WO2019091287A1 - 一种中药组合物中八种成分的分离方法 - Google Patents

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Definitions

  • the present scheme relates to a method for separating various components in a traditional Chinese medicine composition.
  • the traditional Chinese medicine compound is the main form of traditional Chinese medicine. After thousands of years of clinical use, the compound can obtain a stronger therapeutic effect than the single-flavored medicine, which has fully proved the scientific nature of the compound composition.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is composed of 13 traditional Chinese medicines such as forsythia, honeysuckle and ramie, and has the effects of clearing away phlegm and detoxifying, and releasing lung and releasing heat, and is used for treating influenza. Clinical studies have confirmed that the pharmaceutical composition of the present invention is effective and effective in treating influenza and acute upper respiratory tract infections. In order to clarify the pharmacological mechanism of the compound and the scientific content of the compound drug compatibility law, systematic research on its material basis is necessary.
  • the present invention provides a method for separating eight compounds of a traditional Chinese medicine composition.
  • the traditional Chinese medicine composition is prepared from the following raw materials by weight: Forsythia 200-300, Ephedra 60-100, Rhubarb 40-60, Houttuynia 200-300, Honeysuckle 200-300, Radix Isatidis 200-300, Patchouli 60-100, Mianma Guanzhong 200-300, Rhodiola 60-100, menthol 5-9, bitter almond 60-100, licorice 60-100 and gypsum 200-300.
  • the separation method described in the present scheme includes the following steps:
  • step (2) Take the 50% ethanol elution site extract obtained in step (1), add the reverse phase silica gel ODS-AQ-HG, wait for the sample to dry naturally, and then load the sample, using the reverse phase ODS-AQ-HG open column. Separation, elution with methanol-water volume ratio of 20:80, 40:60, 60:40, 80:20 and 100% methanol, sequentially obtained Fr.A-Fr.E;
  • step (3) Take the Fr.A sample obtained in step (2), add the reverse phase silica gel ODS-AQ-HG and mix it. After the ODS is naturally dried, add the mixed ODS to the loading column, and press it on the upper part. The liquid phase was separated, and the liquid phase gradient was prepared by medium pressure.
  • the methanol-water volume ratio was 25:75-60:40, the flow rate was 25 mL/min, and the volume was received in an equal volume of 500 mL in an Erlenmeyer flask.
  • the combined fractions were detected by a thin layer chromatography plate and concentrated under reduced pressure to obtain Fr.A-1 ⁇ Fr.A-7;
  • the chromatographic peak was 10-12 min and further purified by high performance liquid chromatography.
  • the mobile phase acetonitrile-water volume ratio was 25:75, flow rate: 12 mL/min, detection wavelength 210 nm, column: YMC-Pack R&D ODS-A, 250 ⁇ 20 mm, S-10 ⁇ m, under this condition, a chromatographic peak with a retention time of 9-10 min was collected, and after recovering the solvent under reduced pressure, Compound 4 was obtained: Lohanol phenol-4'-O- ⁇ -D-glucose Glycoside
  • compound 8 was obtained; 14-15 min peak was further purified by high performance liquid chromatography, mobile phase: acetonitrile-water volume ratio 30:70, flow rate: 12 mL/min, detection wavelength 210 nm, column: YMC-Pack R&D ODS -A, 250 ⁇ 20 mm, S-10 ⁇ m, under this condition, a chromatographic peak with a retention time of 18-20 min was collected, and after recovering the solvent under reduced pressure, Compound 1:10-O-(p-hydroxycinnamoyl)-adoxosidic was obtained. Acid.
  • the preferred separation method of the present solution comprises the following steps:
  • the total extract of the traditional Chinese medicine composition is 5 kg, which is adsorbed by AB-8 macroporous resin, and sequentially eluted with water 150 L, 10% ethanol 87.5 L, 30% ethanol 225 L, 50% ethanol, 250 L, and concentrated to obtain various parts of the extract. ;
  • step (2) Take 200g of the 50% ethanol elution site extract obtained in step (1), add the reverse phase silica gel ODS-AQ-HG S-50 ⁇ m 200g and mix the sample. After the sample ODS is naturally dried, apply the sample. Phase ODS-AQ-HG S-50 ⁇ m open column separation, the sample height ratio is 1:4, and eluted 6L in a volume ratio of methanol-water 20:80 in a reduced pressure manner, 7L in 40:60, 60:40 Elution 7L, 80:20 elution 5L and 100% methanol 3L for elution, sequentially obtained Fr.A-Fr.E;
  • the chromatographic peak was 10-12 min and further purified by high performance liquid chromatography.
