, 염증성 또는 섬유화 질환, 또는 만성 콩팥병의 예방 또는 치료 용도로 유용하게 활용할 수 있다.

Description

줄기세포 유래 세포외소포체를 유효성분으로 포함하는 조성물{A COMPOSITION COMPRISING EXTRACELLULAR VESICLES DERIVED FROM STEM CELLS AS AN INGEDIENT}
본 발명은 송과선 호르몬이 처리된 중간엽 줄기세포 유래의 세포외소포체를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
최근 세포 분비물(secretome)에 세포의 행동(behavior)을 조절하는 다양한 생체활성인자가 포함되어 있다는 연구가 보고되고 있으며, 세포는 세포외 환경에 다양한 막(membrane) 유형의 소포체를 방출하는데, 통상 이러한 방출 소포체들을 세포외소포체(Extracellular vesicles, EV)라고 부르고 있다. 세포외소포체는 동물세포, 식물세포, 박테리아 및 고세균 (Archaea)에서도 분비한다고 알려져 있어 세포외소포체는 분비 현상은 모든 생물에서 진화적으로 보존된 현상으로 생각된다. 세포외소포체가 최초로 발견된 당시에는 이들이 단순한 cellular waste으로 생각되었으나, 최근들어 이들의 병리, 생리학적 기능이 활발히 규명됨에 따라, 호르몬, 단백질에 이어 세포간 신호전달의 새로운 물질로 대두되고 있다. 세포외소포체는 세포로부터 유래하는 다양한 종류의 막 구조로서, 엔도좀 시스템(endosomal system)에서 유래하는 엑소좀 (exosome)과 원형질막(plasma membrane)에서 유래하는 마이크로베시클 (microvesicle)으로 이루어진다고 알려져 있다. 세포외소포체는 공여세포에서 유래한 특정한 핵산, 지질, 단백질, 대사물질 등을 함유한다고 알려져 있으며, 타깃세포에서 다양한 생리적 병리적 과정에 관여한다고 알려져 있다. 이를 세포외소포체는 세포막 유래 소포체, 엑토좀(ectosomes), 쉐딩 소포체(shedding vesicles), 마이크로파티클(microparticles), 엑소좀(exosome) 등으로도 지칭된다. 엑소좀은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터 크기의 소포체로서 내부에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다. 엑소좀은 유래된 세포의 성질 및 상태에 따라 특이적인 유전물질과 생체활성 인자들이 포함되어 있다. 다양한 세포들 중 중간엽 줄기세포는 골수, 지방, 제대 등 다양한 조직에서 유래하며 근세포, 내피세포, 연골세포 등 다양한 세포로 분화할 수 있는 능력이 있다. 최근 중간엽 줄기세포의 주변분비능이 조직 재생 및 염증 억제를 유도한다는 연구가 발표됨에 따라 다양한 의약 분야에서 관심을 가지고 있다. 하지만 줄기세포를 직접 주사할 경우 염증을 유발하거나, 다른 세포로의 분화 가능성, 특히 종양을 유발 할 수 있다는 위험을 가지고 있기에 그 사용이 제한적이므로, 최근에 줄기세포의 치료 효과는 취하고 위험은 제한하기 위하여 줄기세포에서 유래한 물질들을 이용하는 방향으로 연구가 진행되고 있다. 증식하는 줄기세포 유래 엑소좀의 경우 세포의 이동, 증식 및 분화와 같은 세포 행동을 조절하고, 조직 재생과 관련된 줄기세포의 특성이 반영되어 있으며 (Nature Review Immunology 2002 (2) 569-579), 이러한 세포외소포체는 줄기세포에서 유래한 치료용 핵산, 단백질, 지질 등 다양한 물질들을 포함하고 있어, 하나의 치료 수단으로 고려되고 있지만 아직은 그 치료 효과가 미비한 상황이다.
한편, 만성 콩팥병은 3개월 이상 콩팥에 형태학적 또는 기능적 이상 소견이 발견되는 경우로 정의되며, 최근 우리나라는 고령화 사회에 진입함으로써 만성 콩팥병 환자가 지속적으로 증가하고 있다. 만성 콩팥병 환자의 경우, 심혈관 합병증 발병위험이 30배까지 증가하며, 실제로 만성 콩팥병 환자의 50% 이상이 심혈관 합병증으로 사망한다. 만성 콩팥병의 진행을 억제하기 위한 확립된 치료제로 안지오텐신2 억제제가 거의 유일하고, 그 외에 혈압, 혈당, 이상지질혈증 등을 타깃으로 한 치료법이 보조적으로 이용되고 있는 실정이므로, 현재 투석이나 신장이식 외에는 만성 콩팥병의 효과적인 치료법이 존재하지 않는다.
