CN112645996B - 一种促凝血桃花有效成分及其提取分离方法和应用 - Google Patents

一种促凝血桃花有效成分及其提取分离方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种促凝血桃花有效成分的提取分离方法，包括以下步骤：将桃花用石油醚浸提，过滤，回收滤渣，然后用乙醇室温浸提，过滤、浓缩，得乙醇总浸膏；将乙醇总浸膏分散于少量水中形成分散液，依次用溶剂石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，回收溶剂，得到石油醚部位、乙酸乙酯部位及正丁醇部位；将正丁醇部位采用200~300目硅胶柱色谱分离，以二氯甲烷‑甲醇进行梯度洗脱，得到8个组分，按照所得组分极性由小到大依次标记为组分1~8。将组分4和组分7反复经硅胶H柱色谱分离，然后经Sephadex LH‑20凝胶柱色谱纯化。本发明采用特殊的方法从桃花中正丁醇部位分离得到了桃花有效成分，并对其体外促凝血效果考察，结果表明，具有良好的促凝血效果。

Description

一种促凝血桃花有效成分及其提取分离方法和应用
技术领域
本发明属于植物提取技术领域，具体涉及一种促凝血桃花有效成分及其提取分离方法和应用。
背景技术
桃花为蔷薇科（Rosaceae）桃属（Amygdalus）植物桃（Amygdalus persica L.）或山桃（Amygdalus davidiana）的花，味苦，性平，归心、肝、大肠经，有利水通便、活血化瘀之功效。目前，对桃花的化学研究多侧重于多酚的提取纯化工艺和脂溶性成分分析，研究结果表明，桃花（Amygdalus persica）挥发油中鉴定出苯甲醛、α-金合欢烯、十六烷酸等88种挥发性成分，且发现桃花挥发油对伤寒沙门氏菌等8种致病菌具有较强的抑制作用。然而，桃（Amygdalus persica L.）花的化学成分和药理作用仍然不确定，没有明确的理论证据。
血液凝固简称凝血，是在内源性或（和）外源性凝血途径下产生凝血酶原激活物，凝血酶原激活物在凝血因子的作用下产生凝血酶，最后凝血酶使纤维蛋白原转变为纤维蛋白，血液由溶胶状态转变为凝胶状态。凝血过程通常分为：①内源性凝血途径；②外源性凝血途径；③共同凝血途径。外源性凝血途径是从组织因子暴露于血液而启动，到因子X被激活的过程；临床上以凝血酶原时间(PT)测定来反映外源性凝血途径的状况。内源性凝血途径是指从因子XII激活，到因子X激活的过程；临床上以活化部分凝血活酶时间（APTT）来反映体内内源性凝血途径的状况。从因子X被激活至纤维蛋白形成，是内、外源共同凝血途径；主要包括凝血酶生成和纤维蛋白形成两个阶段。
机体凝血系统包括凝血和抗凝两个方面，两者间的动态平衡是正常机体维持体内血液流动状态和防止血液丢失的关键。促凝血药主要通过增强体内凝血因素或抑制抗凝血因素，促使凝血，以达到凝血目的，用于治疗各种出血疾病以及创伤性出血等。
发明内容
基于现有技术的不足，本发明目的在于提供一种促凝血桃花有效成分，并提供该促凝血桃花有效成分的提取分离方法和应用。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种促凝血桃花有效成分的提取分离方法，其包括以下步骤：
1）以干燥、粉粹后的桃花为原料，用石油醚浸提脱脂，石油醚浸提结束后过滤，回收滤渣，然后用乙醇室温浸提，乙醇浸提结束后，过滤、浓缩，得乙醇总浸膏；将乙醇总浸膏分散于少量水中形成分散液，依次用溶剂石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，回收溶剂，得到石油醚部位、乙酸乙酯部位及正丁醇部位；
2）将步骤1）所得正丁醇部位采用200~300目硅胶柱色谱分离，用二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，以硅胶薄层色谱检测合并，得到8个组分，按照所得组分极性由小到大依次标记为组分1~8；
3）将步骤2）所得组分4，经硅胶柱色谱分离，以二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，经硅胶薄层色谱检测，合并相同组分并减压回收溶剂，得到3个亚组分，按照所得组分极性由小到大依次标记为Fr.4.1、Fr.4.2、Fr.4.3；Fr.4.3先经硅胶柱色谱分离，然后用SephadexLH-20凝胶柱色谱纯化，薄层色谱检测、合并相同组分并减压浓缩回收溶剂、干燥，得到化合物1；
