CN103263462B

CN103263462B - 小槐花提取物及提取方法和提取物的新用途

Info

Publication number: CN103263462B
Application number: CN201310228040.7A
Authority: CN
Inventors: 张前军; 康文艺; 刘超
Original assignee: Guizhou University
Current assignee: Guizhou Beijixing Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2013-06-08
Filing date: 2013-06-08
Publication date: 2014-10-15
Anticipated expiration: 2033-06-08
Also published as: CN103263462A

Abstract

本发明小槐花提取物及提取方法和提取物的新用途，涉及中草药提取物及其应用，以小槐花植物全草为原料，经乙醇水提取，回收乙醇，得乙醇总提物浸膏；乙醇总提物浸膏用水分散，依次分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收萃取剂分别得到萃取物浸膏，从小槐花提取物乙酸乙酯萃取物浸膏中分离得到得到羽扇豆醇，从小槐花提取物正丁醇萃取物浸膏中分离得到当药黄素，研究发现小槐花乙酸乙酯萃取物浸膏、羽扇豆醇和当药黄素具有抗凝血活性，可用于制备抗凝血药物。

Description

小槐花提取物及提取方法和提取物的新用途

技术领域

本发明涉及中草药提取物及其应用，具体地说是小槐花提取物及提取方法和提取物的新用途。

背景技术

小槐花（Desmodium caudatum (Thunb.) DC），又名清酒缸、草鞋板、拿身草、羊带归，是豆科(Leguminosae)山蚂蝗属植物，为直立灌木或亚灌木，产于我国长江以南各省，其味苦，性凉，具有清热利湿，消积散淤的功效，主治劳伤咳嗽，吐血，水肿，小孩疳积，跌打损伤。

羽扇豆醇：分子式C₃₀H₅₀O，白色粉末。据报道有抗肿瘤；抗高血压；降血糖的药化作用。

当药黄素：分子式C₂₂H₂₂O10，黄色粉末（甲醇），mp 239~242℃。据报道有保肝活性。

心脑血管疾病是心血管疾病和脑血管疾病的统称，泛指由于高脂血症、血液黏稠、动脉粥样硬化、高血压等所导致的心脏、大脑及全身组织发生缺血性或出血性疾病的通称，是一种严重威胁人类，特别是50岁以上中老年人健康的常见病，全世界每年死于心脑血管疾病的人数高达1500万人，居各种死因首位。心脑血管疾病已成为人类死亡病因最高的头号杀手。

治疗心脑血管的药物主要有两大类：一类是单纯的扩血管，另一类是溶栓溶脂类。在溶栓溶脂类药物中，常用的抗凝血药物有肝素类、香豆素类、抗血小板药，和溶栓酶类。

本发明人发现从小槐花的提取物中得到的乙酸乙酯萃取物浸膏、羽扇豆醇和当药黄素制备止抗凝血药物方面具有新的用途。

发明内容

本发明的目的在于提供一种小槐花的提取物。

本发明的目的还在于提供小槐花的乙酸乙酯萃取物浸膏、提取物中羽扇豆醇和当药黄素的制备方法。

本发明小槐花提取物，其特征是以小槐花植物全草为原料，经70～90%v/v乙醇水回流或冷浸提取，回收溶剂乙醇，得乙醇总提物浸膏；乙醇总提物浸膏用水分散，依次分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收萃取剂得石油醚萃取物浸膏、乙酸乙酯萃取物浸膏和正丁醇萃取物浸膏。小槐花乙醇总提物浸膏、乙酸乙酯萃取物浸膏皆为为褐色胶状浸膏，小槐花乙醇总提物浸膏、乙酸乙酯萃取物浸膏的乙醇溶液用紫外分光光度扫描，在240-250nm间有吸收峰，从小槐花提取物乙酸乙酯萃取物浸膏中分离得到羽扇豆醇，从小槐花提取物正丁醇萃取物浸膏中分离得到当药黄素；小槐花乙酸乙酯萃取物浸膏、羽扇豆醇和当药黄素具有抗凝血活性。