본 발명의 목적은 염증성 질환 또는 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
아울러, 본 발명의 목적은 만성 콩팥병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 송과선 호르몬 처리된 중간엽 줄기세포 또는 이의 배양액으로부터 추출된 세포외소포체를 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환 또는 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 송과선 호르몬 처리된 중간엽 줄기세포 또는 이의 배양액으로부터 추출된 세포외소포체를 유효성분으로 포함하는, 만성 콩팥병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
아울러, 본 발명은 miR-29b-3p, let-7a-3p, let-7b-5p, let-7c-3p, miR-153-3p, miR-26a-2-3p 및 miR-486-5p로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마이크로 RNA를 유효성분으로 포함하는, 만성 콩팥병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 송과선 호르몬이 처리된 중간엽 줄기세포 또는 이의 배양액으로부터 추출된 세포외소포체는 항섬유화 및 항염증 관련 마이크로 RNA인 miR-29b-3p, let-7a-3p, let-7b-5p, let-7c-3p, miR-153-3p, miR-26a-2-3p 및 miR-486-5p의 발현이 증가되어 있는 것으로 나타났으며, 만성 콩팥병 동물 모델에서 항염증 및 항섬유화 효과를 나타냈고, 신장 조직 내 섬유아세포 증식 및 세포자멸을 억제하였으며, 신장 기능을 회복시켰으므로, 염증성 또는 섬유화 질환, 또는 만성 콩팥병의 예방 또는 치료 용도로 유용하게 활용할 수 있다.
도 1은 송과선 호르몬 처리 중간엽 줄기세포에서 추출한 세포외소포체를 추출하여 이의 특성을 확인한 도이다:
A: 전자현미경으로 관찰한 세포외소포체;
B: 나노입자추적분석법으로 확인한 세포외소포체의 크기;
C: 웨스턴 블롯 분석으로 확인한 세포외소포체 마커의 발현;
D: 세포외소포체 내 마이크로 RNA 발현;
cEXO: 송과선 호르몬 무처리 중간엽 줄기세포에서 추출한 세포외소포체 (Control exosome); 및
Exocue: 송과선 호르몬 처리 중간엽 줄기세포에서 추출한 세포외소포체.
도 2는 마우스의 혈청에서 염증성 사이토카인인 TNF-α 및 섬유화 촉진 사이토카인인 TGF-β 농도를 확인한 도이다:
Healthy mouse: 정상 마우스 대조군;
CKD mouse: 만성 콩팥병(chronic kidney disease) 모델 마우스;
PBS: PBS 처리 마우스 군;
cEXO: 송과선 호르몬 무처리 중간엽 줄기세포에서 추출한 세포외소포체 처리 마우스 군; 및
Exocue: 송과선 호르몬 처리 중간엽 줄기세포에서 추출한 세포외소포체 처리 마우스 군.
도 3은 마우스의 신장 조직내 섬유화를 Masson's trichrome 염색법 및 Picrosirius 염색법으로 확인한 도이다:
Healthy mouse: 정상 마우스 대조군;
CKD mouse: 만성 콩팥병 모델 마우스;
PBS: PBS 처리 마우스 군;
cEXO: 송과선 호르몬 무처리 중간엽 줄기세포에서 추출한 세포외소포체 처리 마우스 군; 및
Exocue: 송과선 호르몬 처리 중간엽 줄기세포에서 추출한 세포외소포체 처리 마우스 군.
도 4는 면역형광염색 분석으로 마우스에서 섬유아세포 분열 (α-SMA 및 PCNA) (A) 및 세포자멸 (caspase-3) (B)을 확인한 도이다:
Healthy mouse: 정상 마우스 대조군;
CKD mouse: 만성 콩팥병 모델 마우스;
PBS: PBS 처리 마우스 군;
cEXO: 송과선 호르몬 무처리 중간엽 줄기세포에서 추출한 세포외소포체 처리 마우스 군; 및
Exocue: 송과선 호르몬 처리 중간엽 줄기세포에서 추출한 세포외소포체 처리 마우스 군.
도 5는 마우스의 신장 조직에서의 물 재흡수 관련 단백질 (AQP2 및 AQP5)의 발현 변화 및 혈청에서의 BUN 및 크레아틴 수치 변화를 확인한 도이다:
Healthy mouse: 정상 마우스 대조군;
CKD mouse: 만성 콩팥병 모델 마우스;
PBS: PBS 처리 마우스 군;
cEXO/Con-Exo: 송과선 호르몬 무처리 중간엽 줄기세포에서 추출한 세포외소포체 처리 마우스 군; 및
Exocue: 송과선 호르몬 처리 중간엽 줄기세포에서 추출한 세포외소포체 처리 마우스 군.
도 6은 마우스에서 당뇨병성 만성 콩팥병 마커인 miR-4270, miR-4739, miR-636, miR-320c 및 miR-572의 발현 변화를 qPCR로 확인한 도이다:
Healthy mouse: 정상 마우스 대조군;
CKD mouse: 만성 콩팥병 모델 마우스;
PBS: PBS 처리 마우스 군;
cEXO: 송과선 호르몬 무처리 중간엽 줄기세포에서 추출한 세포외소포체 처리 마우스 군; 및
Exocue: 송과선 호르몬 처리 중간엽 줄기세포에서 추출한 세포외소포체 처리 마우스 군.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.