  • Mobile phase acetonitrile-water 25:75, flow rate: 12 mL/min, detection wavelength 210 nm, column: YMC-Pack R&D ODS-A, 250 ⁇ 20 mm, S-10 ⁇ m, under this condition, a chromatographic peak with a retention time of 9-10 min was collected, and after recovering the solvent under reduced pressure, Compound 4 was obtained: Lohanol phenol-4'-O- ⁇ -D-glucose Glycoside
  • the mobile phase acetonitrile-water volume ratio was 30:70, flow rate: 12 mL/min, detection wavelength 210nm, column: YMC-Pack R&D ODS-A, 250 ⁇ 20 mm, S-10 ⁇ m, under this condition, a chromatographic peak with a retention time of 18-20 min was collected, and after recovering the solvent under reduced pressure, compound 1:10-O-(p-hydroxycinnamoyl)-adoxosidic acid was obtained.
  • the traditional Chinese medicine composition is made of the following bulk parts of the drug substance:
  • Forsythia 200 Honeysuckle 300, Ban GmbH 200, Rhubarb 40, Patchouli 60, Mianma Guanzhong 300, Rhodiola 100, Menthol 9, Ephedra 60, Bitter Almond 100, Houttuynia 200, Licorice 100 and Gypsum 200 .
  • the traditional Chinese medicine composition is made of the following bulk parts of the drug substance:
  • Forsythia 300 Honeysuckle 200, Ban GmbH 300, Rhubarb 60, Patchouli 100, Mianma Guanzhong 200, Rhodiola 60, Menthol 5, Ephedra 100, Bitter Almond 60, Houttuynia 300, Licorice 60 and Gypsum 300 .
  • the traditional Chinese medicine composition is made of the following bulk parts of the drug substance:
  • the total extract of the traditional Chinese medicine composition described in the present scheme is prepared by the following steps:
  • the clear paste obtained in the step (4) is combined with the alcohol extract obtained in the step (3), and concentrated to a clear paste having a relative density of 1.15 - 1.20 at 60 ° C, and dried to obtain a total extract, which is ready for use.
  • the separation method provided by this protocol can separate 8 compounds, which are 10-O-(p-hydroxycinnamoyl)-adoxosidic Acid, aloe-emodin 8--O- ⁇ -D-glucopyranoside, quercetin, matairesinol-4'-O-glucoside, celery glycyrrhizin, epi-vogeloside, vogeloside and ethyl caffeate.
  • the clear paste obtained in the step (4) is combined with the alcohol extract obtained in the step (3), and concentrated to a clear paste having a relative density of 1.20 at 60 ° C, and dried to obtain a total extract, which is ready for use.
  • step (2) Take 200g of the 50% ethanol elution site extract obtained in step (1), add the reverse phase silica gel ODS-AQ-HG S-50 ⁇ m 200g and mix the sample. After the sample ODS is naturally dried, apply the sample. Phase ODS-AQ-HG S-50 ⁇ m open column separation, the sample height ratio is 1:4, and eluted 6L in a volume ratio of methanol-water 20:80 in a reduced pressure manner, 7L in 40:60, 60:40 Elution 7L, 80:20 elution 5L and 100% methanol 3L for elution, sequentially obtained Fr.A-Fr.E;
  • the chromatographic peak was 10-12 min and further purified by high performance liquid chromatography.
  • Mobile phase acetonitrile-water 25:75, flow rate: 12 mL/min, detection wavelength 210 nm, column: YMC-Pack R&D ODS-A, 250 ⁇ 20 mm, S -10 ⁇ m, under this condition, a chromatographic peak with a retention time of 9-10 min was collected, and after recovering the solvent under reduced pressure, Compound 4 : Lohanol phenol-4'- O- ⁇ -D-glucoside was obtained;
  • the mobile phase acetonitrile-water volume ratio was 30:70, flow rate: 12 mL/min, detection wavelength 210 nm, column: YMC-Pack R&D ODS-A, 250 ⁇ 20 mm, S-10 ⁇ m, under this condition, a chromatographic peak with a retention time of 18-20 min was collected, and after recovering the solvent under reduced pressure, Compound 1 :10- O- ( P- hydroxycinnamoyl)-adoxosidic acid.
  • the double bonds ⁇ H 7.56, 6.39 are related to phenyl carbon ⁇ C 125.5, and the double bonds ⁇ H 6.39 and -CH 2 - ⁇ H 4.12 are all related to the carbonyl ⁇ C 167.2.