上述小槐花提取物的提取方法：其特征是指从小槐花中提取的乙酸乙酯萃取物浸膏、羽扇豆醇和当药黄素的方法，依次按下列步骤在一定条件下进行提取：

（1）干燥的小槐花全草用70%-90%乙醇回流提取或冷浸得乙醇提取液；

（2）乙醇提取液减压蒸馏回收乙醇后，得乙醇总提物浸膏；

（3）乙醇总提物浸膏溶于水得乙醇总提物浸膏水分散液；

（4）水分散液用石油醚萃取，弃有机相，保留水相1；

（5）水相1用乙酸乙酯萃取，得有机相乙酸乙酯萃取液和水相2；

（6）乙酸乙酯萃取液蒸馏回收乙酸乙酯得乙酸乙酯萃取物浸膏；

（7）乙酸乙酯浸膏经水分散后用硅胶柱拌样上柱，进行硅胶柱层析分离，用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，得羽扇豆醇洗脱液；

（8）羽扇豆醇洗脱液回收有机溶剂后得羽扇豆醇；经乙酸乙酯溶剂重结晶得羽扇豆醇纯品；

（9）步骤（5）的水相2用正丁醇萃取，得正丁醇萃取液，水相弃；

（10）正丁醇萃取液蒸馏回收有机溶剂得正丁醇浸膏；

（11）正丁醇浸膏经水分散后，经大孔树脂柱层析，甲醇梯度洗脱得60%甲醇洗脱液；

（12）60%甲醇洗脱液经硅胶柱层析，氯仿-甲醇梯度洗脱得当药黄素洗脱液；

（13）当药黄素洗脱液回收有机溶剂得当药黄素。

上述小槐花提取物的提取方法的各步骤工艺条件为：

（1）每次乙醇重量为干燥的小槐花全草的2-4倍，乙醇回流提取时间为2小时或乙醇冷浸7天，反复提取三次，合并三次提取液得乙醇提取液；

（2）乙醇提取液减压蒸馏回收乙醇后得小槐花乙醇总提物浸膏；

（3）乙醇总提物浸膏用10~12倍量水溶解分散；

（4）水分散液用2~4倍体积的石油醚反复萃取5次，弃有机相，留水相1；

（5）水相1用2~4倍体积的乙酸乙酯反复萃取5次，合并萃取液得乙酸乙酯萃取液和水相2；

（6）乙酸乙酯提取液减压蒸馏回收乙酸乙酯后得小槐花乙酸乙酯提取物浸膏；

（7）乙酸乙酯浸膏经乙酸乙酯分散后用80目硅胶拌样，重量比浸膏:硅胶=1:1.5，上硅胶柱层析，硅胶粒度200-300目，经体积比石油醚-乙酸乙酯100:1~ 0:1溶剂系统梯度洗脱，经TLC检测并合并相同流分，得5个组分，组分编号为B₁ –B₅，组分B₂经硅胶柱色谱，用石油醚: 乙酸乙酯=15:1洗脱液洗脱，得羽扇豆醇洗脱液；

（8）羽扇豆醇洗脱液回收有机溶剂后得羽扇豆醇粗品；经乙酸乙酯溶剂重结晶得羽扇豆醇纯品；

（9）水相2以正丁醇分别萃取5次，合并得正丁醇萃取液；

（10）正丁醇萃取液减压蒸馏回收正丁醇，得正丁醇萃取物浸膏；

（11）正丁醇萃取物浸膏经水分散后，经大孔树脂柱色谱分离，大孔树脂为HPD-100，依次用水、20%甲醇、40%甲醇、60%甲醇、80%甲醇、100%甲醇洗脱，取60%甲醇洗脱液；

（12） 60%甲醇洗脱液经硅胶柱色谱经体积比氯仿:甲醇=30:1-0:1梯度洗脱，经TLC检测并合并相同流分，得4个部分（D₁-D₄)，组分D₂经柱层析经体积比氯仿:甲醇=20:1-0:1溶剂系统梯度洗脱，经硅胶柱色谱，Sephadex LH-20凝胶柱色谱，反复柱层析得到当药黄素洗脱液；

