CN101333238B - 从中药王不留行中分离获得的三萜类化合物及它们的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了从中药王不留行中分离获得的六个三萜皂苷类化合物：王不留行次皂甙I(vaccaroside I)(1)、王不留行次皂甙E(vaccaroside E)(2)、王不留行次皂甙G(vaccaroside G)(3)、王不留行次皂甙B(vaccarosideB)(4)、segetoside H(5)和segetoside I(6)。经体外抗肿瘤试验表明，该类化合物对LNcap、P-388和A-549细胞株具有明显的抑制作用，为研制新的抗肿瘤药物提供了思路，对深度开发中药资源具有重要价值。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，更具体地说涉及从中药王不留行中分离获得的三萜类化合物及它们的医药用途。
背景技术
王不留行为石竹科植物麦蓝菜(Vaccaria segetalis(Neck.)Garcke)的干燥成熟种子。具有活血通经，下乳消肿的作用。用于乳汁不下，经闭，痛经，乳痈肿痛的治疗。该植物广泛存在于亚洲、欧洲及世界其它地方。富含有大量三萜皂苷类和具有雌激素活性的环肽化合物。到目前为止，三萜类化合物已有在黄体细胞(Luteal cell)抑制(Segetoside F，a newtriterpenoid saponin with inhibition of luteal cell from the seeds of Vaccariasegetalis，Tetrahedron letters，2000，41(48)：9205-9207.)和促子宫收缩能力(Vaccaroid A，a new triterpenoid saponin with contractility of rat uterinefrom Vaccaria segetalis，Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters，1997，7(8)：1095-1096.)方面的报道。此外，国际上已有了王不留行药材在体外抗肿瘤方面的研究(In vitro anticancer activity of twelve Chinese medicinalherbs，Phytotheraphy research，2005，19(7)：649-651.)，但针对其中的三萜皂苷类，还没有这方面的报道。
王不留行中皂苷类成分的已有提取分离方法主要是有机溶剂提取、Diaion HP-20、硅胶层析和RP-18高效液相色谱技术(Triterpenoid saponinsand sapogenins from Vaccaria segetalis，Phytochemistry，1998，48，529-536.Triterpenoid saponins from Vaccaria segetalis，Phytochemistry，1998，47，1343-1349.Three new triterpenoid saponins from the seeds of Vaccaria segetalis，2000，J.Asian Nat.Prod.Res.，2，187-193.)。而本发明则没有采用DiaionHP-20技术，只用了有机溶剂提取、硅胶层析和RP-18高效液相色谱技术，使分离的方法进一步简单化。
发明内容
本发明目的是提供一类从中药王不留行中分离获得的三萜皂苷类化合物，寻找具有医药用途的化合物。
本发明的另一目的为提供该类化合物在制备治疗肿瘤的药物中的用途。
本发明的化合物结构如下：
2：R1＝α-OH，R2＝H；
3：R1＝α-H，R2＝H；
5：R1＝β-H，R2＝Ac；
6：R1＝β-OH，R2＝Ac；
上述化合物是通过如下的过程获得的：
1.化合物提取分离
从中药王不留行中提取分离出六个三萜皂苷类化合物，它的提取分离步骤如下：
(1)提取：经炮制后的王不留行样品，用50～90％的4～15倍量工业乙醇回流提取三次，每次1～5小时，合并提取液，减压蒸馏回收乙醇得总浸膏。
(2)分离：王不留行总浸膏经硅胶柱层析，分别以含4个碳以下的有机溶剂洗脱，收集洗脱液。经减压浓缩及D101大孔树脂脱糖后，采用半制备型的高效液相色谱(Inertsil ODS-3柱，10×250毫米，20～70％乙腈或甲醇-水(含0.06～5.50％三氟乙酸)为流动相，流速为0.8～6.0毫升/分钟，紫外检测器，210纳米)分离，从中得到了六个三萜皂苷类化合物：王不留行次皂甙I(vaccaroside I)(1)、王不留行次皂甙E(vaccaroside E)(2)、王不留行次皂甙G(vaccaroside G)(3)、王不留行次皂甙B(vaccarosideB)(4)、segetoside H(5)和segetoside I(6)。
2.化合物的结构鉴定
从王不留行分离得到一个新抗肿瘤三萜皂苷类化合vaccaroside I(1)，其波谱数据如下：
Vaccaroside I(1)白色无定型粉末，