  • the above fragments are free from other C and H chemical shifts. Correlation, it is speculated that this fragment is an independent fragment of p-hydroxycinnamoyl group, and the remaining part of the glycosyl-removed fragment is presumed to be a mother nucleus After calculation, the mother nucleus unsaturation is 4 (containing a carbonyl group and a double bond), and it is speculated that the mother nucleus is a bicyclic structure.
  • the HSQC and HMBC were linked and linked, and the compound was presumed to be an iridoid compound. Further, by literature search, the mother nucleus of the compound was determined to be adoxosidic acid.
  • the remaining fragment is p-hydroxycinnamic acid and esterified with the 10th position of the parent nuxosidic acid.
  • the compound was identified as a new compound by SciFinder and Reaxys database search (the configuration of the compound in this experiment has not been confirmed and will be confirmed in subsequent studies), which is 10- O -( p -hydroxycinnamoyl)-adoxosidic Acid.
  • the clear paste obtained in the step (4) is combined with the alcohol extract obtained in the step (3), and concentrated to a clear paste having a relative density of 1.15 at 60 ° C, and dried to obtain a total extract, which is ready for use.
  • the raw material formula is: 27.8kg for forsythia, 29.4kg for honeysuckle, 28.5kg for radix isatidis, 5.5kg for rhubarb, 9.5kg for patchouli, 29kg for cotton horse, 8.7kg for Rhodiola, 0.85kg for menthol, 8.8kg for ephedra, bitter 8kg of almonds, 28.4kg of houttuynia cordum, 9.5kg of licorice, 27.7kg of gypsum, extracted according to the following process:
  • the clear paste obtained in the step (4) is combined with the alcohol extract obtained in the step (3), and concentrated to a clear paste having a relative density of 1.18 at 60 ° C, and dried to obtain a total extract, which is ready for use.
  • the total extract of the traditional Chinese medicine composition of the present invention is 5 kg, adsorbed by HPD-100 macroporous resin, eluted with water, 10% ethanol, 30% ethanol, 50% ethanol, and concentrated to obtain extracts of various parts; the remaining steps are the same as in the first embodiment.