（13）当药黄素洗脱液回收有机溶剂得当药黄素。

本发明小槐花提取物的应用，是指小槐花植物全草的乙酸乙酯萃取物浸膏、从小槐花提取物中分离得到的羽扇豆醇和当药黄素在制备用于抗凝血药物或药剂方面的应用。

上述的小槐花提取物的应用是指小槐花植物全草的萃取物浸膏、从小槐花提取物中分离得到的羽扇豆醇和当药黄素在制备用于抗凝血药物的药剂有：栓剂、片剂、丸剂、颗粒剂、膜剂、微囊剂、滴丸剂、气雾剂、酒剂、糖浆剂、口服液和注射剂。

本发明乙酸乙酯重结晶所得羽扇豆醇，白色粉末（氯仿），mp215℃~217℃。EI-MS m/z:426[M⁺],411，393，218，207，189，175，161，147，135，121，109，95，69，55；¹H-NMR(CDCl₃, 500MHz）δ:0.77（3H，s，H-24），0.80（3H，s，H-28），0.85（3H，s，H-26），1.69（3H，s，H-30），4.57（1H，br s，H-29），4.69（1H，br s，29-H），3.19（1H，dd，J=10，H-3)；¹³C-NMR（500Hz，CDCl₃)δ: 38.3(C-1)，27.7(C-2)，79.2 (C-3)，38.9(C-4)，55.5(C-5)，18.2(C-6)，34.2(C-7)，41.0(C-8)，50.7(C-9)，35.8(C-10)，19.2(C-11)，25.4 (C-12)，37.4(C-13)，43.0(C-14)，28.2(C-15)，34.9 (C-16)，43.2(C-17)，48.5(C-18)，48.2(C-19)，151.2 (C-20)，29.9(C-21)，39.1(C-22)，27.6(C-23)，21.2 (C-24)，16.2(C-25)，15.6(C-26)，14.8(C-27)，16.3(C-28)，109.5(C-29)，18.5(C-30)。根据光谱及相关信息鉴定该化合物为羽扇豆醇，其光谱数据与文献（罗永明等. 中药草珊瑚的化学成分研究[J]. 中国药学杂志, 2005, 40(17):1296-1298)一致。

本发明所得当药黄素: 黄色粉末，mp 239~242℃。UVλ_max270, 337; EI-MS m/z: 445(M-H)⁺, ESI-MS: 447(M+H)⁺。¹H-NMR(CD₃OD，500MHz) δ: 13. 511( 1H, s, 5-OH), 10. 400( 1H, br, 4’-OH), 6. 843( 1H, s, 8-H), 6. 833( 1H, s, 3H), 6. 956( 2H, d, 11.0Hz, 3′5′-H), 7. 996( 2H, d, 11. 0Hz, 2’6’-H), 3. 874( 3H, s, OCH3)。glu: 4. 579( 1H, d, 12.0Hz, H-1’’), 4. 006( 1H, t , 12. 0Hz, H-2’’), 3. 116( 1H, t =7. 5Hz, H-3’’), 4. 200( 1H, t, 11. 5Hz, H-4’’), 3. 209( 1H, t, 10. 0Hz, H-5’’), 3. 401( 1H, m, H1-6’’), 3. 696( 1H, d,14.0Hz, H2-6′′)。¹³C-NMR(500Hz，CD₃OD)δ: 163. 939( C-2), 103.085( C-3), 182. 001( C-4), 159. 620( C-5),109. 663( C-6), 156. 774( C-7), 90. 236( C-8), 156. 881( C-9), 104. 146( C-10), 120.994(C-1′), 128. 610( C-2′), 116. 042(C-3′), 161. 390(C-4’), 116. 040( C-5’),128. 619( C-6’); glu: 72.632( C-1’’), 70. 305( C-2’’), 79.131( C-3’’), 69. 664( C-4’’), 81. 766( C-5’’),61. 804( C-6’’); 56. 310( OCH3)。以上数据与文献（陈艳等. 兔尾草化学成分的研究[J]. 中成药, 2009, 2(13): 266-269.）报道的当药黄素一致。

本发明的技术方案采用了一种小槐花提取物应用，是指上述小槐花全草乙酸乙酯萃取物浸膏在制备用于止血凝血药物的应用。本发明的技术方案羽扇豆醇和当药黄素的应用，是指羽扇豆醇和当药黄素在制备用于抗凝血药物的应用。

