CN116332765B

CN116332765B - 一种烷酸酯化合物及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN116332765B
Application number: CN202310530092.3A
Authority: CN
Inventors: 肖小武; 杨甲玺; 周志强; 林凯鹏; 王杰; 吴旻昱; 付辉政
Original assignee: Jiangxi Institute For Drug Control
Current assignee: Jiangxi Institute For Drug Control
Priority date: 2023-05-12
Filing date: 2023-05-12
Publication date: 2023-08-04
Anticipated expiration: 2043-05-12
Also published as: CN116332765A

Abstract

本发明涉及中药提取分离、植物化学及医药技术领域，具体涉及一种烷酸酯化合物及其制备方法与应用。本发明提供了从水半夏中提取的一种新化合物：以干燥的水半夏为原料，通过加水煎煮、减压浓缩、萃取、反相C₁₈色谱分离等步骤得到一种新的烷酸酯化合物。本发明提取分离工艺操作简单、易于控制，适合工业化生产；所得烷酸酯化合物具有抗增殖活性、抗肿瘤的作用，在制备治疗非小细胞肺癌的药物中具有良好的应用前景。

Description

一种烷酸酯化合物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及中药提取分离、植物化学及医药技术领域，具体涉及从天南星科植物鞭檐犁头尖(Typhonium flagelliforme(Lodd.) Blume)的干燥块茎中提取、分离和鉴别的一种烷酸酯化合物及其制备方法与应用。

背景技术

传统中药材水半夏是天南星科植物鞭檐犁头尖的干燥块茎；秋冬采挖块茎，除去外皮及须根，洗净、晒干即得；其性味气微，味辛辣，刺喉，嗅之刺鼻。水半夏功能主治为：燥湿，化痰，止咳；用于咳嗽痰多、支气管炎；外用鲜品治痈疮疖肿、无名肿毒、毒虫咬伤。

现代药理学研究表明，水半夏除止咳化痰、抗炎、镇吐、抗氧化等常规功效外，还具备一定的抗增殖活性，能够用于治疗癌症。随着对水半夏活性成分药用价值的持续深入研究，其抗肿瘤活性成分逐渐被发现：有研究表明水半夏提取物中由单宁、类黄酮和类固醇组成的某种化合物具有很高的抗肿瘤活性；还有研究鉴定出水半夏馏分中几类脱镁叶绿素相关化合物显示出对癌细胞的高抗增殖活性。水半夏中新抗肿瘤活性成分的发现，无疑能够推动水半夏在抗癌临床中的应用。

有鉴于此，对水半夏中新的抗癌化合物的开发具有重大意义。

发明内容

基于背景技术所述，本发明提供了从水半夏中提取的一种新化合物，经研究发现该化合物具有抗肿瘤活性，同时本发明还提供一种针对该化合物的简便、快速的提取分离方法。本发明目的之一在于提供一种从水半夏中提取分离的新烷酸酯化合物，该新烷酸酯化合物具有新型结构与药理活性，为水半夏药理作用研究提供了物质基础。本发明目的之二在于提供从水半夏中提取分离该烷酸酯化合物的方法，以干燥的水半夏为原料，通过加水煎煮、减压浓缩、萃取、反相C₁₈色谱分离等步骤即得，整个提取分离工艺操作简单、易于控制，适合工业化生产。本发明目的之三在于提供该烷酸酯化合物抗增殖活性、抗肿瘤的作用，为发掘潜在的抗肿瘤新药提供有力依据。

为实现上述目的，本发明具体采用如下技术方案：

本发明提供了一种从水半夏中提取分离的烷酸酯化合物，所述化合物的分子式为：C₂₂H₃₆O₄，根据其结构命名为2,3-二羟丙基-13-苯基十三烷酸酯，其化学结构式如下：