  • Example 1 In the same manner as in Example 1, eight compounds were isolated and identical to those obtained in Example 1.

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Abstract

本方案提供一种中药组合物的分离方法，为阐明复方的药理作用机制以及复方药物配伍规律的科学内含，对其物质基础进行系统的研究十分必要。基于此，对于本方案药物组合物的化学成分进行了深入研究，分离得到8个化合物，分别为10-O-(p-hydroxycinnamoyl)-adoxosidic acid、芦荟大黄素-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮苷、matairesinol-4'-O-glucoside、芹糖甘草苷、epi-vogeloside、vogeloside、咖啡酸乙酯，为本方案药物组合物的质量控制提供了一种新的方法。

Description

一种中药组合物中八种成分的分离方法 技术领域
本方案涉及到一种中药组合物中多种成分的分离方法。
 背景技术
中药复方是中医用药的主要形式，在经过几千年的临床使用中，复方可以获得比单味药更强的治疗效果，这已经充分证明了复方构成的科学性。本方案药物组合物由连翘、金银花和炙麻黄等13味中药组成，具有清瘟解毒、宣肺泄热之功效，用于治疗流行性感冒。临床研究证实本方案药物组合物治疗流感、急性上呼吸道感染疗效确切、效果显著。为阐明复方的药理作用机制以及复方药物配伍规律的科学内含，对其物质基础进行系统的研究十分必要。基于此，对于本方案药物组合物的化学成分进行了深入研究，分离得到8个化合物，分别为10-O-(p-hydroxycinnamoyl)-adoxosidic acid、芦荟大黄素-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮苷、罗汉松脂酚-4'-O-β-D-葡萄糖苷（matairesinol-4'-O-glucoside）、芹糖甘草苷、表断马钱子甙半缩醛内酯（epi-vogeloside）、断马钱子甙半缩醛内酯（vogeloside）和咖啡酸乙酯，为本方案药物组合物的质量控制提供了一种新的方法。
 技术问题
本方案提供一种中药组合物的8种化合物的分离方法。
 技术解决方案
该中药组合物由如下重量份的原料药制成：连翘200-300、麻黄60-100、大黄40-60、鱼腥草200-300、金银花200-300、板蓝根200-300、广藿香60-100、绵马贯众200-300、红景天60-100、薄荷脑5-9、苦杏仁60-100、甘草60-100和石膏200-300。
本方案所述分离方法包括以下步骤：
（1）该中药组合物总浸膏，经AB-8大孔树脂吸附，依次用水、10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇洗脱，分别收集各部分洗脱液，浓缩后得到各部位浸膏；
（2）取步骤（1）得到的50%乙醇洗脱部位浸膏，加入反相硅胶ODS-AQ-HG，待拌样自然晾干后，上样，利用反相ODS-AQ-HG开放柱分离，依次用甲醇-水体积比为20∶80、40∶60、60∶40、80∶20及100%甲醇进行洗脱，顺序得到Fr.A-Fr.E；
（3）取步骤（2）得到的Fr.A样品，加入反相硅胶ODS-AQ-HG拌样，待拌样ODS自然晾干后，将拌样ODS加入到上样柱内，上中压制备液相进行分离，中压制备液相梯度分离，甲醇-水体积比为25∶75~60∶40，流速：25mL/min，以500mL等体积接收流份于锥形瓶中，减压浓缩，经薄层层析板检识合并流份并再次减压浓缩，得到Fr.A-1~Fr.A-7；
（4）取步骤（3）得到的Fr.A-2样品与硅胶拌样，上硅胶柱，用二氯甲烷-甲醇体积比为8∶1等度分离，以50mL等体积接收流份，洗脱体积为800mL，薄层层析板检识合并流份得到Fr.A-1-1~Fr.A-1-4；
（5）取步骤（4）得到的Fr.A-1-2样品用甲醇溶解，采用高效液相色谱法，流动相甲醇-水体积比为50∶50，流速：12mL/min，检测波长：210nm，进行初步分离，分别收集保留时间为6-8min，9-10min，12-13min的色谱峰，并减压回收溶剂，分别进行以下分离：