4）将步骤2）所得组分7，经硅胶柱色谱分离，以二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，经硅胶薄层色谱检测，合并相同组分并减压回收溶剂，得到4个亚组分，按照所得组分极性由小到大依次标记为Fr.7.1、Fr.7.2、Fr.7.3、Fr.7.4；Fr.7.2经Sephadex LH-20凝胶柱色谱纯化，薄层色谱检测、合并相同组分并减压浓缩回收溶剂、干燥，得到化合物2；
化合物1和/或2即为促凝血桃花有效成分。
优选的，步骤1）中，干燥、粉粹后的桃花在室温下用桃花重量10-15倍的石油醚浸提2~4次，每次3~4 d。
优选的，步骤1）中，用体积浓度70~80%的乙醇（乙醇添加量为桃花重量的10-15倍）在室温下浸提滤渣，浸提2~4次，每次3~4 d，乙醇浸提结束后合并乙醇浸提液，过滤、浓缩，得乙醇总浸膏。
优选的，步骤2）中，200~300目硅胶柱色谱分离时，用体积比100:0、100:1、100:2、100:4、100:8、100:16、100:32、0:100的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱。
进一步的，步骤3）中，硅胶柱色谱分离时，用体积比20:1~2:1的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱；Sephadex LH-20凝胶柱色谱纯化时，以甲醇为洗脱液。
进一步的，步骤4）中，硅胶柱色谱分离时，用体积比15:1~1:1的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱；Sephadex LH-20凝胶柱色谱纯化时，以体积比1:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱液。
本发明提供了采用上述方法提取分离得到的促凝血桃花有效成分。
本发明还提供了上述促凝血桃花有效成分在制备促凝血药物方面的应用。
采用上述方法得到的促凝血桃花有效成分，化合物1、2分别为山奈酚-3-O-新橙皮糖苷(1)和三叶豆苷(2)，其结构如下所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
。
和现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1）本发明采用特殊的方法从桃花中正丁醇部位分离得到了2个化合物山奈酚-3-O-新橙皮糖苷(1)和三叶豆苷(2)组成的促凝血桃花有效成分，并对2个化合物的体外促凝血效果的考察，结果表明，2个化合物均具有良好的促凝血效果，它们可以单独或组合用于制备促凝血剂；
2）本发明的方法以常被作为观赏、花落后作为废弃物丢弃、未得到广泛应用的桃（Amygdalus persica L.）花为原料，进行促凝血有效成分的提取，大大拓展了桃花这一药用植物的开发利用价值。本发明的提取方法简单，原料来源丰富，成本低，所提取得到的化合物具有促凝血作用，提取过程中用到的溶剂可回收利用，提取量大，可工业化生产。
附图说明
图1为实施例1提取获得化合物山奈酚-3-O-新橙皮糖苷的1H-NMR谱图；
图2为实施例1提取获得化合物山奈酚-3-O-新橙皮糖苷的13C-NMR谱图；
图3为实施例1提取获得化合物三叶豆苷的1H-NMR谱图；
图4为实施例1提取获得化合物三叶豆苷的13C-NMR谱图。
具体实施方式
为了使本发明的技术目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面结合具体实施例对本发明的技术方案作出进一步的说明，但所述实施例旨在解释本发明，而不能理解为对本发明的限制，实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
下述实施例中，作为原料的桃花购买于安徽药知源中药饮片有限公司，为蔷薇科桃属植物桃（Amygdalus persica L.）的花；所述乙醇、甲醇、二氯甲烷等有机溶剂浓度均为体积浓度或者体积比。
实施例1
一种促凝血桃花有效成分的提取分离方法，包括以下步骤：
