CN104887813B

CN104887813B - 五味子醇提物及其在制备抗肝纤维化药物中的应用

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Publication number: CN104887813B
Application number: CN201510257431.0A
Authority: CN
Inventors: 张海; 张国庆; 柴逸峰
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2015-05-19
Filing date: 2015-05-19
Publication date: 2019-03-08
Anticipated expiration: 2035-05-19
Also published as: CN104887813A

Abstract

本发明涉及医药技术领域。本发明提供了一种五味子醇提物，及其提取方法，以及该五味子醇提物在制备抗肝纤维化药物中的应用。本发明提供了五味子醇提物成分新的医药用途，经药效学研究表明，五味子醇提物可显著降低大鼠血清中ALT、AST的浓度，改善肝纤维化症状，具有良好的抗肝纤维化活性，因此可用于制备抗肝纤维化药物或保健食品。

Description

五味子醇提物及其在制备抗肝纤维化药物中的应用

技术领域：

本发明涉及医药技术领域，具体涉及五味子醇提物在制备抗肝纤维化药物或保健食品中的应用。

背景技术：

肝炎、肝纤维化、肝硬化和肝癌，是目前临床上的常见病、多发病，严重威胁着人们的健康和生命。肝炎是一种世界性肝病，目前全球约有3亿肝炎患者，我国乙肝病毒感染者约有1亿多人，其中经过肝纤维化后，发展成肝癌的约有30-40万人。另外，目前中国环境污染造成的化学毒物或毒素性肝损伤，以及酗酒人群增加导致的酒精性肝病，慢性肝病患者在2000万人的基数上不断攀升。每年用于肝病的医疗、保健费用达1000多亿元。由于在肝病治疗方面缺乏有效的治疗药物，肝损伤长时间得不到治愈，导致大量慢性肝炎出现，其中很大一部分会转变成肝硬化和肝癌。

肝纤维化是肝脏对各种病因(病毒、寄生虫感染、药物性损伤)所致慢性肝损伤的修复反应，是大多数慢性肝病共有的病理特征，是进一步向肝硬化发展，甚至恶变的主要中间环节。有研究发现肝纤维化甚至早期肝硬化都是可以逆转的，阻断或延缓肝纤维化的发生发展，对于多种伴随肝纤维化的慢性肝病的治疗具有重要意义。早期预防肝纤维化的发生发展或促进其逆转，是防止肝硬化发生发展的重要策略。目前对治疗肝损伤、肝纤维化、肝硬化和肝癌的药物研究有很多，其主要运用抗病毒、抗纤维化等治疗措施，但严重的副作用问题日益突出。因此，致力于抗肝纤维化药物的研究开发，将具有很大的社会效益和经济效益。

五味子为木兰科植物五味子的干燥成熟果实,主要产于西北和东北地区。五味子的干燥成熟果实是民间常用的滋补性中药，在传统中医学中具有敛肺滋肾，生津止汗，涩精止泻，宁心安神等功效，可用于肺虚咳嗽、津亏口渴、盗汗、慢性腹泻等病症的治疗。五味子中主要含有五味子多糖、挥发油和木脂素成分。现代药理研究表明，醇提物成分具有多种生物活性：保肝、抗氧化、抗老年痴呆、调节血压、改善胆固醇血症、抗癌等作用。

目前尚无文献报道五味子醇提物具有抗肝纤维化功效。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种五味子醇提物；本发明的另一目的在于提供该五味子醇提物的制备方法；本发明的第三目的在于提供五味子醇提物的新的医药用途，具体是在制备抗肝纤维化药物或保健食品中的应用。

本发明的第一方面，提供一种五味子醇提物，所述的五味子醇提物是根据如下方法制备得到的：

(A)提取：将五味子药材粉碎后，投入提取罐，加入80％-95％乙醇，提取温度60-80℃，乙醇水用量为药材重量的5-30倍，提取次数1-3次，提取时间为1-3小时，合并提取液；

(B)浓缩：将上述提取液合并后进行过滤，浓缩至无醇状态；

(C)萃取：取(B)中浓缩液加水稀释，用乙酸乙酯萃取1-5次，合并萃取液，浓缩至干；

(D)纯化：取(C)中浓缩干的样品，用1-2倍重量的乙酸乙酯溶解，拌上正相硅胶，烘干后上样，硅胶与样品的重量比为0.5：至2：1之间，然后过正相柱层析；装柱硅胶体积与上样体积比例为5-25︰1；上样流速为1-4ml·min^-1；吸附时间为2-8h；以石油醚乙酸乙酯体系做洗脱剂，石油醚：乙酸乙酯分别按照10：1，5：1，1：1，1：5依次，洗脱，用量为2-10倍柱体积，洗脱流速为2-6Bv·h^-1，收集洗脱比例为1：1至1：10比例的馏分，浓缩至干，得五味子提取物。