；所述烷酸酯化合物用于制备抗肺癌药物。

本发明还提供了上述烷酸酯化合物的提取分离方法，包括如下步骤：

步骤1）、以干燥的水半夏为原料，粉碎后加水煎煮，再通过减压浓缩得到浓缩液；

步骤2）、取步骤1）所得浓缩液加水混悬，然后采用二氯甲烷进行萃取，所得萃取液减压浓缩至恒重；

步骤3）、取步骤2）萃取、浓缩所得物，经反相C₁₈色谱柱层析分离，用甲醇-水梯度洗脱，HPLC检视合并得到12个馏分；

步骤4）、取步骤3）所得其中一个馏分经HPLC检视，以乙腈-0.05%三氟乙酸水为流动相，采用反相高效制备液相色谱分离，得到烷酸酯化合物。

作为上述方案的进一步优选，步骤1）中加水煎煮水的用量为水半夏质量的5倍；煎煮进行2-3次，每次煎煮时长为2-4 h。

作为上述方案的进一步优选，步骤1）中减压浓缩于60-70℃条件下进行。

作为上述方案的进一步优选，步骤2）萃取液减压浓缩于38-42℃条件下进行。

作为上述方案的进一步优选，步骤3）中梯度洗脱所用甲醇和水的体积比为10：90、30：70、50：50、70：30、80：20、95：5，6个梯度体积比洗脱时间依次对应为8 h、8 h、7 h、5 h、5h、4 h。

作为上述方案的进一步优选，步骤4）流动相乙腈-0.05%三氟乙酸水体积比为61：39，体积流量为10 mL/min。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明从干燥的水半夏中药材中提取分离得到了结构新颖的烷酸酯化合物，本发明还根据氢谱碳谱等相关数据确定了其分子构型，根据其结构命名为2,3-二羟丙基-13-苯基十三烷酸酯。

2、本发明以干燥的水半夏为原料，通过加水煎煮、减压浓缩、萃取、反相C₁₈色谱分离等步骤得到该烷酸酯化合物，整个提取分离工艺操作简单、易于控制，适合工业化生产。

3、体外生物活性实验表明，本发明烷酸酯化合物对非小细胞肺癌细胞具有一定的抗增殖活性，在制备治疗非小细胞肺癌的药物中具有良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明烷酸酯化合物结构图。

图2为本发明烷酸酯化合物UV光谱图。

图3为本发明烷酸酯化合物MS图。

图4为本发明烷酸酯化合物¹H-NMR谱图。

图5为本发明烷酸酯化合物¹³C-NMR谱图。

图6为本发明烷酸酯化合物COSY谱图。

图7为本发明烷酸酯化合物HMBC谱图。

图8为本发明烷酸酯化合物HSQC谱图。

图9为本发明烷酸酯化合物NOESY谱图。

具体实施方式

下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本申请及其应用或使用的任何限制。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

实施例1烷酸酯化合物的制备

1、取干燥的水半夏10 kg，粉碎成65目左右的粗粉，加入其5倍重量的去离子水煎煮三次（第一次煎煮4 h，后两次每次2 h），随后65℃下减压浓缩得到4 L浓缩液；将所得浓缩液加适量水混悬，依次采用3 L二氯甲烷、3 L乙酸乙酯、3 L正丁醇进行萃取，最终将萃取液分别减压浓缩至恒重（二氯甲烷萃取液40℃下减压浓缩、乙酸乙酯萃取液40℃下减压浓缩、正丁醇萃取液60℃下减压浓缩），得到二氯甲烷萃取浓缩物38.0 g、乙酸乙酯萃取浓缩物16.3 g、正丁醇萃取浓缩物168.0 g。

2、取所得二氯甲烷萃取浓缩物，经反相C₁₈色谱柱层析分离，用甲醇-水（体积比10：90、30：70、50：50、70：30、80：20、95：5）梯度洗脱（6个梯度体积比洗脱时间依次对应为8 h、8h、7 h、5 h、5 h、4 h），收集洗脱液，每500 mL收集一份共得58份洗脱液，依次编号1-58，把收集的58份洗脱液依次按编号顺序从小到大经HPLC检视，检视相同组分的合并成一份馏分，依次给所得馏分编号，得到12个馏分记为Fr.B1-B12；其中Fr.B8馏分为收集的编号42-46的洗脱液合并得到。

3、取馏分Fr.B8经HPLC检视，以乙腈-0.05%三氟乙酸水（体积比61：39）为流动相，采用反相高效制备液相色谱分离（体积流量10.0 mL/min），得到一种新的烷酸酯化合物（纯度为98.5%）。

实施例2烷酸酯化合物结构解析与鉴定

取本发明实施例1所制烷酸酯化合物，其为白色固体，溶于甲醇、水；UV (CH₃OH)λ_max: 196 nm。UPLC-Q-TOF-MS m/z: 387.2502 [M+Na]⁺(calcd for C₂₂H₃₆O₄Na,387.2566)，结合氢谱碳谱确定其分子式为C₂₂H₃₆O₄。