일 측면에서, 본 발명은 송과선(pineal gland) 호르몬 처리된 중간엽 줄기세포 또는 이의 배양액으로부터 추출된 세포외소포체(extracellular vesicle)를 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환 또는 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 세포외소포체는 miR-29b-3p, let-7a-3p, let-7b-5p, let-7c-3p, miR-153-3p, miR-26a-2-3p 또는 miR-486-5p가 과발현될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 세포외소포체는 miR-29b-3p, let-7a-3p, let-7b-5p, let-7c-3p, miR-153-3p, miR-26a-2-3p 및 miR-486-5p로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 또는 태반 유래 중간엽 줄기세포일 수 있으며, 지방 조직 유래 중간엽 줄기세포인 것이 가장 바람직하다.
일 구현예에서, 염증성 질환은 당뇨병, 대장염, 만성 및 급성 위염 또는 장염, 급성 및 만성 신장염, 급성 및 만성 간염, 만성 폐쇄성 폐질환, 과민성 대장 증후군, 염증성 통증, 관절염, 류머티즘성 관절염, 강직성 척추염 및 췌장염으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 급성 및 만성 신장염인 것이 가장 바람직하다.
일 구현예에서, 섬유화 질환은 신장 섬유화, 간 섬유화 및 폐 섬유화 질환으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 신장 섬유화인 것이 가장 바람직하다.
일 구현예에서, 송과선 호르몬 처리된 중간엽 줄기세포 또는 이의 배양액으로부터 추출된 세포외소포체는 크기가 10 내지 1000 nm일 수 있으며, 20 내지 500 nm 인 것이 더욱 바람직하다.
일 구현예에서, 송과선 호르몬 처리된 중간엽 줄기세포 또는 이의 배양액으로부터 추출된 세포외소포체는: (a) 송과선 호르몬과 공배양된 줄기세포의 세포배양액을 필터를 이용하여 여과하는 단계; (b) 여과한 세포배양액에서 세포외소포체를 접선유동여과법(Tangential Fluid Filtration)으로 분리하는 단계; 및 (c) 분리한 세포외소포체를 원심분리필터(centrifugal filter)로 농축하는 단계를 포함하는 제조방법에 의해 제조될 있다.
일 구현예에서, 송과선 호르몬 처리된 중간엽 줄기세포 또는 이의 배양액으로부터 추출된 세포외소포체의 투여 용량은 1회 주입시 20 내지 200 μg일 수 있고, 50 내지 150 μg인 것이 더욱 바람직하며, 100 μg인 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 송과선 분비 호르몬 (멜라토닌)은 골수 간장, 장, 태반, 난소 및 고환과 같은 다양한 조직에 의해 분비되며, 세포막과 뇌혈관을 비롯한 생리학적 장벽을 쉽게 통과하여 혈류로 방출되는 특징이 있다. 이 호르몬은 수면, 일주기 리듬, 면역방어 및 신경 내분비 작용을 비롯한 여러가지 생리 기능을 조절한다는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 마이크로 RNA 중 miR-29b 및 let-7a는 TGF-β 신호전달(signaling)을 직접적으로 억제하여 섬유화를 억제하며, 신세뇨관상피세포 (proximal tubular epithelial cells)에서 let-7b의 발현이 저해된 경우 TGFBR1(TGF-βreceptor1)의 발현이 증가되고, 섬유화가 촉진되는 것이 알려져 있다. 인간 신세뇨관상피세포 (HK-2)와 신장 섬유화 동물 모델에 LXA4를 처리할 경우, let-7c가 유도되어 TGFBR1의 발현이 억제되어 신장섬유화가 억제되는 것이 보고 되여 있고, miR-153은 TGFBR-2의 발현을 억제하여 폐 섬유화(pulmonary fibrosis)을 억제하는 것이 알려져 있다. miR-26a의 경우 p-Smad3의 트랜스로케이션(translocation)을 억제하여 섬유화를 억제 시킨다는 것이 알려져 있다. 폐 섬유화 모델에서 miR-486-5p의 발현이 저해되어 있으며, miR-486-5p의 발현을 증진시킬 경우 섬유화가 억제되는 것이 알려져 있다.
일 측면에서, 본 발명은 송과선 호르몬 처리된 중간엽 줄기세포 또는 이의 배양액으로부터 추출된 세포외소포체를 유효성분으로 포함하는, 만성 콩팥병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
일 구현예에서, 상기 세포외소포체는 miR-29b-3p, let-7a-3p, let-7b-5p, let-7c-3p, miR-153-3p, miR-26a-2-3p 또는 miR-486-5p가 과발현될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 세포외소포체는 miR-29b-3p, let-7a-3p, let-7b-5p, let-7c-3p, miR-153-3p, miR-26a-2-3p 및 miR-486-5p로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 또는 태반 유래 중간엽 줄기세포일 수 있으며, 지방 조직 유래 중간엽 줄기세포인 것이 가장 바람직하다.
일 구현예에서, 만성 콩팥병 질환은 당뇨병성 신장병(diabetic nephropathy), 고혈압성 신장병(hypertensive nephropathy), 허혈성 신장병(Ischemic nephropathy)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
일 구현예에서, 송과선 호르몬 처리된 중간엽 줄기세포 또는 이의 배양액으로부터 추출된 세포외소포체는 크기가 10 내지 1000 nm일 수 있으며, 20 내지 500 nm 인 것이 더욱 바람직하다.