6-8min色谱峰，经高效液相色谱法进一步纯化，流动相：乙腈-水体积比为25∶75，流速：12mL/min，检测波长210nm，色谱柱：YMC-Pack R&D ODS-A，250×20mm，S-10μm，在此条件下收集保留时间8-9min的色谱峰，减压回收溶剂后，得到化合物2：芦荟大黄素-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷；
9-10min色谱峰，经高效液相色谱进一步纯化，流动相：甲醇-水体积比为45∶55，流速：12mL/min，检测波长210nm，色谱柱：YMC-Pack R&D ODS-A，250×20mm，S-10μm，在此条件下收集保留时间21-23min的色谱峰，减压回收溶剂后，得到化合物3：槲皮苷；
10-12min色谱峰，经高效液相色谱进一步纯化，流动相：乙腈-水体积比为25∶75，流速：12mL/min，检测波长210nm，色谱柱：YMC-Pack R&D ODS-A，250×20mm，S-10μm，在此条件下收集保留时间9-10min的色谱峰，减压回收溶剂后，得到化合物4：罗汉松脂酚-4'-O-β-D-葡萄糖苷；
（6）取步骤（4）得到的Fr.A-1-3样品用甲醇溶解，采用高效液相色谱法，流动相甲醇-水体积比为30∶70，流速：12mL/min，检测波长：210nm，进行初步分离，分别收集保留时间为10-11min，17-19min，21-24min的色谱峰，并减压回收溶剂，17-19min为化合物6：表断马钱子甙半缩醛内酯，21-24min为化合物7：断马钱子甙半缩醛内酯，10-11min色谱峰，经高效液相色谱进一步纯化，流动相：乙腈-水体积比为15∶85，流速：12mL/min，检测波长210nm，色谱柱：YMC-Pack R&D ODS-A，250×20mm，S-10μm，在此条件下收集保留时间14-16min的色谱峰，减压回收溶剂后，得到化合物5：芹糖甘草苷；
（7）取步骤（3）得到的Fr.A-3样品用甲醇溶解，采用高效液相色谱法，流动相为甲醇-水体积比60∶40，流速：12mL/min，检测波长：210nm，进行初步分离，分别收集保留时间为14-15min，19-21min的色谱峰，并减压回收溶剂，19-21min的色谱峰收集液在二氯甲烷-甲醇溶液体积比为2∶1中析出白色沉淀，得到化合物8；14-15min色谱峰经高效液相色谱进一步纯化，流动相：乙腈-水体积比为30∶70，流速：12mL/min，检测波长210nm，色谱柱：YMC-Pack R&D ODS-A，250×20mm，S-10μm，在此条件下收集保留时间18-20min的色谱峰，减压回收溶剂后，得到化合物1：10-O-(p-hydroxycinnamoyl)-adoxosidic acid。
优选的本方案所述分离方法包括以下步骤：
（1）该中药组合物总浸膏5kg，经AB-8大孔树脂吸附，依次用水150L、10%乙醇87.5L、30%乙醇225L、50%乙醇洗脱250L，浓缩后得到各部位浸膏；
（2）取步骤（1）得到的50%乙醇洗脱部位浸膏200g，加入反相硅胶ODS-AQ-HG  S-50μm 200g拌样，待拌样ODS自然晾干后，上样，利用反相 ODS-AQ-HG S-50μm 开放柱分离，样高比为1∶4，以减压方式依次用体积比为甲醇-水20∶80洗脱6L，40∶60洗脱7L，60∶40洗脱7L，80∶20洗脱5L及100%甲醇3L进行洗脱，顺序得到Fr.A-Fr.E；
（3）取步骤（2）得到的Fr.A样品50.0g，加入反相硅胶ODS-AQ-HG S-50μm 50g拌样，待拌样ODS自然晾干后，将拌样ODS加入到上样柱内，上中压制备液相进行分离，分离柱填料为ODS-AQ-HG S-50μm，中压制备液相梯度分离，甲醇-水体积比为25∶75~60∶40，流速：25mL/min，以500mL等体积接收流份于锥形瓶中，减压浓缩，经薄层层析板检识合并流份并再次减压浓缩，得到Fr.A-1~Fr.A-7；
（4）取步骤（3）得到的Fr.A-2样品3.2g与6.4g硅胶200~300目拌样，上硅胶柱，样高比1∶50，用二氯甲烷-甲醇体积比为8∶1等度分离，以50mL等体积接收流份，洗脱体积为800mL，薄层层析板检识合并流份得到Fr.A-1-1~Fr.A-1-4；
（5）取步骤（4）得到的Fr.A-1-2样品用甲醇溶解，溶解液过0.45μm微孔滤膜，采用高效液相色谱法，流动相甲醇-水体积比为50∶50，流速：12mL/min，检测波长：210nm，进行初步分离，分别收集保留时间为6-8min，9-10min，12-13min的色谱峰，并减压回收溶剂，分别进行以下分离：
6-8min色谱峰，经高效液相色谱法进一步纯化，流动相：乙腈-水体积比为25∶75，流速：12mL/min，检测波长210nm，色谱柱：YMC-Pack R&D ODS-A，250×20mm，S-10μm，在此条件下收集保留时间8-9min的色谱峰，减压回收溶剂后，得到化合物2：芦荟大黄素-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷；