¹H-NMR谱显示一组苯环氢信号δ_H: 7.26 (2H, t,J= 7.5 Hz, H-3'', 5'')；7.16(3H, dd,J= 13.3, 7.2 Hz, H-2'', 4'', 6'')；五组亚甲基氢信号δ_H: 2.52-2.58 (2H,m, H-13)，2.28 (2H, t,J= 7.4 Hz, H-2)，1.52-1.58 (2H, m, H-12)，1.47-1.52 (2H,m, H-3)，1.21-1.28 (16H, m, H-4~11)；三组连氧亚甲基氢信号δ_H: 4.04 (1H, dd,J=11.1, 4.2 Hz, H-1'α)，3.90 (1H, dd,J= 11.1, 6.5 Hz, H-1'β)，3.33 (2H, m, H-3')；一组连氧次甲基氢信号δ_H: 3.63 (1H, m, H-2')。

¹³C-NMR谱有22个碳信号，包括一组苯环碳信号δ_C: 141.7 (C-1'')，127.7 (C-2'')；127.7 (C-4'')，127.7 (C-6'')，125.0 (C-3'')，125.0 (C-5'')；五组亚甲基碳信号δ_C: 32.9 (C-2)，23.9 (C-3)，27.9-28.5 (C-4~11)，30.4 (C-12)，34.6 (C-13)；两个连氧亚甲基碳信号δ_C: 64.9 (C-1')，62.1 (C-3')；一个连氧次甲基碳信号δ_C: 68.8 (C-2')；一个酯基碳信号δ_C: 172.4 (C-1)。在HMBC谱中，苯环侧链的亚甲基氢信号δ_H: H-2 (2.28)和酯基碳δ_C: C-1 (172.4)相关，表明侧链末端与酯基相连；连氧亚甲基氢信号δ_H: H-1'(4.04,3.90)和酯基碳信号δ_C: C-1 (172.4)相关，表明该连氧亚甲基氢信号连在酯基碳信号δ_C: C-1 (172.4)有氧一侧；其次，连氧次甲基氢信号δ_H: H-2' (3.63)与连氧亚甲基碳信号δ_C: C-1' (64.9)和C-3' (62.1)相关，连氧亚甲基氢信号δ_H: H-3' (3.33)与连氧次甲基碳信号δ_C: C-2' (68.8)相关，也进一步说明了末端的二羟丙基连接方式。综上所述，化合物平面结构鉴定为2,3-二羟丙基-13-苯基十三烷酸酯。

该烷酸酯化合物结构如图1所示；UV光谱图如图2所示；MS图如图3；¹H-NMR谱、¹³C-NMR谱、COSY谱、HMBC谱、HSQC谱、NOESY谱分别见图4-图9，由图4-图9确证了本申请的化合物结构。

该烷酸酯化合物的波谱数据归纳如下。

表1 烷酸酯化合物的¹³C-NMR、¹H-NMR谱数据

实施例3化合物体外抗肿瘤活性测定

1 实验仪器

Thermo热电FC酶标仪、细胞计数仪、BLD-200倒置显微镜、JJ1023BF电子天平、YCD-265冰箱、低速离心机、37℃二氧化碳恒温培养箱。

2 材料试剂

人非小细胞肺癌（A549）细胞株，RPMI1640培养基、96孔板、一次性无菌0.22 μm滤头、PBS缓冲液、CCK-8试剂、二甲基亚砜。

3 实验步骤

3.1 细胞的复苏

打开净化工作台，紫外线照射消毒30 min。小心打开液氮罐，找出A549细胞冻存管，取烧杯加入37℃常温水，冻存管在烧杯中左右摇动，使其快速解冻，后擦干表面转入离心机，仪器参数1000 rpm，离心4 min后取出，移至净化工作台中，先用医用酒精对冻存管外表面进行消毒，打开，弃去上层冻存液，重新加入1 mL培养基，用移液枪轻柔缓慢吹散细胞，转至25 cm²培养瓶中，再吸取4 mL培养基加入培养瓶中。倒置显微镜下观察，发现细胞外观形态正常，转入5%二氧化碳、37℃恒温培养箱。24 h后，观察细胞，吸除培养基，更换新鲜培养基，在此操作环节，培养瓶瓶口、瓶盖在开合时均需在酒精灯外焰过火消毒。