일 구현예에서, 송과선 호르몬 처리된 중간엽 줄기세포 또는 이의 배양액으로부터 추출된 세포외소포체는: (a) 송과선 호르몬과 공배양된 줄기세포의 세포배양액을 필터를 이용하여 여과하는 단계; (b) 여과한 세포배양액에서 세포외소포체를 접선유동여과법으로 분리하는 단계; 및 (c) 분리한 세포외소포체를 원심분리필로 농축하는 단계를 포함하는 제조방법에 의해 제조될 수 있다.
일 구현예에서, 송과선 호르몬 처리된 중간엽 줄기세포 또는 이의 배양액으로부터 추출된 세포외소포체는 항염증(anti-inflammatory) 효과를 가질 수 있다.
일 구현예에서, 송과선 호르몬 처리된 중간엽 줄기세포 또는 이의 배양액으로부터 추출된 세포외소포체는 항섬유화(anti-fibrotic) 효과를 가질 수 있다.
일 구현예에서, 송과선 호르몬 처리된 중간엽 줄기세포 또는 이의 배양액으로부터 추출된 세포외소포체는 만성 콩팥병에 걸린 개체의 신장 조직 내 섬유아세포의 증식 및 세포자멸을 억제할 수 있다.
일 구현예에서, 송과선 호르몬 처리된 중간엽 줄기세포 또는 이의 배양액으로부터 추출된 세포외소포체는 만성 콩팥병에 걸린 개체의 신장 기능 회복시킬 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 miR-29b-3p, let-7a-3p, let-7b-5p, let-7c-3p, miR-153-3p, miR-26a-2-3p 및 miR-486-5p로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마이크로 RNA를 유효성분으로 포함하는, 만성 콩팥병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 마이크로 RNA는 세포외소포체 유래일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 마이크로 RNA는: (ⅰ) 송과선 호르몬과 공배양된 줄기세포의 세포배양액을 필터를 이용하여 여과하는 단계; (ⅱ) 여과한 세포배양액에서 세포외소포체를 접선유동여과법으로 분리하는 단계; 및 (ⅲ) 분리한 세포외소포체에서 마이크로 RNA를 분리하는 단계를 포함하는 제조방법에 의해 제조될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 만성 콩팥병 질환 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "치료"는 이롭거나 바람직한 임상적 결과를 수득하기 위한 접근을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해서, 이롭거나 바람직한 임상적 결과는 비제한적으로, 증상의 완화, 질병 범위의 감소, 질병 상태의 안정화 (즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감 (부분적이거나 전체적으로), 검출가능하거나 또는 검출되지 않거나의 여부를 포함한다.
또한, "치료"는 치료를 받지 않았을 때 예상되는 생존율과 비교하여 생존율을 늘이는 것을 의미할 수도 있다. "치료"는 치료학적 치료 및 예방적 또는 예방조치 방법 모두를 가리킨다. 상기 치료들은 예방되는 장애뿐만 아니라 이미 발생한 장애에 있어서 요구되는 치료를 포함한다. 질병을 "완화(Palliating)"하는 것은 치료를 하지 않은 경우와 비교하여, 질병상태의 범위 및/또는 바람직하지 않은 임상적 징후가 감소되거나 및/또는 진행의 시간적 추이(time course)가 늦춰지거나 길어지는 것을 의미한다.
상기 치료란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 본원에서 사용된 상기 치료란 용어는 치료하는이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다.
만약, 수혜동물이 조성물의 투여에 견딜 수 있거나, 조성물의 그 동물에의 투여가 적합한 경우라면, 조성물은 "약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능함"을 나타낸다. 투여된 양이 생리학적으로 중요한 경우에는 상기 제제는 "치료학적으로 유효량"으로 투여되었다고 말할 수 있다. 상기 제제의 존재가 수혜 환자의 생리학적으로 검출가능한 변화를 초래한 경우라면 상기 제제는 생리학적으로 의미가 있다.
본 명세서에서 사용되는 "유효량"은, 이롭거나 바람직한 임상적 또는 생화학적 결과에 영향을 주는 적절한 양이다. 유효량은 한번 또는 그 이상 투여될 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여, 촉진제의 유효량은 관련 질병 상태의 진행을 일시적으로 완화, 개선, 안정화, 되돌림, 속도를 늦춤 또는 지연시키는데 적절한 양이다.