-16.0°(c0.668，甲醇/水＝1/1)；ESIMS(positive mode)m/z1579[M+Na]+and1557[M+H]+.ESIMS(negative mode)m/z1555[M-H]-；HRESIMS(positive mode)m/z1579.6778[M+Na]+得出其分子式为C71H112O37，IRvmaxcm-1：3407，2931，1731，1677，1384，1205，1137，1072；1HNMR(C5D5N，400MHz)：δ0.86，1.03，1.06，1.13，1.47和1.85(各3H，s，C-25，C-29，C-30，C-26，C-24和C-27上的甲基氢)，3.42(1H，dd，J＝13.2，4.3Hz，H-18)，4.13(1H，m，H-3)，5.22(1H，brt，H-16)，5.61(1H，brs，H-12)，9.92(1H，s，H-23).其它NMR数据见表2。
其它五个化合物vaccaroside E(2)、vaccaroside G(3)、vaccaroid B(4)、Segetoside H(5)和Segetoside I(6)的结构鉴定是通过与文献中所报道的波谱数据比较得出的(Triterpenoid saponins and sapogenins from Vaccariasegetalis，Phytochemistry，1998，48，529-536.Triterpenoid saponins fromVaccariasegetalis，Phytochemistry，1998，47，1343-1349.Threenewtriterpenoid saponins from the seeds of Vaccaria segetalis，J.Asian Nat.Prod.Res.，2000，2，187-193.)。
表2化合物Vaccaroside1(1)的1H(400MHz)和13C(100MHz)核磁共振数据(C5D5N，Jin Hz)a
a氢和碳的归属是通过H-H COSY，HSQC和HMBC实验来完成的。GluA：葡萄糖醛酸，Gal：半乳糖，Fuc：岩藻糖，Rham：鼠李糖，Xyl：木糖，Glu：葡萄糖，其中碳原子编号请参见如下结构式：
3.药理试验
本发明对vaccaroside I(1)、vaccaroside E(2)、vaccaroside G(3)、Vaccaroside B(4)、segetoside H(5)和segetoside I(6)进行了体外抗肿瘤试验，表明它们具有明显的肿瘤抑制效果。试验所用的细胞株为国际通用的肿瘤细胞株，即：LNcap(人前列腺癌)、P-388(小鼠白血病)、A-549(人肺癌)。
将肿瘤细胞培养在10％小牛血清的RPMI1640培养基中，内含100U/mL青、链霉素和2mmol/L谷氨酰铵(GIBCO，Grand Island，NY)，在5％CO2和37℃条件下培养。化合物对前列腺癌细胞株LNcap和肺癌细胞株A549的细胞毒活性采用SRB法筛选(New colorimetric cytotoxicity assayfor anticancer-drug screening，J.Natl.Cancer Inst.，1990，82(13)：1107～1112)。实验前将细胞按一定密度接种于96孔培养基(6000细胞/孔)中，24小时后换用含有不同浓度受试药物(用PBS配成1μg/ml工作液，使用时按所需浓度用培养基稀释并加入细胞)的新鲜培养基，继续培养72小时。终止培养，每孔加入10％三氯乙酸(TCA，终浓度为10％)，静置5分钟后移放于4℃环境1小时。蒸馏水洗涤5次，空气干燥，加入100μl SRB染液(用1％醋酸配制成0.4％溶液)，染色处理细胞15分钟，用1％醋酸溶液洗涤细胞4次，除去未结合燃料，空气干燥。最后加入150μl10mmol/L非缓冲Tris溶液溶解结合染料，充分混匀后，经酶标仪(model VERSA Max，Molecular Devices)在515nm波长下测定并计算IC50。化合物对小鼠白血病细胞株P388的细胞毒作用是通过Methyl-Thiazol-Tetrazolium(MTT，Sigma)方法测定的(Feasibility of drug screening with panels of human tumorcell lines using a microculture tetrazolium assay，Cancer Res.，1988，48：589-601)。将细胞按8000细胞/孔的密度接种于96孔培养基中，然后换用含有不同浓度受试药物的新鲜培养基继续培养72小时。培养结束时，每个孔中分别加入MTT(5mg/ml)，将培养板置于37℃环境中4小时。然后向其中加入‘triplex solution’(10％十二烷基硫酸钠-5％异丁醇-12mM盐酸)，细胞继续在37℃环境中培养过夜。光密度可以在570nm处通过分光光度计上检测出。
细胞的生长抑制率可以通过如下公式计算：
[1-(A515药物组/A515空白组)]×100％
结果亦可以用IC50表示，该数值通过Logit法计算得出，实验结果见表3。
表3化合物1-6的细胞毒活性测试(IC50值，μM)a，b.