3.2 细胞的传代

显微镜下观察细胞，发现其已基本覆盖培养瓶底面，可以传代。操作前将净化工作台及实验所用耗材紫外线照射30分钟消毒。打开培养瓶，用移液枪吸除培养液。吸取3 mL缓冲液清洗底部细胞2遍，吸除，加入l mL 0.25%胰蛋白酶，瓶身水平方向轻微摇动。再次观察细胞，呈现胞质回缩趋势，立即停止消化，加入2 mL RPMI1640培养基，小心缓慢吹下贴壁生长细胞，细胞液转入离心机，参数1000 rpm离心4 min，吸除上层培养基，再加入1.5 mL培养基，缓慢轻柔吹散细胞，将细胞液分装入3个培养瓶，向培养瓶中再次加入5 mL培养基，显微镜下观察培养瓶内细胞，无异常情况，瓶身外表面用医用酒精消毒处理，转移至5%二氧化碳、37℃恒温培养箱。

3.3 细胞的冻存

显微镜下观察，选择处于对数生长期的细胞，吸除上层培养液，加入l mL，0.25%胰酶，观察细胞呈现胞质回缩趋势，终止消化。加入1.5 mL培养基，轻柔吹下贴壁细胞，转入离心机，参数设置1000 rpm离心3 min，吸除培养基，加适量冻存液，分装转入无菌冻存管，每支约1.5 mL。处理好的冻存管先暂存于4℃冰箱40 min，再转入-20℃冰箱暂存2.5 h，再转入-80℃冰箱暂存12 h，最终转移至液氮罐。

3.4 细胞活性检测

显微镜下观察人肺癌细胞A549基本覆盖培养瓶底部80%以上，且状态良好。吸出培养基，用PBS缓冲液清洗2遍，胰酶消化1 min，再加入适量培养基稀释细胞，进行计数，使细胞密度约为4×10³个/mL。加100 μL缓冲液于96孔板外围后，其余每孔加入100 μL细胞悬液，转入培养箱中培养。空白组加入100 μL培养基，实验组加入100 μL含有不同浓度本申请化合物2,3-二羟丙基-13-苯基十三烷酸酯的培养基，设3个复孔，培养48 h，每孔加入10 μLCCK-8指示剂，培养4 h，再转入酶标仪检测，设置波长450 nm，根据测量吸光度OD值处理数据。

3.5 实验结果

用Graphpad prism软件对化合物实验数据进行处理，拟合实验浓度与抑制率的依赖关系趋势变化，得到化合物所对应的IC₅₀（μM）为25.63±1.99。

表2 烷酸酯化合物对人非小细胞肺癌（A549）细胞的抑制作用

结果表明该化合物呈现出一定的抗肿瘤活性，以期为发掘潜在的抗肿瘤先导化合物提供参考。

最后需要强调的是，以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种变化和更改，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种从水半夏中提取分离的烷酸酯化合物，其特征在于，所述化合物的分子式为：C₂₂H₃₆O₄，根据其结构命名为2,3-二羟丙基-13-苯基十三烷酸酯，其化学结构式如下：

；

所述烷酸酯化合物用于制备抗肺癌药物。

2.一种如权利要求1所述烷酸酯化合物的提取分离方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1、以干燥的水半夏为原料，粉碎后加水煎煮，再通过减压浓缩得到浓缩液；

步骤2、取步骤1所得浓缩液加水混悬，然后采用二氯甲烷进行萃取，所得萃取液减压浓缩至恒重；

步骤3、取步骤2萃取、浓缩所得物，经反相C₁₈色谱柱层析分离，用甲醇-水梯度洗脱，HPLC检视合并得到12个馏分；

步骤4、取步骤3所得其中一个馏分经HPLC检视，以乙腈-0.05%三氟乙酸水为流动相，采用反相高效制备液相色谱分离，得到烷酸酯化合物。

3.根据权利要求2所述烷酸酯化合物的提取分离方法，其特征在于，步骤1中加水煎煮水的用量为水半夏质量的5倍；煎煮进行2-3次，每次煎煮时长为2-4 h。

4.根据权利要求2所述烷酸酯化合物的提取分离方法，其特征在于，步骤1中减压浓缩于60-70℃条件下进行。

5.根据权利要求2所述烷酸酯化合物的提取分离方法，其特征在于，步骤2萃取液减压浓缩于38-42℃条件下进行。

6.根据权利要求2所述烷酸酯化合物的提取分离方法，其特征在于，步骤3中梯度洗脱所用甲醇和水的体积比为10：90、30：70、50：50、70：30、80：20、95：5，6个梯度体积比洗脱时间依次对应为8 h、8 h、7 h、5 h、5 h、4 h。

7.根据权利要求2所述烷酸酯化合物的提取分离方法，其特征在于，步骤4流动相乙腈-0.05%三氟乙酸水体积比为61：39，体积流量为10 mL/min。