본 발명에서, 용어 "예방"이란 본 발명에 따른 단백질 또는 이의 단편, 또는 이를 포함하는 조성물의 투여에 의해 상기 질환 또는 질병의 발생, 확산 및 재발을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 조성물의 치료적으로 유효한 양은 여러 요소, 예를 들면 투여방법, 목적부위, 환자의 상태 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 인체에 사용 시 투여량은 안전성 및 효율성을 함께 고려하여 적정량으로 결정되어야 한다. 동물실험을 통해 결정한 유효량으로부터 인간에 사용되는 양을 추정하는 것도 가능하다. 유효한 양의 결정시 고려할 이러한 사항은, 예를 들면 Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed.(2001), Pergamon Press; 및 E.W. Martin ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed.(1990), Mack Publishing Co.에 기술되어있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 건강상태, 질병/질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여, 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 허용가능한"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다. 상기 담체는 조성물을 생체 내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 약학적 조성물은 경구형 제형, 외용제, 좌제, 멸균 주사용액 및 분무제를 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 제형일 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체 내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 조성물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 단백질을 0.0001 내지 10 중량 %로, 바람직하게는 0.001 내지 1 중량 %를 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 중량부 내지 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 비 경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
본 발명의 조성물의 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 통상적으로 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 다양한 부형제, 예컨대 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 함께 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함된다.
일 측면에서, 본 발명은 송과선 호르몬 처리된 중간엽 줄기세포 또는 이의 배양액으로부터 추출된 세포외소포체를 포함하는, 만성 콩팥병의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 조성물을 식품 조성물로 사용하는 경우, 상기 세포외소포체를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상의 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 상기 조성물은 유효성분 이외에 식품학적으로 허용가능한 식품보조첨가제를 포함할 수 있으며, 유효성분의 혼합량은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "식품보조첨가제"란 식품에 보조적으로 첨가될 수 있는 구성요소를 의미하며, 각 제형의 건강기능식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 식품보조첨가제의 예로는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 본 발명의 식품보조첨가제의 종류가 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 식품 조성물에는 건강기능식품이 포함될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "건강기능식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 '기능성'이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 통상의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 통상의 기술분야에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 건강기능식품의 제형 또한 건강기능식품으로 인정되는 제형이면 제한없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 본 발명의 건강기능식품은 항산화 효과를 가진 건강기능식품으로 섭취가 가능하다.
또한, 본 발명의 조성물이 사용될 수 있는 건강식품의 종류에는 제한이 없다. 아울러 본 발명의 세포외소포체를 활성성분으로 포함하는 조성물은 당업자의 선택에 따라 건강기능식품에 함유될 수 있는 적절한 기타 보조 성분과 공지의 첨가제를 혼합하여 제조할 수 있다. 첨가할 수 있는 식품의 예로는 소스류, 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림 류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 본 발명에 따른 추출물을 주성분으로 하여 제조한 즙, 차, 젤리 및 주스 등에 첨가하여 제조할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 (a) 송과선 호르몬 처리 중간엽 줄기세포 세포배양액을 0.45 μm 필터로 여과하는 단계; (b) 상기 단계 (a)에서 수득된 세포배양액으로부터 접선유동여과법으로 세포외소포체를 분리하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)에서 수득된 세포외소포체를 원심분리필터로 농축하는 단계를 포함하는 만성 콩팥병 치료용 세포외소포체의 제조방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 송과선 호르몬 처리 중간엽 줄기세포에서 추출한 세포외소포체는 단백질 및 나노입자가 풍부할 수 있다.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 송과선 호르몬 처리 중간엽 줄기세포의 세포외소포체 추출 및 특성 분석
1-1. 송과선 호르몬 처리 중간엽 줄기세포 유래 세포외소포체 분리 및 정제
송과선(pineal gland) 호르몬 처리 중간엽 줄기세포에서 추출한 세포외소포체를 접선유동여과법을 통해 추출하여 얻었다. 구체적으로, ATCC에서 구입한 지방조직 유래 중간엽 줄기세포가 > 80%의 밀도일 때 PBS으로 세척한 후 1 μM 멜라토닌(melatonin)이 포함된 무혈청(serum-free) 배지를 처리하여 24 시간 동안 배양하였다. 그 후 세포배양액을 회수하여 0.45 μm 필터로 여과한 후, 세포배양액을 100 kDa MWCO 멤브레인(membrane)이 설치된 접선유동여과(Tangential Fluid Filtration) 시스템을 이용하여 세포외소포체를 분리 및 정제하였다. 추가적으로 원심분리필터(centrifugal filter)을 이용하여 세포외소포체를 농축하였다.
1-2. 송과선 호르몬 처리 중간엽 줄기세포 유래 세포외소포체 특성 분석
상기 실시예 1-1에서 송과선 호르몬을 처리한 중간엽 줄기세포에서 추출한 세포외소포체의 특성을 분석하기 위해, 전자현미경으로 관찰하고 나노입자추적분석(nanoparticle tracking analysis) 및 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 웨스턴 블롯 분석에서는 세포외소포체 마커 단백질인 CD81 및 CD9 발현을 확인하였다.
그 결과, 송과선 호르몬 처리 중간엽 줄기세포에서 추출한 세포외소포체는 크기가 50 내지 400 nm 정도이고, 평균 173.0 ± 1.0 nm의 균일한 크기로 존재하였으며 (도 1A 및 B), 세포외소포체 마커 단백질인 CD81 및 CD9이 발현되는 것으로 나타났다 (도 1C). 또한, 송과선 호르몬을 처리하지 않은 대조군 세포외소포체에 비해 항섬유화 및 항염증 관련 microRNA인 miR-29b-3p, let-7a-3p, let-7b-5p, let-7c-3p, miR-153-3p, miR-26a-2-3p 및 miR-486-5p의 발현이 증가되어 있는 것으로 나타났다 (도 1D).