本发明的第二方面，提供一种五味子醇提物的制备方法，所述的制备方法如下：

(B)浓缩：将上述提取液合并后进行过滤，浓缩至无醇状态；

本发明的第三方面，提供了五味子醇提物在制备抗肝纤维化药物或保健食品中的应用。

所述的五味子醇提物是用以下工艺方法制得的：

(B)浓缩：将上述提取液合并后进行过滤，浓缩至无醇状态；

上述步骤中，最关键的是步骤A、C和步骤D。

如果不是用乙酸乙酯萃取，而采用其它萃取方法，无法更好地将木脂素类成分萃取出来，采用乙酸乙酯萃取木脂素类成分的含量高。

所述的快速正相柱层析中的“快速”是指本发明采用上样体积比例为5-25︰1；上样流速为1-4ml·min^-1；吸附时间为2-8h；分别先以水、15％除杂；以石油醚乙酸乙酯体系做洗脱剂，石油醚乙酸乙酯用量为2-10倍柱体积，洗脱流速为2-6Bv·h^-1。

本发明所得的五味子醇提物，其中总木脂素类成分的含量(重量百分比)为：25％，五味子甲素：2％，五味子乙素：12％，五味子丙素：3％。

本发明所述的五味子醇提物在制备抗肝纤维化药物或保健食品中的应用，所述的药物是由药物活性成分五味子醇提物成分和药学上可接受的辅料组成的药物组合物。

所述的药学上可接受的辅料是指药学领域常规的药物辅料，其中，稀释剂、赋形剂如水等；粘合剂如纤维素衍生物、明胶或聚乙烯吡咯烷酮等；填充剂如淀粉等；崩裂剂如碳酸钙或碳酸氢钠；也可以在组合物中加入其他辅助剂如香味剂和/或甜味剂。

所述的药物组合物可采用医学领域常规的方法，将五味子醇提物作为活性成分，与药学上可接受的辅料制成各种剂型。当口服时，可将其制备成常规的固体制剂如片剂、粉剂或胶囊剂等；用于注射时，可将其制备成注射液。在各种制剂中，活性成分的重量含量为0.1％～99.9％，优选的重量含量为0.5～90％。

所述的药物组合物可以用于制备抗肝纤维化药物制剂。

可以按剂型通过腹腔注射、皮下注射、静脉注射、肌肉注射、淋巴结内注射、粘膜用药等途径应用于需要治疗的个体。个体可以是人或动物。剂量一般为1～1000mg/公斤体重/天，具体可根据个体的年龄、病情等进行变化。

本发明人研究发现五味子醇提物具有显著的抗肝纤维化活性。本发明经动物实验证明：五味子醇提物可显著降低CCl₄诱导的肝纤维化大鼠血清中ALT、AST的浓度，改善肝组织病理症状，提高大鼠肝脏III型胶原的含量，具有良好的抗肝纤维化活性，因此可用于制备抗肝纤维化药物或食品。

附图说明：

图1：BDL的HE染色，A为假手术组(空白对照组)，B为模型组，C为给药组(五味子醇提物组)；

图2：BDL的S-red染色，A为假手术组(空白对照组)，B为模型组，C为给药组(五味子醇提物组)；

图3：CCL₄造模给药后HE染色，A为假手术组(空白对照组)，B为模型组，C为给药组(五味子醇提物组)；

图4：CCL₄造模给药后S-red染色，A为假手术组(空白对照组)，B为模型组，C为给药组(五味子醇提物组)。

具体实施方式：

以下结合附图和具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

本实施例所用的五味子，于2013年8月购自上海雷允上大药房有限公司，经中国人民解放军第二军医大学药学院生药学教研室孙莲娜副教授鉴定为五味子。

实施例1：五味子醇提物1的制备

(1)制备提取液：将五味子药材粉碎后，投入提取罐，即80％乙醇，提取温度60℃，乙醇用量5倍，提取次数3次，提取时间为1h，合并提取液；

(2)精制浓缩：将上述提取液进行过滤，浓缩至无醇状态；

(3)乙酸乙酯萃取，浓缩：浓缩液加水稀释，依次乙酸乙酯萃取1次，合并萃取液，浓缩至小体积。

(4)纯化：硅胶榜样，过快速正相柱层析。上样体积比例为5︰1；上样流速为1ml·min^-1；吸附时间为2h；分别先以水、15％除杂。以石油醚乙酸乙酯体系做洗脱剂，石油醚乙酸乙酯用量为2倍柱体积，洗脱流速为2Bv·h^-1；得五味子醇提物1。

实施例2：五味子醇提物2的制备

(1)制备提取液：将五味子药材粉碎后，投入提取罐，即95％乙醇，提取温度80℃，乙醇用量30倍，提取次数2次，提取时间为2h，合并提取液；

(2)精制浓缩：将上述提取液进行过滤，浓缩至无醇状态；

(3)乙酸乙酯萃取，浓缩：浓缩液加水稀释，依次乙酸乙酯萃取5次，合并萃取液，浓缩至小体积。

(4)纯化：硅胶榜样，过快速正相柱层析。上样体积比例为25︰1；上样流速为4ml·min^-1；吸附时间为8h；分别先以水、15％除杂。以石油醚乙酸乙酯体系做洗脱剂，石油醚乙酸乙酯用量为10倍柱体积，洗脱流速为6Bv·h^-1；得五味子醇提物2。