9-10min色谱峰，经高效液相色谱进一步纯化，流动相：甲醇-水体积比为45∶55，流速：12mL/min，检测波长210nm，色谱柱：YMC-Pack R&D ODS-A，250×20mm，S-10μm，在此条件下收集保留时间21-23min的色谱峰，减压回收溶剂后，得到化合物3：槲皮苷；
10-12min色谱峰，经高效液相色谱进一步纯化，流动相：乙腈-水25∶75，流速：12mL/min，检测波长210nm，色谱柱：YMC-Pack R&D ODS-A，250×20mm，S-10μm，在此条件下收集保留时间9-10min的色谱峰，减压回收溶剂后，得到化合物4：罗汉松脂酚-4'-O-β-D-葡萄糖苷；
（6）取步骤（4）得到的Fr.A-1-3样品用甲醇溶解，溶解液过0.45μm微孔滤膜，采用高效液相色谱法，流动相甲醇-水体积比为30∶70，流速：12mL/min，检测波长：210nm，进行初步分离，分别收集保留时间为10-11min，17-19min，21-24min的色谱峰，并减压回收溶剂，17-19min为化合物6：表断马钱子甙半缩醛内酯，21-24min为化合物7：断马钱子甙半缩醛内酯，10-11min色谱峰，经高效液相色谱进一步纯化，流动相：乙腈-水体积比为15∶85，流速：12mL/min，检测波长210nm，色谱柱：YMC-Pack R&D ODS-A，250×20mm，S-10μm，在此条件下收集保留时间14-16min的色谱峰，减压回收溶剂后，得到化合物5：芹糖甘草苷；
（7）取步骤（3）得到的Fr.A-3样品用甲醇溶解，溶解液过0.45μm微孔滤膜，采用高效液相色谱法，流动相为甲醇-水体积比60∶40，流速：12mL/min，检测波长：210nm，进行初步分离，分别收集保留时间为14-15min，19-21min的色谱峰，并减压回收溶剂，19-21min的色谱峰收集液在二氯甲烷-甲醇溶液体积比为2∶1中析出白色沉淀，得到化合物8；14-15min色谱峰经高效液相色谱进一步纯化，流动相：乙腈-水体积比为30∶70，流速：12mL/min，检测波长210nm，色谱柱：YMC-Pack R&D ODS-A，250×20mm，S-10μm，在此条件下收集保留时间18-20min的色谱峰，减压回收溶剂后，得到化合物1：10-O-(p-hydroxycinnamoyl)-adoxosidic acid。
优选的，中药组合物是由如下重量份的原料药制成：
连翘200、金银花300、板蓝根200、大黄40、广藿香60、绵马贯众300、红景天100、薄荷脑9、麻黄60、苦杏仁100、鱼腥草200、甘草100和石膏200。
优选的，中药组合物是由如下重量份的原料药制成：
连翘300、金银花200、板蓝根300、大黄60、广藿香100、绵马贯众200、红景天60、薄荷脑5、麻黄100、苦杏仁60、鱼腥草300、甘草60和石膏300。
优选的，中药组合物是由如下重量份的原料药制成：
连翘278、金银花294、板蓝根285、大黄55、广藿香95、绵马贯众290、红景天87、薄荷脑8.5、麻黄88、苦杏仁80、鱼腥草284、甘草95、石膏277。
本方案所述中药组合物总浸膏由以下步骤制成：
（1）按照原料药重量比例称取中药材，净选，酌情碎断；
（2）广藿香碎断，加10倍量水提取挥发油，提油时间8小时，收集挥发油，备用；提取液过滤后，残渣弃去，滤液备用；
（3）连翘、麻黄、鱼腥草、大黄，用12倍量70%的乙醇提取3次，每次2.5小时，提取液合并过滤，回收乙醇，滤液备用；
（4）金银花、石膏、板蓝根、绵马贯众、甘草、红景天，加12倍量水煎煮至沸，加入苦杏仁，煎煮2次，每次1小时，提取液合并过滤，所得滤液与步骤（2）广藿香提油后的滤液合并，浓缩成在60℃时测定相对密度为1.10-1.15的清膏，加入乙醇，调节至醇浓度为70%，冷藏放置，过滤，回收乙醇至无醇味，得清膏备用；
（5）将步骤（4）所得清膏与步骤（3）所得醇提液合并，浓缩至在60℃时测定相对密度为1.15-1.20的清膏，干燥，得总浸膏，备用。
 有益效果
本方案提供的分离方法能够分离得到8个化合物，分别为10-O-(p-hydroxycinnamoyl)-adoxosidic acid、芦荟大黄素-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮苷、matairesinol-4'-O-glucoside、芹糖甘草苷、epi-vogeloside、vogeloside和咖啡酸乙酯。
 本发明的实施方式
实施例1
按比例称取：连翘20kg、金银花30kg、板蓝根20kg、大黄4kg、广藿香6kg、绵马贯众30kg、红景天10kg、薄荷脑0.9kg、麻黄6kg、苦杏仁10kg、鱼腥草20kg、甘草10kg、石膏20kg，按照以下工艺提取：