실시예 2. 만성 콩팥병에 대한 항염증 및 항섬유화 효과
3개월 이상 신장이 손상되어 있거나 신장 기능 감소가 지속적으로 나타나는 질병인 만성 콩팥병(chronic kidney disease)에 대한 송과선 호르몬 처리 중간엽 줄기세포에서 추출한 세포외소포체의 효과를 확인하기 위해, 6주령의 BALB/c 수컷 마우스에게 0.25% 아데닌(adenine)이 함유된 사료를 총 2주간 급여하여 만성 콩팥병 마우스 모델을 확립하고, 0.25% 아데닌 함유 사료 급여 시작일로 2주 후 각 군 별로 PBS, 송과선 호르몬 무처리 중간엽 줄기세포에서 추출한 세포외소포체 (100 μg) 및 송과선 호르몬 처리 중간엽 줄기세포에서 추출한 세포외소포체 (50 또는 100 μg)를 각각 주 2회씩 총 4회 정맥주사하였다. 실험 종료일에 동물을 안락사하여 혈청 및 신장 조직을 수집하여 송과선 호르몬 처리 중간엽 줄기세포에서 추출한 세포외소포체의 치료 효과를 확인하였다. 특히, 만성 콩팥병에서는 저하된 신장기능으로 인해 혈류내 요독소(uremic toxin)가 증가하게 되어 콩팥에 염증반응 및 섬유화가 일어나므로, 송과선 호르몬 처리 중간엽 줄기세포의 유래 세포외소포체가 항염증 및 항섬유화 효과를 나타내는지 확인하고자, 수집한 각 군의 마우스 혈청에서 염증성 사이토카인인 TNF-α 및 섬유화 촉진 사이토카인인 TGF-β의 농도를 측정하고, 신장 조직 내 섬유화를 Masson's trichrome 염색법 및 Picrosirius 염색법으로 확인하였다.
그 결과, 송과선 호르몬 처리 중간엽 줄기세포에서 추출한 세포외소포체가 만성 콩팥병 마우스 모델에서 TNF-α 및 TGF-β 농도를 현저히 억제하였으며, 이는 송과선 호르몬을 무처리한 중간엽 줄기세포에서 추출한 세포외소포체 (대조군 세포외소포체)에 비해 현저히 높은 것으로 나타났다 (도 2A 및 B). 아울러, 송과선 호르몬 처리 중간엽 줄기세포에서 추출한 세포외소포체를 처리한 마우스 군에서 신장 조직내 섬유화가 다른 군의 마우스들에 비해 현저히 감소된 것으로 나타났다 (도 3). 이를 통해, 본 발명의 송과선 호르몬 처리 중간엽 줄기세포에서 추출한 세포외소포체가 만성 콩팥병에서 항염증 효과와 항섬유화 효과를 가지는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3. 만성 콩팥병에 대한 섬유아세포 증식 억제 및 세포자멸 억제 효과
만성 콩팥병 신장 조직에서는 섬유화 단백질인 콜라겐(collagen)을 합성하는 섬유아세포(fibroblast)의 증식이 촉진되고, 정상 신장 세포의 세포자멸(apoptosis)이 유도되므로, 송과선 호르몬 처리 중간엽 줄기세포에서 추출한 세포외소포체 처리에 의한 만성 콩팥병 신장 조직 내 섬유아세포의 증식 및 신장세포의 세포자멸 변화를 확인하였다. 구체적으로, 상기 실시예 2에서 제작한 만성 콩팥병 마우스 모델의 신장 조직을 α-SMA(alpha smooth muscle actin) 및 PCNA(Proliferating cell nuclear antigen)로 면역형광염색하여 분열하는 세포 존재 유무를 확인하고, caspase-3으로 면역형광염색하여 세포자멸 변화를 확인하였다.
그 결과, 송과선 호르몬 처리 중간엽 줄기세포에서 추출한 세포외소포체가 만성 콩팥병 동물의 신장에서 섬유아세포의 분열과 (도 4A), 세포자멸을 현저히 억제하는 것으로 나타났다 (도 4B).
실시예 4. 만성 콩팥병에 대한 신장 기능 회복 효과
만성 콩팥병 마우스에서 송과선 호르몬 처리 중간엽 줄기세포에서 추출한 세포외소포체에 의한 신장 기능 회복 효과를 확인하기 위해, 상기 실시예 2에서 제작한 만성 콩팥병 마우스에서 신장 조직 및 혈청을 수집한 뒤, 신장 조직에서 물 재흡수 관련 단백질인 AQP2(Aquaporin 2) 및 AQP5(Aquaporin 5)의 발현을 확인하고, 혈청에서 신장 기능 지표인 BUN(blood urea nitrogen) 및 크레아틴(creatinine)의 수치를 확인하였다.