实施例3：五味子醇提物对胆总管结扎肝纤维化模型大鼠的治疗作用

胆总管结扎肝纤维化实验(徐叔云，卞如濂，陈修.药理实验方法学，第3版[M].北京：人民卫生出版社，2002：807)。具体方法如下：

SD大鼠，雌雄各半，6～8周龄，体重200±10g，中国人民解放军第二军医大学实验动物中心提供。

饲养室温度18-22℃，相对湿度60％-75％，人工混合饲料喂养。

随机分组，每组10只大鼠：假手术组、模型组、给药组(五味子醇提物1，80mg/kg·d)，假手术组仅腹部切开，分离胆总管，不做胆总管结扎，然后缝合。给药组于胆总管结扎术三天后进行给药五味子，假手术组和模型组灌胃等量的生理盐水。给药3w后，于第25天处死老鼠。取相同部位肝组织中性甲醛固定，备做石蜡切片，进行HE和天狼星红染色，其余肝组织液氮冻存。肝门静脉取血，静止后，离心取血清。检测HA(透明质酸酶),LN蛋白,III型胶原氨基末端,V型胶原,总蛋白,总胆红素。结果见表1，图1，图2。

表1：胆总管结扎大鼠模型给药五味子提取物后的生化检测指标

由表1可见，相对于假手术组与模型组，五味子醇提物组中的HA(透明质酸酶),LN蛋白,V型胶原,总蛋白,总胆红素、III型胶原氨基末端等指标都显著降低。并结合图1图2可见，给药组的胶原合成量较模型组明显降低，说明五味子醇提取物对胆总管结扎肝纤维化有治疗作用。

实施例4：五味子醇提物对CCL₄诱导的肝纤维化模型的大鼠治疗作用

CCL4诱导的肝纤维化模型实验(徐叔云，卞如濂，陈修.药理实验方法学，第3版[M].北京：人民卫生出版社，2002：807)。具体方法如下：

饲养室温度18-22℃，相对湿度60％-75％，人工混合饲料喂养。

随机分组，每组10只大鼠：空白对照组、模型组、给药组(五味子醇提物1，80mg/kg·d)。对各组大鼠按照2ml/kg的注射剂量腹腔注射35％的CCL4花生油溶液，每周2次，共注射6w，诱导肝纤维化模型的形成。从第7周开始给药组灌胃给药五味子醇提物，模型组和空白对照组灌胃等量的生理盐水。共给药三周，在三周后处死老鼠。取相同部位肝组织中性甲醛固定，备做石蜡切片，进行HE和S-red染色，其余肝组织液氮冻存。肝门静脉取血，静止后，离心取血清。检测HA(透明质酸酶),LN蛋白,III型胶原氨基末端,V型胶原,总蛋白,总胆红素。结果见表2，图3，图4。

表2：CCL₄造模后给药生化检测指标

由表2可见，五味子醇提物成分能显著降低HA(透明质酸酶)和Piii值,升高TBIl值等指标。并结合图3、4可见，给药组的胶原合成量较模型组明显降低，说明五味子醇提物对慢性肝纤维化有着抑制作用。

上述实验结果表明，五味子醇提物成分可显著降低大鼠血清中ALT、AST的浓度，改善肝组织病理症状，减低大鼠肝脏III型胶原的含量，说明五味子提取物具有良好的抗肝纤维化活性，因此可用于制备抗肝纤维化药物或食品。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims

1.一种五味子醇提物在制备治疗肝纤维化药物中的应用，所述的五味子醇提物是根据如下方法制备得到的：

(B)浓缩：将上述提取液合并后进行过滤，浓缩至无醇状态；

(D)纯化：取(C)中浓缩干的样品，用1-2倍重量的乙酸乙酯溶解，拌上正相硅胶，烘干后上样，硅胶与样品的重量比为0.5至2︰1之间，然后过正相柱层析；装柱硅胶体积与上样体积比例为5-25︰1；上样流速为1-4ml·min^-1；吸附时间为2-8h；以石油醚乙酸乙酯体系做洗脱剂，石油醚:乙酸乙酯分别按照10:1，5:1，1:1，1:5，1:10依次洗脱，用量为2-10倍柱体积，洗脱流速为2-6Bv·h^-1，收集洗脱比例为1:1至1:10比例的馏分，浓缩至干，得五味子提取物。

2.根据权利要求1所述的五味子醇提物在制备治疗肝纤维化药物中的应用，其特征在于，其中步骤(D)中的正相硅胶，是SKS正相硅胶。

3.根据权利要求1或2所述的五味子醇提物在制备治疗肝纤维化药物中的应用，所述的药物中五味子醇提物的重量百分比为0.1％～99.9％。