| 细胞株 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | Topotecan | Decotaxel |
| LNcap | 3.6 | 3.4 | 2.5 | 4.2 | 12.9 | 1.2 | 0.053 | |
| A-549 | 1.0 | 3.0 | 11.0 | 1.0 | 7.2 | 0.4 | <0.01 | |
| P-388 | 0.8 | 9.4 | 0.7 | 3.7 | 1.6 | 0.1 | <0.01 |
aIC50：半数有效抑制浓度值。
b拓扑替康(Topotecan)和多烯紫杉醇(decotaxel)作为阳性对照。
上述实验结果表明，三萜皂苷类化合物vaccaroside I(1)，vaccaroside E(2)，vaccaroside G(3)，vaccaroside B(4)，segetoside H(5)和segetoside I(6)对3种不同的肿瘤细胞株均显示明显的抑制作用。
本发明的有益效果：
本发明提供的从中药王不留行中分离得到的化合物以及这些化合物的医药用途为研制新的抗癌药物提供了新的思路，对深度开发中药资源具有重要价值。
具体实施方式
下面通过实施例进一步描述三萜皂苷类化合物vaccaroside I(1)，vaccaroside E(2)，vaccaroside G(3)，vaccaroside B(4)，segetoside H(5)和segetoside I(6)的分离制备，但实施例不限制本发明的保护范围。
实施例1：
选择经炮制后的王不留行药材5公斤，用60升85％(V/V)的工业乙醇回流提取三次，每次2小时，合并提取液，减压蒸馏回收乙醇得浸膏250克。浸膏经与300克100-200目硅胶拌样后，通过硅胶柱层析分别以丙酮和甲醇洗脱分离。收集甲醇洗脱液，减压回收溶剂至干，并经过D101大孔树脂柱脱糖后，得浸膏45克。取2克该浸膏配制成1克/毫升的水溶液，采用半制备型的高效液相色谱(Inertsil ODS-3柱：1.0×25厘米；30-38％CH3CN-水(含0.6％三氟乙酸)为洗脱体系；流速：3.5毫升/分钟；紫外检测器(210纳米)；进样量：200微升)进行分离，收集相应流份，多次重复操作，从中分离得到了六个三萜皂苷类化合物vaccaroside I(1，12mg)，vaccaroside E(2，51mg)，vaccaroside G(3，68mg)，vaccaroside B(4，18mg)，segetoside H(5，22mg)和segetoside I(6，24mg)。它们在HPLC图谱上的保留时间分别为7.638、8.533、19.875、17.596、21.250和13.392分钟(如图14所示)。
实施例2：
选择经炮制后的王不留行药材5公斤，用40升60％(V/V)的工业乙醇回流提取三次，每次2小时，合并提取液，减压蒸馏回收乙醇得浸膏260克。浸膏经与250克200-300目硅胶拌样后，通过硅胶柱层析分别以丙酮和甲醇洗脱分离。收集甲醇洗脱液，减压回收溶剂至干，并经过D101大孔树脂柱脱糖后，得浸膏50克。取2克该浸膏配制成1克/毫升的水溶液，采用半制备型的高效液相色谱(Inertsil ODS-3柱：1.0×25厘米；60～65％CH3OH-水(含1.6％三氟乙酸)的洗脱体系；流速：1.5毫升/分钟；紫外检测器(210纳米)；进样量：200微升)进行分离，收集相应流份，多次重复操作，从中分离得到了六个三萜皂苷类化合物vaccaroside I(1，15mg)，vaccaroside E(2，50mg)，vaccaroside G(3，70mg)，vaccaroside B(4，18mg)，segetoside H(5，20mg)和segetoside I(6，25mg)。
Claims (5)
1.从中药王不留行中分离获得的三萜皂苷类化合物，它的化学结构式如下：
2.如权利要求1所述三萜皂苷类化合物的制备方法，由如下步骤组成：
1)提取：经炮制后的王不留行样品，用50～90％的4～15倍量工业乙醇回流提取三次，每次1～5小时，合并提取液，减压蒸馏回收乙醇得总浸膏；
2)分离：王不留行总浸膏经硅胶柱层析，分别以含C1～C4的有机溶剂洗脱，收集洗脱液，经减压浓缩及D101大孔树脂脱糖后，采用半制备型的高效液相色谱分离：Inertsil ODS-3柱，10×250毫米；流动相流速为0.8～6.0毫升/分钟；紫外检测器波长为210纳米，从中得到如权利要求1中所述的三萜皂苷类化合物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤2)中的流动相为20～70％乙腈或甲醇-水，其中含0.06～5.50％三氟乙酸。
4.如权利要求1所述的三萜皂苷类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
5.具有如下结构式的从中药王不留行中分离获得的三萜皂苷类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用
2：R1＝α-OH，R2＝H；
3：R1＝α-H，R2＝H；
5：R1＝β-H，R2＝Ac；
6：R1＝β-OH，R2＝Ac。
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