1）以干燥、粉粹后的2000 g桃花为原料，室温下，用桃花原料重量12倍量的石油醚室温浸提 (浸提3次，每次3d)，石油醚浸提结束后过滤，回收滤渣。然后用原料重量13倍量的70%乙醇室温浸提 (浸提3次，每次3d)，乙醇浸提结束后合并乙醇浸提液，过滤、浓缩，得510 g乙醇总浸膏；
将乙醇总浸膏分散于50 mL水中形成分散液，依次用石油醚 (约分散液的1倍体积)、乙酸乙酯 (约分散液的1倍体积) 和正丁醇 (约分散液的1倍体积) 萃取，各萃取3次，回收溶剂，分别得到石油醚部位、乙酸乙酯部位及正丁醇部位；
2）将步骤1）所得正丁醇部位用体积比1:1二氯甲烷-甲醇溶解后，用80~100目硅胶拌样，然后按重量比1:30经200~300目硅胶柱色谱分离，以二氯甲烷-甲醇（体积比100:0、100:1、100:2、100:4、100:8、100:16、100:32、0:100）进行梯度洗脱，经硅胶薄层色谱检测合并，得到8个组分，按照所得组分极性由小到大依次标记为组分1~8；
3）将步骤2）所得组分4经硅胶柱色谱分离，以体积比20:1、10:1、8:1、4:1、2:1的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，经硅胶薄层色谱检测，合并相同组分并减压回收溶剂，得到3个亚组分，按照所得组分极性由小到大依次标记为Fr.4.1、Fr.4.2、Fr.4.3；其中Fr.4.3先经硅胶柱色谱分离，以体积比10:1:1的二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇进行洗脱，然后用SephadexLH-20凝胶柱色谱纯化，以甲醇为洗脱液，薄层色谱检测、合并相同组分并减压浓缩回收溶剂、干燥，得到化合物1（8.7mg）；
4）将步骤2）所得组分7经硅胶柱色谱分离，以体积比15:1、10:1、8:1、4:1、2:1、1:1的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，经硅胶薄层色谱检测，合并相同组分并减压回收溶剂，得到4个亚组分，按照所得组分极性由小到大依次标记为Fr.7.1、Fr.7.2、Fr.7.3、Fr.7.4；其中Fr.7.2经Sephadex LH-20凝胶柱色谱纯化，以二氯甲烷-甲醇（体积比1:1）为洗脱液，薄层色谱检测、合并相同组分并减压浓缩回收溶剂、干燥，得到化合物2（9.4 mg）。
经鉴定，化合物1为山奈酚-3-O-新橙皮糖苷，化合物2为三叶豆苷，运用多种谱学技术鉴定结构，具体如下：
化合物1：山奈酚-3-O-新橙皮糖苷（1），黄色粉末(甲醇)，分子式C27H30O15， ESI-MSm/z: 595[M+H]+。1H-NMR(400 MHz，CD3OD) δ: 7.77(2H, d, J=12.00 Hz, H-2', H-6'),6.93(2H, d, J=8.00 Hz, H-3', H-5'), 6.37(1H, s, H-8), 6.19(1H, s, H-6), 5.37(1H, d, J=7.60 Hz, H-1''), 5.07(H, s, 1'''), 3.20-3.95(m, sugar protons),1.00(3H, d, J=8.00 Hz, 6''')。13C-NMR(100 MHz，CD3OD) δ: 178.17(C-4), 164.47(C-7), 161.81(C-5), 160.15(C-4′), 157.88(C-9), 157.15(C-2), 134.70(C-3), 130.50(C-2′), 130.50(C-6′), 121.22(C-1′), 115.14(C-3′), 115.14(C-5′), 104.54(C-10),104.27(C-6), 101.80(C-1′′′), 98.47(C-1′′), 93.38(C-8), 81.70(C-2′′), 76.83(C-3′′), 76.56(C-5′′), 74.61(C-4′′′), 70.72(C-3′′′), 70.41(C-2′′′), 69.97(C-4′′), 69.18(C-5′′′), 61.23(C-6′′), 16.47(C-6′′′)，详见图1和2。