采用了抗凝血作用实验，检测各样品对血浆复钙时间的影响，结果表明小槐花乙酸乙酯部分、羽扇豆醇、当药黄素与灯盏花素显著性差异较小（p＞0.01），显示其抗凝血活性显著。

通过采用本发明的方法处理所得的小槐花提取物、羽扇豆醇和当药黄素可以制成各种制剂，包括：栓剂、片剂、丸剂、颗粒剂、膜剂、微囊剂、滴丸剂、气雾剂、酒剂、糖浆剂、口服液和注射剂。本发明所提供的小槐花提取物、羽扇豆醇和当药黄素具有显著的抗凝血活性，可作为用于制备在抗凝血药物使用，这是本发明人新的发现，从小槐花中提取羽扇豆醇和当药黄素也是本发明人首先提出。

附图说明：

图1. 本发明提取方法工艺流程示意图；

图2. 乙醇总浸膏的乙醇水溶液紫外分光扫描图。在240-440nm间有吸收峰；

图3. 乙酸乙酯萃取物浸膏的乙醇水溶液紫外分光扫描图。在240-440nm间有吸收峰，说明乙酸乙酯萃取物浸膏与乙醇总浸膏有相同成分；

图4. 当药黄素乙醇水溶液紫外分光扫描图，在270和345nm附近有两个吸收峰，为黄酮化合物的典型吸收蜂。

具体实施方式

实施例1

制备方法按下列方法和条件制备：

（1）取干燥的小槐花全草17 kg粉碎，加入2-4倍70-90%v/v乙醇水溶液，冷浸提取3次，每次7天，合并三次提取液得乙醇提取液；

（3）乙醇总提物浸膏用10~12倍量水溶解分散；

（6）乙酸乙酯提取液减压蒸馏回收乙酸乙酯后得小槐花乙酸乙酯提取物浸膏63.5g；

（7）乙酸乙酯浸膏经乙酸乙酯分散后用80目硅胶拌样，浸膏: 硅胶=1:1.5，上硅胶柱层析，硅胶粒度200-300目，经体积比石油醚-乙酸乙酯100:1~ 0:1溶剂体系梯度洗脱，经TLC检测并合并相同流分，得5个组分，组分编号为B₁ –B₅，组分B₂经硅胶柱色谱，用石油醚: 乙酸乙酯=15:1洗脱液洗脱，得羽扇豆醇洗脱液；

（8）羽扇豆醇洗脱液回收有机溶剂后得羽扇豆醇粗品；经乙酸乙酯溶剂重结晶得羽扇豆醇纯品78mg；

（9）水相2以正丁醇分别萃取5次，合并得正丁醇萃取液；

（10）正丁醇萃取液减压蒸馏回收正丁醇，得正丁醇萃取物浸膏350g；

(11) 正丁醇萃取物浸膏经水分散后，经大孔树脂柱色谱分离，大孔树脂为HPD-100，依次用水、20%甲醇、40%甲醇、60%甲醇、80%甲醇、100%甲醇洗脱，取60%甲醇洗脱液；

(12)60%甲醇洗脱液经硅胶柱色谱经体积比氯仿:甲醇=30:1-0:1溶剂系统梯度洗脱，经TLC检测并合并相同流分，得4个部分（D₁-D₄)，组分D₂经柱层析经体积比氯仿:甲醇=20:1-0:1溶剂系统梯度洗脱，经硅胶柱色谱，Sephadex LH-20凝胶柱色谱，反复柱层析得到当药黄素洗脱液；