（1）按照原料药重量比例称取中药材，净选，酌情碎断；
（2）广藿香碎断，加10倍量水提取挥发油，提油时间8小时，收集挥发油，备用；提取液过滤后，残渣弃去，滤液备用；
（3）连翘、麻黄、鱼腥草、大黄，用12倍量70%的乙醇提取3次，每次2.5小时，提取液合并过滤，回收乙醇，滤液备用；
（4）金银花、石膏、板蓝根、绵马贯众、甘草、红景天，加12倍量水煎煮至沸，加入苦杏仁，煎煮2次，每次1小时，提取液合并过滤，所得滤液与步骤（2）广藿香提油后的滤液合并，浓缩成在60℃时测定相对密度为1.15的清膏，加入乙醇，调节至醇浓度为70%，冷藏放置，过滤，回收乙醇至无醇味，得清膏备用；
（5）将步骤（4）所得清膏与步骤（3）所得醇提液合并，浓缩至在60℃时测定相对密度为1.20的清膏，干燥，得总浸膏，备用。
分离方法步骤如下：
1、仪器和材料
Bruker Alpha红外光谱仪（瑞士Bruker公司）；Bruker AVIIIHD 600核磁共振波谱仪（瑞士Bruker公司）；Synapt G2-S Mass质谱仪（美国Waters公司）；Combi Flash Rf中低压制备液相色谱仪（美国Teledvne ISCO公司）；NP7000制备液相色谱仪（江苏汉邦科技有限公司）；Milli-Q纯水净化器（美国Millipore公司）；AL204分析电子天平（美国Mettler Toledo公司）；YMC ODS-A-HG 50μm反相硅胶（日本YMC公司）；柱层析硅胶（100～200目和200～300目，青岛海洋化工厂）；薄层层析硅胶板GF 254（青岛海洋化工厂）；YMC-Pack R&D ODS-A（250×20mm，S-10μm，日本YMC公司）；本方案中药组合物总浸膏（石家庄以岭药业股份有限公司，批号：B1509001）；色谱纯乙腈、甲醇（上海阿达玛斯试剂公司）；分析纯试剂（北京化工厂）。
2、提取和分离
（1）取该中药组合物总浸膏5kg，经AB-8大孔树脂吸附，依次用水150L、10%乙醇87.5L、30%乙醇225L、50%乙醇洗脱250L，浓缩后得到各部位浸膏；
（2）取步骤（1）得到的50%乙醇洗脱部位浸膏200g，加入反相硅胶ODS-AQ-HG  S-50μm 200g拌样，待拌样ODS自然晾干后，上样，利用反相 ODS-AQ-HG S-50μm 开放柱分离，样高比为1∶4，以减压方式依次用体积比为甲醇-水20∶80洗脱6L，40∶60洗脱7L，60∶40洗脱7L，80∶20洗脱5L及100%甲醇3L进行洗脱，顺序得到Fr.A-Fr.E；
（3）取步骤（2）得到的Fr.A样品50.0g，加入反相硅胶ODS-AQ-HG S-50μm 50g拌样，待拌样ODS自然晾干后，将拌样ODS加入到上样柱内，上中压制备液相进行分离，分离柱填料为ODS-AQ-HG S-50μm，中压制备液相梯度分离，甲醇-水体积比为25∶75~60∶40，流速：25mL/min，以500mL等体积接收流份于锥形瓶中，减压浓缩，经薄层层析板检识合并流份并再次减压浓缩，得到Fr.A-1~Fr.A-7；
（4）取步骤（3）得到的Fr.A-2样品3.2g与6.4g硅胶200~300目拌样，上硅胶柱，样高比1∶50，用二氯甲烷-甲醇体积比为8∶1等度分离，以50mL等体积接收流份，洗脱体积为800mL，薄层层析板检识合并流份得到Fr.A-1-1~Fr.A-1-4；
（5）取步骤（4）得到的Fr.A-1-2样品用甲醇溶解，溶解液过0.45μm微孔滤膜，采用高效液相色谱法，流动相甲醇-水体积比为50∶50，流速：12mL/min，检测波长：210nm，进行初步分离，分别收集保留时间为6-8min，9-10min，12-13min的色谱峰，并减压回收溶剂，分别进行以下分离：
6-8min色谱峰，经高效液相色谱法进一步纯化，流动相：乙腈-水体积比为25∶75，流速：12mL/min，检测波长210nm，色谱柱：YMC-Pack R&D ODS-A，250×20mm，S-10μm，在此条件下收集保留时间8-9min的色谱峰，减压回收溶剂后，得到化合物 2：芦荟大黄素-8- O- β- D-吡喃葡萄糖苷；
9-10min色谱峰，经高效液相色谱进一步纯化，流动相：甲醇-水体积比为45∶55，流速：12mL/min，检测波长210nm，色谱柱：YMC-Pack R&D ODS-A，250×20mm，S-10μm，在此条件下收集保留时间21-23min的色谱峰，减压回收溶剂后，得到化合物 3：槲皮苷；
10-12min色谱峰，经高效液相色谱进一步纯化，流动相：乙腈-水25∶75，流速：12mL/min，检测波长210nm，色谱柱：YMC-Pack R&D ODS-A，250×20mm，S-10μm，在此条件下收集保留时间9-10min的色谱峰，减压回收溶剂后，得到化合物 4：罗汉松脂酚-4'- O-β-D-葡萄糖苷；
