CN103467560A - 新积雪草酸衍生物的制备及在抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于天然药物化学领域，涉及化学结构通式为式(1)所示的两种新化合物1和2的制备；本发明还涉及该新化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。其制备方法是利用发明人筛选的对积雪草酸具有结构修饰能力的蓝色犁头霉(Absidia coerulea)菌种，在优化条件下发酵培养，对积雪草酸进行转化7～10天，转化产物用有机溶剂萃取，分离纯化得到两个新的积雪草酸衍生物。

Description

新积雪草酸衍生物的制备及在抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明属于天然药物化学领域，涉及新的积雪草酸衍生物及其制备方法，以及新化合物在抗肿瘤方面的应用。

背景技术

积雪草酸(asiatic acid)，又名亚细亚酸，是药用伞形科植物积雪草中提取的三萜酸，属于乌苏烷型五环三萜类化合物。由于积雪草酸的化学结构中存在活泼的双键、羟基、羧基官能团，因而具有广泛的生物学活性，如保肝、抗肿瘤、改善神经认知障碍、抗抑郁、抗2型糖尿病、抗氧化、抗炎、抑菌等作用。

发明内容

本发明的目的是提供了一类新的积雪草酸衍生物。

本发明的另一个目的是提供了新积雪草酸衍生物的制备和抗肿瘤用途。

本发明是通过如下技术方案完成的，具体内容包括：积雪草酸的微生物转化反应、产物提取分离及结构鉴定、体外抗肿瘤活性评价。

(1)积雪草酸的植物悬浮培养细胞转化反应

将积雪草酸溶于乙醇溶液中，配成浓度为10～20g／L的底物溶液，加入到在25～28℃，150～200rpm／min条件下培养了1～3天的微生物中，转化反应条件为：25～28℃，150～200rpm／min，7～10天。

(2)产物的提取分离纯化

转化结束后，用乙酸乙酯等有机溶剂萃取，减压浓缩，经硅胶柱色谱、凝胶柱色谱分离纯化得到化合物1、化合物2。

(3)新化合物体外抗肿瘤活性评价

将新化合物作用于人肺癌细胞A-549、人结肠癌细胞SW480、人肝癌细胞HepG2，评价其抗肿瘤效果。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步说明，但其并不限制本发明的保护范围。

实施例1

新化合物1、2的制备及提取分离

在15瓶1000ml(每瓶400mL培养基)的三角瓶中以2％的接种量接入蓝色犁头霉Absidiacoerulea CGMCC3.2462菌种，置于恒温振荡器中，180rpm／min，27℃培养72h后加入300mg底物积雪草酸(溶于20ml乙醇中，每瓶加入2ml)，继续培养10天。发酵完成后，过滤菌丝体，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取三次，菌丝体干燥后粉碎，用500mL乙酸乙酯超声提取三次，每次30min，合并乙酸乙酯萃取液与提取液，置旋转蒸发仪上浓缩至小体积，干燥，得转化反应提取物(3.12g)。

将提取物用少量乙醇溶解，3g硅胶(200-300目)拌样，40g硅胶(300-400目)分离，氯仿／甲醇梯度洗脱(从100：0到90：10，共3000ml)，收集到五个流分：A(2547.1mg)，B(260.3mg)，C(121.3mg)为未反应的积雪草酸，D(24.0mg)，E(48.6mg)，流分D用凝胶柱分离，无水乙醇洗脱(10ml一个流分，共430ml)，得到化合物1(13.8mg)，流分E用凝胶柱分离，无水乙醇洗脱(10ml一个流分，共480ml)，得到化合物2(27.8mg)。

实施例2

新化合物1结构鉴定

化合物1为白色无定型粉末，HR-ESI-MS给出503.3391([M-H]^-)，结合¹H-NMR和¹³C-NMR推断确定分子式为C₃₀H₄₈O₆。¹H-NMR(600MHz，pyridine-d₅)中，显示该化合物有六组甲基氢信号δ0.82(3H，d，6.0)，0.95(3H，d，6.6)，1.06(3H，s)，1.07(3H，s)，1.09(3H，s)，1.23(3H，s)；低场处有两个活泼氢信号：δ5.64(dd，3.0，10.2)，δ6.14(d，10.2)，推测是双键上的氢。¹³C-NMR中显示两个不饱和碳原子δ129.8和δ134.0，一个羧基碳原子δ179.8。综合以上信息可以推断该化合物为乌苏烷型五环三萜酸类化合物。