化合物2：三叶豆苷（2），黄色粉末(甲醇), 分子式为C21H20O11, ESI-MS m/z: 449[M+H]+. 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 12.62(1H, s, -OH), 10.89(1H, s, -OH),10.18(1H, s, -OH), 8.08(2H, d, J=8.00Hz, H-2', 6'), 6.87(2H, d, J=8.00Hz, H-3', 5'), 6.44(1H, s, H-8), 6.21(1H, s, H-6), 5.41(1H, d, J=4.00Hz, H-1'')。13C-NMR (100 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 159.93(C-2), 133.23(C-3), 177.52(C-4), 162.98(C-5),98.67(C-6), 164.11(C-7), 93.61(C-8), 156.33(C-9), 103.91(C-10), 120.81(C-1'),130.95(C-2'), 115.03(C-3'), 161.19(C-4'), 115.03(C-5'), 130.95(C-6'), 101.66(C-1''), 71.18(C-2''), 73.08(C-3''), 67.86(C-4''), 75.76(C-5''), 60.17(C-6'')，详见图,3和4。
促凝血应用试验
下面对促凝血桃花有效成分（即化合物1和2）进行促凝血作用试验。
试验方法：大鼠体外血浆凝血四项检测。
仪器和试剂：
TGL-16gR高速台式冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）；
RAC-030全自动凝血分析仪（济南汉方医疗器械有限公司）；
氯化钠注射液（辰欣药业股份有限公司，1603311336）；
云南白药（云南白药集团股份有限公司，ZJA1708）；
注射用灯盏花素（昆明龙津药业股份有限公司，20190813-1）；
凝血酶原时间（PT）测定试剂盒（20191209M）；活化部分凝血酶时间（APTT）测定试剂盒（20200319M）；凝血酶时间（TT）测定试剂盒（20190821M）；纤维蛋白原（FIB）含量测定试剂盒（20191120M）均由深圳雷杜生命科学股份有限公司生产。
实验动物：SD大鼠，SPF级，雄性，体重180~200 g，由河南省实验动物中心提供（SCXK（豫）2017-0001）。
样品溶液配制：
取3 mg化合物1或2样品用1000 μL溶剂溶解制成浓度3 mg/mL的溶液；
取灯盏花素8 mg用600 μL溶剂制成浓度13.33 mg/mL的溶液；
取云南白药1 mg用25 μL溶剂制成浓度40 mg/mL的溶液；
溶剂（也作为空白溶剂）为：无水乙醇: 1,2-丙二醇: 氯化钠注射液=1: 1: 3（体积比）。
血浆的制备：大鼠，采用水合氯醛麻醉，腹主动脉脉取血，置于一次性抗凝负压真空管，轻轻颠倒混匀，3000 rpm离心15 min，取上层清液备用。
具体试验方法：
（1）对APTT影响的检测方法
分别在不同测试杯中加入25 μL各个样品溶液，再加入50 μL血浆，放入凝血仪器中，自动加入25 μL APTT试剂，37 ℃孵育后加入37 ℃预温的50 μL CaCl2溶液，记录凝固时间，即为APTT值。
（2）对PT影响的检测方法
分别在不同测试杯中加入25 μL各个样品溶液，再加入50 μL血浆，放入凝血仪器中，自动加入100 μL PT试剂，记录凝固时间，即为PT值。
（3）对TT影响的检测方法
分别在不同测试杯中加入25 μL各个样品溶液，再加入100 μL血浆，放入凝血仪器中，自动加入100 μL TT试剂，记录凝固时间，即为TT值。
（4）对FIB影响的检测方法
分别在不同测试杯中加入25 μL各个样品溶液，再加入50 μL血浆，放入凝血仪器中，自动加入100 μL FIB试剂，记录纤维蛋白原的含量。
试验结果：
结果采用算术平均值和标准差表示，数值统计采用SPSS19.0软件单因素方差分析法（One-Way ANOVA）比较其显著性差异，测定结果见表1。
表1 化合物对大鼠凝血时间及纤维蛋白原含量的影响(x±s)
Figure 169186DEST_PATH_IMAGE002
注：与空白比较： ### p<0.001< ## p<0.01< # p<0.05；