(13) 当药黄素洗脱液回收有机溶剂得当药黄素21mg。

羽扇豆醇。白色粉末（氯仿），mp215℃~217℃。EI-MS m/z:426[M⁺],411，393，218，207，189，175，161，147，135，121，109，95，69，55；¹H-NMR(CDCl₃, 500MHz）δ:0.77（3H，s，H-24），0.80（3H，s，H-28），0.85（3H，s，H-26），1.69（3H，s，H-30），4.57（1H，br s，H-29），4.69（1H，br s，29-H），3.19（1H，dd，J=10，H-3)；¹³C-NMR（500Hz，CDCl₃)δ: 38.3(C-1)，27.7(C-2)，79.2 (C-3)，38.9(C-4)，55.5(C-5)，18.2(C-6)，34.2(C-7)，41.0(C-8)，50.7(C-9)，35.8(C-10)，19.2(C-11)，25.4 (C-12)，37.4(C-13)，43.0(C-14)，28.2(C-15)，34.9 (C-16)，43.2(C-17)，48.5(C-18)，48.2(C-19)，151.2 (C-20)，29.9(C-21)，39.1(C-22)，27.6(C-23)，21.2 (C-24)，16.2(C-25)，15.6(C-26)，14.8(C-27)，16.3(C-28)，109.5(C-29)，18.5(C-30)。根据光谱及相关信息鉴定该化合物为羽扇豆醇，其光谱数据与文献（罗永明等. 中药草珊瑚的化学成分研究[J]. 中国药学杂志, 2005, 40(17):1296-1298)一致。

当药黄素: 黄色粉末，mp 239~242℃。UVλ_max270, 337; EI-MS m/z: 445(M-H)⁺, ESI-MS: 447(M+H)⁺。¹H-NMR(CD₃OD，500MHz) δ: 13. 511( 1H, s, 5-OH), 10. 400( 1H, br, 4’-OH), 6. 843( 1H, s, 8-H), 6. 833( 1H, s, 3H), 6. 956( 2H, d, 11.0Hz, 3′5′-H), 7. 996( 2H, d, 11. 0Hz, 2’6’-H), 3. 874( 3H, s, OCH3)。glu: 4. 579( 1H, d, 12.0Hz, H-1’’), 4. 006( 1H, t , 12. 0Hz, H-2’’), 3. 116( 1H, t =7. 5Hz, H-3’’), 4. 200( 1H, t, 11. 5Hz, H-4’’), 3. 209( 1H, t, 10. 0Hz, H-5’’), 3. 401( 1H, m, H1-6’’), 3. 696( 1H, d,14.0Hz, H2-6′′)。¹³C-NMR(500Hz，CD₃OD)δ: 163. 939( C-2), 103.085( C-3), 182. 001( C-4), 159. 620( C-5),109. 663( C-6), 156. 774( C-7), 90. 236( C-8), 156. 881( C-9), 104. 146( C-10), 120.994(C-1′), 128. 610( C-2′), 116. 042(C-3′), 161. 390(C-4’), 116. 040( C-5’),128. 619( C-6’); glu: 72.632( C-1’’), 70. 305( C-2’’), 79.131( C-3’’), 69. 664( C-4’’), 81. 766( C-5’’),61. 804( C-6’’); 56. 310( OCH3)。以上数据与文献（陈艳等. 兔尾草化学成分的研究[J]. 中成药, 2009, 2(13): 266-269.）报道的当药黄素一致。

实施例2

本实施例为提取物及其化合物羽扇豆醇、当药黄素的抗凝血作用实验。

方法：

1. 样品溶液制备

使用1.5mL道夫管称取浸膏3mg，单体称取1mg，加入溶剂为乙醇:丙二醇:生理盐水=1:1:3溶液1mL，混悬，震荡超声至溶解或分散均匀，备用。

2. 实验过程

取家兔耳缘静脉取血3.6 mL，加至含38 g/L枸橼酸钠400 μL的4 mL离心管中，混匀，1 000 r/min离心15 min，取上清液备用。取1.5 mL道夫管，样品组加入血浆0.1 mL及样品溶液各0.1 mL，阳性对照组加入血浆0.1 mL及药品溶液0.1 mL，空白组加入血浆0.1 mL及空白溶剂0.1 mL于37 ℃温育1 min后分别向每管加入2.775 g/L CaCl₂溶液0.1 mL，计时，直到检测到纤维蛋白丝时停止计时，维生素K1、灯盏花素对照组重复3次，样品组重复6次，求算术平均值和标准差，即为血浆复钙时间。结果采用算术平均值和标准差表示,数值统计采用SPSS17.0软件单因素方差分析法(One-Way ANOVA)比较其显著性差异。