依据HSQC、HMBC谱可以对化合物1的碳氢作进一步的归属。

与积雪草酸比较，¹³C-NMR谱中，化合物1在δ89.7处出现一个连氧碳信号，同时C-12和C-18分别向低场位移8.4ppm和7.4ppm，以上数据说明C-13位连有羟基，C／D环为反式构型，确定13位羟基为β型。综上，确定化合物1的结构为：2α，3β，13β，23-四羟基乌苏烷-11-烯-28-酸，为一新化合物，其¹H-NMR谱、¹³C-NMR谱信号归属见表1。

表1.化合物1的¹H NMR和¹³C NMR数据

新化合物2结构鉴定

化合物2为白色无定型粉末，HR-ESI-MS给出519.3322([M-H]^-)，结合¹H-NMR和¹³C-NMR推断确定分子式为C₃₀H₄₈O₇。¹H-NMR谱(600MHz，pyridine-d₅)中，显示该化合物有五组甲基氢信号δ1.06(3H，s)，1.07(3H，s)，1.12(3H，d)，1.13(3H，s)，1.24(3H，s)；低场处有两个活泼氢信号：δ5.68(dd，2.4，10.2)，δ6.15(d，10.2)，推测可能是双键上的氢。¹³C-NMR中显示两个不饱和碳原子δ130.0和δ134.0，一个羧基碳原子δ179.8。综合以上信息可以推断该化合物为乌苏烷型五环三萜酸类化合物。

依据HSQC、HMBC谱可以对化合物2的碳氢作进一步的归属。

与积雪草酸比较，¹³C-NMR谱中，化合物2在δ89.8处出现一个连氧碳信号，同时C-12和C-18分别向低场位移8.4ppm和7.5ppm，以上数据说明C-13位连有羟基，C／D环为反式构型，确定13位羟基为β型；¹H-NMR谱显示该化合物只有五组甲基氢信号，表明化合物2是化合物1的甲基碳的羟化产物，H-30中δ3.87(m)和δ3.84(m)的质子信号与C-19(δ33.1)和C-21(δ26.2)分别具有长程相关，因此推导新的羟基位于C-30。综上，确定化合物2的结构为：2α，3β，13β，23，30-五羟基乌苏烷-11-烯-28-酸，为一新化合物，其¹H-NMR谱、¹³C-NMR谱信号归属见表2。

表2.化合物2的¹H NMR和¹³CNMR数据

实施例3

新化合物体外抗肿瘤活性评价

将人肺癌细胞A-549、人结肠癌细胞SW480、人肝癌细胞HepG2分别接种于装有含有10％胎牛血清和100U/ml青霉素和链霉素的DMEM培养基的培养瓶中，置于37℃、5％CO₂的孵箱中培养，2-3天传代一次。传代：用0.25％胰酶消化至细胞变圆，吸出胰酶，加入带血清的培养基，反复吹打后，以1：4的比例稀释接种于新培养基中。

进行实验时将培养的细胞消化后得细胞悬液，以5×10⁴个／mL的细胞密度接种于96孔培养板，每孔100μl，于37℃、5％CO₂的孵箱中培养，24h后，将培养基换为含有不同浓度的积雪草酸及其衍生物(0，10，20，30，40，50，60，70，80，100μM)的DMEM培养基，继续培养48h后，加20μl／孔MTT(5mg／m1)，继续培养4h后，吸出孔内的培养液，加DMSO(150μl/孔)，在490nm下测其吸光度值(OD值)，计算IC₅₀。

实验结果见表3，结果显示本发明新化合物1和化合物2的抗肿瘤活性与积雪草酸相比，均有不同程度增强。

表3化合物1、2及积雪草酸对不同肿瘤细胞系的IC₅₀(μM)

本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只欲作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述可以很容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。

Claims (5)

1.新的积雪草酸衍生物，其特征在于该化合物具有化学通式(1)所示的化学结构：

其中，R=CH₃为化合物1；

或，R=CH₂OH为化合物2；

化合物1的化学结构为：2α，3β，13β，23-四羟基乌苏烷-11-烯-28-酸；

化合物2的化学结构为：2α，3β，13β，23，30-五羟基乌苏烷-11-烯-28-酸；

其结构分别为：

2.根据权利要求1所述的新的积雪草酸衍生物的制备方法是通过微生物酶对积雪草酸进行结构修饰。

3.根据权利要求2所述的新的积雪草酸衍生物的制备方法为：以积雪草酸为底物，利用微生物酶对底物进行生物转化，利用乙酸乙酯对发酵液中的转化产物进行萃取，利用硅胶柱层析、凝胶柱色谱进行转化产物的制备分离。

4.根据权利要求2所述的对积雪草酸进行结构修饰的微生物为蓝色犁头霉Absidia coeruleaCGMCC3.2462。

5.根据权利要求1所述的新的积雪草酸衍生物在制备抗肿瘤药物中的用途。