与云南白药比较：△△△ p<0.001< △△ p <0.01< △ p <0.05；
与灯盏花素比较： *** p<0.001< ** p<0.01< * p<0.05。
由表1可以看出，与空白组相比，本发明所述促凝血桃花有效成分化合物1~2可以显著的缩短APTT（p<0.01或p<0.001），但效果弱于云南白药（p<0.001）；化合物1~2可以显著的缩短PT（p<0.001），且效果优于云南白药；化合物1可缩短TT（p<0.05），但其作用弱于云南白药（p<0.05）；化合物2能显著的缩短TT（p<0.001），且效果优于云南白药（p<0.01）；化合物2可显著的降低FIB含量（p<0.001），作用弱于灯盏花素（p<0.01）。提示本发明所述促凝血桃花有效成分化合物1~2均具有一定的促凝血作用。

Claims (3)

1.一种促凝血桃花有效成分的提取分离方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）以干燥、粉粹后的桃花为原料，用石油醚浸提，石油醚浸提结束后过滤，回收滤渣，然后用乙醇室温浸提，乙醇浸提结束后，过滤、浓缩，得乙醇总浸膏；将乙醇总浸膏分散于少量水中形成分散液，依次用溶剂石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，回收溶剂，得到石油醚部位、乙酸乙酯部位及正丁醇部位；
2）将步骤1）所得正丁醇部位采用硅胶柱色谱分离，用二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，以硅胶薄层色谱检测合并，得到8个组分，按照所得组分极性由小到大依次标记为组分1~8；
3）将步骤2）所得组分4，经硅胶柱色谱分离，以二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，经硅胶薄层色谱检测，合并相同组分并减压回收溶剂，得到3个亚组分，按照所得组分极性由小到大依次标记为Fr.4.1、Fr.4.2、Fr.4.3；Fr.4.3先经硅胶柱色谱分离，然后用Sephadex LH-20凝胶柱色谱纯化，薄层色谱检测、合并相同组分并减压浓缩回收溶剂、干燥，得到化合物1；
4）将步骤2）所得组分7，经硅胶柱色谱分离，以二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，经硅胶薄层色谱检测，合并相同组分并减压回收溶剂，得到4个亚组分，按照所得组分极性由小到大依次标记为Fr.7.1、Fr.7.2、Fr.7.3、Fr.7.4；Fr.7.2经Sephadex LH-20凝胶柱色谱纯化，薄层色谱检测、合并相同组分并减压浓缩回收溶剂、干燥，得到化合物2；
化合物1和/或2即为促凝血桃花有效成分；
化合物1、2的结构如下所示：
Figure QLYQS_1
；
步骤2）中，硅胶柱色谱分离时，用体积比100:0、100:1、100:2、100:4、100:8、100:16、100:32、0:100的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱；
步骤3）中，硅胶柱色谱分离时，用体积比20:1~2:1的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱；Sephadex LH-20凝胶柱色谱纯化时，以甲醇为洗脱液；
步骤4）中，硅胶柱色谱分离时，用体积比15:1~1:1的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱；Sephadex LH-20凝胶柱色谱纯化时，以体积比1:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱液。
2.根据权利要求1所述促凝血桃花有效成分的提取分离方法，其特征在于，步骤1）中，干燥、粉粹后的桃花在室温下用石油醚浸提2~4次，每次3~4 d。
3.根据权利要求1所述促凝血桃花有效成分的提取分离方法，其特征在于，步骤1）中，用体积浓度70~80%的乙醇在室温下浸提滤渣，浸提2~4次，每次3~4 d，乙醇浸提结束后合并乙醇浸提液，过滤、浓缩，得乙醇总浸膏。
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