结果如表所示：

由上表可以看出，波叶山蚂蝗乙酸乙酯萃取物和波叶山蚂蝗总浸膏及提

由上表所示：羽扇豆醇、当药黄素、小槐花EA部位与灯盏花素显著性差异较小（p＞0.01），提示其抗凝血活性显著。

实施例3

小槐花乙酸乙酯萃取物、羽扇豆醇和当药黄素片剂的制备：

制备方法：取上述小槐花提取物100 g或羽扇豆醇和当药黄素5g，加入淀粉250 g、阿拉伯胶15 g 后加入适量 80%的甲醇作润湿剂混匀制成软材，于60 ℃温度下干燥至含水量3%以下，然后将烘干的物粉碎过14目筛，最后加入硬脂酸镁5 g及滑石粉20 g混匀后，过12目筛，整粒，压片，质检、包衣，制成1000片。

最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明，而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims

1. 一种小槐花提取物的提取方法：其特征是指从小槐花中提取乙酸乙酯萃取物浸膏、羽扇豆醇和当药黄素的方法，依次按下列步骤在一定条件下进行提取：

（2）乙醇提取液减压蒸馏回收乙醇后，得乙醇总提物浸膏；

（3）乙醇总提物浸膏溶于水得乙醇总提物浸膏水分散液；

（4）水分散液用石油醚萃取，弃有机相，保留水相1；

（10）正丁醇萃取液蒸馏回收有机溶剂得正丁醇浸膏；

（11）正丁醇浸膏经水分散后，经大孔树脂柱层析，甲醇梯度洗脱得60%甲醇洗脱液；（12）60%甲醇洗脱液经硅胶柱层析，氯仿-甲醇梯度洗脱得当药黄素洗脱液；

（13）当药黄素洗脱液回收有机溶剂得当药黄素。

2.根据权利要求2所述的小槐花提取物的提取方法，其特征是各步骤工艺条件为：

（3）乙醇总提物浸膏用10～12倍量水溶解分散；

（4）水分散液用2～4倍体积的石油醚反复萃取5次，弃有机相，留水相1；

（5）水相1用2～4倍体积的乙酸乙酯反复萃取5次，合并萃取液得乙酸乙酯萃取液和水相2；

（7）乙酸乙酯浸膏经乙酸乙酯分散后用80目硅胶拌样，重量比浸膏:硅胶=1:1.5，上硅胶柱层析，硅胶粒度200-300目，经石油醚-乙酸乙酯体积比100:1～ 0:1溶剂体系梯度洗脱，经TLC检测并合并相同流分，得5个组分，组分编号为B₁ –B₅，组分B₂经硅胶柱色谱，用石油醚:乙酸乙酯=15:1洗脱液洗脱，得羽扇豆醇洗脱液；

（9）水相2以正丁醇分别萃取5次，合并得正丁醇萃取液；

（11）正丁醇萃取物浸膏经水分散后，经大孔树脂柱色谱分离，大孔树脂为HPD-100，依次用水、20%甲醇、40%甲醇、60%甲醇、80%甲醇、100%甲醇洗脱，取60%甲醇洗脱液；（12）60%甲醇洗脱液经硅胶柱色谱经体积比氯仿:甲醇=30:1-0:1溶剂系统梯度洗脱，经TLC检测并合并相同流分，得4个部分（D₁-D₄)，组分D₂经柱层析经体积比氯仿:甲醇=20:1-0:1溶剂系统梯度洗脱，经硅胶柱色谱，Sephadex LH-20凝胶柱色谱，反复柱层析得到当药黄素洗脱液；

（13）当药黄素洗脱液回收有机溶剂得当药黄素。

3.如权利要求1或2所述的小槐花提取物的应用，其特征是指小槐花植物全草的乙酸乙酯萃取物浸膏和从小槐花提取物中分离得到的羽扇豆醇、当药黄素在制备用于抗凝血药物或药剂方面的应用。

4.根据权利要求3所述的小槐花提取物的应用，其特征是指小槐花植物全草的乙酸乙酯萃取物浸膏和从小槐花提取物中分离得到的羽扇豆醇、当药黄素在制备用于抗凝血药物的药剂有：栓剂、片剂、丸剂、颗粒剂、膜剂、微囊剂、滴丸剂、气雾剂、酒剂、糖浆剂、口服液和注射剂。