그 결과, 만성 콩팥병 동물에게 송과선 호르몬 처리 중간엽 줄기세포에서 추출한 세포외소포체를 투여하는 경우 AQP2 및 AQP5의 발현이 농도 의존적으로 회복되는 것으로 나타났다 (도 5A 및 B). 아울러, 만성 콩팥병 마우스에서 현저히 증가한 BUN 수치 및 크레아틴 수치가 송과선 호르몬 처리 중간엽 줄기세포에서 추출한 세포외소포체 처리에 의해 농도 의존적으로 현저히 감소하는 것으로 나타났다 (도 5C 및 D).
실시예 5. 당뇨병성 만성 콩팥병 질환 마커 microRNA 발현 변화 확인
당뇨병성 콩팥병 환자의 소변에서 정상인에 비해 발현이 증가되어 당뇨병성 만성 콩팥병 질환의 마커로 활용되는 microRNA의 발현에 본 발명의 송과선 호르몬 처리 중간엽 줄기세포에서 추출한 세포외소포체가 미치는 영향을 만성 콩팥병 마우스에서 확인하였다. 구체적으로, 상기 실시예 2에서 제작한 만성 콩팥병 마우스에 송과선 호르몬 처리 중간엽 줄기세포에서 추출한 세포외소포체를 주입한 후, 동물을 안락사하여 신장 조직을 분리한 뒤 mirVana™miRNA Isolation Kit를 이용하여 이로부터 microRNA를 분리하였다. 그 후, 당뇨병성 만성 콩팥병 환자에게서 발현이 증가한다고 알려진 miR-4270, miR-4739, miR-636, miR-320c 및 miR-572의 발현을 maxima SYBR/ROX qPCR master mix kit를 이용하여 확인하였다.
그 결과, 만성 콩팥병 동물에게 송과선 호르몬 처리 중간엽 줄기세포에서 추출한 세포외소포체 주입시 당뇨병성 만성 콩팥병 마커인 miR-4270, miR-4739, miR-636, miR-320c 및 miR-572의 발현이 현저하게 감소하는 것으로 나타나 (도 6), 본 발명의 송과선 호르몬 처리 중간엽 줄기세포에서 추출한 세포외소포체가 당뇨병성 만성 콩팥병의 치료에도 효과가 있을 수 있음을 유추할 수 있다.

Claims (15)

  1. 송과선(pineal gland) 호르몬 처리된 중간엽 줄기세포 또는 이의 배양액으로부터 추출된 세포외소포체를 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환 또는 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 세포외소포체는 miR-29b-3p, let-7a-3p, let-7b-5p, let-7c-3p, miR-153-3p, miR-26a-2-3p 또는 miR-486-5p가 과발현된, 염증성 질환 또는 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 또는 태반 유래 중간엽 줄기세포인, 염증성 질환 또는 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 염증성 질환은 당뇨병, 대장염, 만성 및 급성 위염 또는 장염, 급성 및 만성 신장염, 급성 및 만성 간염, 만성 폐쇄성 폐질환, 과민성 대장 증후군, 염증성 통증, 관절염, 류머티즘성 관절염, 강직성 척추염 및 췌장염으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인, 염증성 질환 또는 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 섬유화 질환은 신장 섬유화, 간 섬유화 및 폐 섬유화 질환으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인, 염증성 질환 또는 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제 1항에 있어서, 송과선 호르몬 처리된 중간엽 줄기세포 또는 이의 배양액으로부터 추출된 세포외소포체는:
    (a) 송과선 호르몬과 공배양된 줄기세포의 세포배양액을 필터를 이용하여 여과하는 단계;
    (b) 여과한 세포배양액에서 세포외소포체를 접선유동여과법(Tangential Fluid Filtration)으로 분리하는 단계; 및
    (c) 분리한 세포외소포체를 원심분리필터(centrifugal filter)로 농축하는 단계를 포함하는 제조방법에 의해 제조되는, 염증성 질환 또는 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 송과선 호르몬 처리된 중간엽 줄기세포 또는 이의 배양액으로부터 추출된 세포외소포체를 유효성분으로 포함하는, 만성 콩팥병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 제 7항에 있어서, 세포외소포체는 miR-29b-3p, let-7a-3p, let-7b-5p, let-7c-3p, miR-153-3p, miR-26a-2-3p 또는 miR-486-5p가 과발현된, 만성 콩팥병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 제 7항에 있어서, 만성 콩팥병 질환은 당뇨병성 신장병(diabetic nephropathy), 고혈압성 신장병(hypertensive nephropathy), 허혈성 신장병(Ischemic nephropathy)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인, 만성 콩팥병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 제 7항에 있어서, 송과선 호르몬 처리된 중간엽 줄기세포 또는 이의 배양액으로부터 추출된 세포외소포체는:
    (a) 송과선 호르몬과 공배양된 줄기세포의 세포배양액을 필터를 이용하여 여과하는 단계;
    (b) 여과한 세포배양액에서 세포외소포체를 접선유동여과법으로 분리하는 단계; 및
    (c) 분리한 세포외소포체를 원심분리필로 농축하는 단계를 포함하는 제조방법에 의해 제조되는, 만성 콩팥병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  11. 제 7항에 있어서, 항염증(anti-inflammatory) 효과를 가지는 만성 콩팥병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  12. 제 7항에 있어서, 항섬유화(anti-fibrotic) 효과를 가지는 만성 콩팥병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  13. miR-29b-3p, let-7a-3p, let-7b-5p, let-7c-3p, miR-153-3p, miR-26a-2-3p 및 miR-486-5p로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마이크로 RNA를 유효성분으로 포함하는, 만성 콩팥병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  14. 제 13항에 있어서, 세포외소포체 유래 마이크로 RNA인, 만성 콩팥병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  15. 제 13항에 있어서, 마이크로 RNA는:
    (ⅰ) 송과선 호르몬과 공배양된 줄기세포의 세포배양액을 필터를 이용하여 여과하는 단계;
    (ⅱ) 여과한 세포배양액에서 세포외소포체를 접선유동여과법으로 분리하는 단계; 및
    (ⅲ) 분리한 세포외소포체에서 마이크로 RNA를 분리하는 단계를 포함하는 제조방법에 의해 제조되는, 만성 콩팥병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
KR1020210108064A 2021-08-17 2021-08-17 줄기세포 유래 세포외소포체를 유효성분으로 포함하는 조성물 KR20230026096A (ko)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210108064A KR20230026096A (ko) 2021-08-17 2021-08-17 줄기세포 유래 세포외소포체를 유효성분으로 포함하는 조성물
PCT/KR2022/012195 WO2023022473A1 (ko) 2021-08-17 2022-08-16 줄기세포 유래 세포외소포체를 유효성분으로 포함하는 조성물

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210108064A KR20230026096A (ko) 2021-08-17 2021-08-17 줄기세포 유래 세포외소포체를 유효성분으로 포함하는 조성물

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230026096A true KR20230026096A (ko) 2023-02-24

Family

ID=85240859

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020210108064A KR20230026096A (ko) 2021-08-17 2021-08-17 줄기세포 유래 세포외소포체를 유효성분으로 포함하는 조성물

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR20230026096A (ko)
WO (1) WO2023022473A1 (ko)

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201601544D0 (en) * 2016-01-28 2016-03-16 Univ Cardiff Kidney disease diagnostic
KR102222826B1 (ko) * 2020-05-21 2021-03-05 주식회사 스템바이오 멜라토닌과 공배양된 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀의 만성콩팥병의 예방 또는 치료에서의 용도

Also Published As

Publication number Publication date
WO2023022473A1 (ko) 2023-02-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20200084817A (ko) 비만의 예방 또는 치료 효과를 가지는 신규 락토바실러스 람노서스 균주 및 이의 용도
US11241459B2 (en) Treating liver fibrosis using adipose stem cell-derived exosomes as active ingredient
KR101484587B1 (ko) 미역귀와 멍게껍질의 혼합물 추출액을 포함하는 아토피성 피부염 개선용 조성물
TW201836669A (zh) 抑制肌纖維變性用組成物
KR102534210B1 (ko) 노봉방 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
KR101193540B1 (ko) 황기，계지 및 황백의 혼합생약재 추출물을 포함하는 골다공증 및 골질환 예방 및 치료용 조성물
EP4378468A1 (en) Composition for treating muscle loss-related diseases comprising exosomes derived from tonsil mesenchymal stem cells
KR101864234B1 (ko) 음경해면체 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 발기부전 예방, 개선 또는 치료용 조성물
KR20230026096A (ko) 줄기세포 유래 세포외소포체를 유효성분으로 포함하는 조성물
JP6034107B2 (ja) 幹細胞から褐色脂肪細胞への分化促進剤
KR101941183B1 (ko) 오미자 추출물을 포함하는 관절염의 예방 또는 개선용 조성물 및 그 제조방법
KR102324233B1 (ko) 용규 추출물의 신규 용도
EP4248964A1 (en) Pharmaceutical composition for treating sepsis, and use thereof
JP2014015429A (ja) サテライト細胞分化促進剤
WO2006006750A1 (en) A method for preparing purified extract from wild ginseng showing anticancer activity and the composition comprising the same
KR20200112092A (ko) 지방줄기세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 전신경화증의 예방, 치료, 또는 개선용 조성물
US20240287133A1 (en) Peptide having activity of preventing hair loss or promoting hair growth, and use thereof
KR102629635B1 (ko) 신규한 비피도박테리움 롱검 균주 및 이의 용도
JP2014015428A (ja) サテライト細胞分化促進剤
KR20150022358A (ko) 아토피성 피부염 개선용 추출액의 제조방법
EP4410810A1 (en) Peptide having activity of preventing hair loss or promoting hair growth, and use thereof
EP4410814A1 (en) Peptide having activity of preventing hair loss or promoting hair growth and use thereof
EP4410811A1 (en) Peptide having hair loss prevention or hair growth promotion activity and use thereof
KR20180042729A (ko) 상지 주정 추출물을 함유하는 장질환을 예방 또는 치료하기 위한 조성물
EP4410813A1 (en) Peptide having hair loss prevention or hair growth promotion activity, and use thereof

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application