（6）取步骤（4）得到的Fr.A-1-3样品用甲醇溶解，溶解液过0.45μm微孔滤膜，采用高效液相色谱法，流动相甲醇-水体积比为30∶70，流速：12mL/min，检测波长：210nm，进行初步分离，分别收集保留时间为10-11min，17-19min，21-24min的色谱峰，并减压回收溶剂，17-19min为化合物 6 ：表断马钱子甙半缩醛内酯，21-24min为化合物 7 ：断马钱子甙半缩醛内酯，10-11min色谱峰，经高效液相色谱进一步纯化，流动相：乙腈-水体积比为15∶85，流速：12mL/min，检测波长210nm，色谱柱：YMC-Pack R&D ODS-A，250×20mm，S-10μm，在此条件下收集保留时间14-16min的色谱峰，减压回收溶剂后，得到化合物 5：芹糖甘草苷；
（7）取步骤（3）得到的Fr.A-3样品用甲醇溶解，溶解液过0.45μm微孔滤膜，采用高效液相色谱法，流动相为甲醇-水体积比60∶40，流速：12mL/min，检测波长：210nm，进行初步分离，分别收集保留时间为14-15min，19-21min的色谱峰，并减压回收溶剂，19-21min的色谱峰收集液在二氯甲烷-甲醇溶液体积比为2∶1中析出白色沉淀，得到化合物 8；14-15min色谱峰经高效液相色谱进一步纯化，流动相：乙腈-水体积比为30∶70，流速：12mL/min，检测波长210nm，色谱柱：YMC-Pack R&D ODS-A，250×20mm，S-10μm，在此条件下收集保留时间18-20min的色谱峰，减压回收溶剂后，得到化合物 1：10- O-( p-hydroxycinnamoyl)-adoxosidic acid。
3、结构鉴定
3.1新化合物结构鉴定
化合物 1：淡黄色粉末，UV λ max（MeOH）：228，312nm。红外显示有羟基（3330cm -1）、α,β-不饱和羰基（1680，1630cm -1）和苯环（1603，1514cm-1）。HR-ESI-MS m/z：521.1699[M-H] -（计算值：521.1659），结合NMR数据确定该化合物的分子式为C 25H 30O 12。不饱和度为11。
1H-NMR（DMSO- d 6 ，600MHz）谱（表1）显示，该化合物含有一对反式双键 δ7.56（1H，d， J=16.2Hz），6.39（1H，d， J=16.2Hz）和AB系统芳香氢 δ7.55（2H，d， J=8.4Hz），6.79（2H，d， J=8.4Hz），氢谱化学位移为4.52（1H，d， J=7.8Hz），推测为糖的端基氢。
13C-NMR（DMSO- d 6 ，150MHz）谱（表1）显示，该化合物含有两个共轭的羰基碳（ δ C ：168.4，167.2）和两个明显片段， δ C ：116.2（2C），130.8（2C），160.2应为对羟基苯基片段， δ C ：99.3，77.6，77.1，73.6，70.4，61.6为葡萄糖基片段。
通过HMBC，双键 δ H 7.56、6.39与苯基碳 δ C 125.5相关，双键 δ H  6.39和-CH 2- δ H 4.12均与羰基 δ C 167.2相关，以上片段与其它C、H化学位移无相关，推测该片段为独立片段对羟基肉桂酰基，剩余部分除去糖基片段推测为母核。经过计算，母核不饱和度为4（含有一个羰基和双键），推测该母核为双环结构。通过HSQC、HMBC归属并连接，推测该化合物为环烯醚萜类化合物，进一步通过文献检索，确定该化合物母核为adoxosidic acid。
可知剩余片段为对羟基肉桂酸，与母核adoxosidic acid的10位成酯。通过SciFinder和Reaxys数据库检索，确定该化合物为新化合物（本实验中该化合物构型尚未确认，将在后续研究中进行确认），为10- O-( p-hydroxycinnamoyl)-adoxosidic acid。
表1 化合物1的NMR数据
Table 1 NMR data of compound 1
碳位 δH δC
1 5.14（1H，d，J=6.6Hz） 96.5
3 7.40（1H，s） 151.6
4   111.4
5 2.77（1H，m） 35.1
6 1.42（1H，m），2.09（1H，m） 32.1
7 1.35（1H，m），1.79（1H，m） 27.6
8 2.25（1H，m） 40.2
9 1.92（1H，m） 43.1
10 4.12（2H，m） 67.1
11   168.4
1' 4.52（1H，d，J=7.8Hz） 99.3
2' 3.01（1H，m） 73.6
3' 3.17（1H，m） 77.1a
4' 3.14（1H，m） 70.4
5' 3.17（1H，m） 77.6a
6' 3.43（1H，d，J=11.4Hz），3.68（1H，d，J=11.4Hz） 61.6
1''   125.5
2''6'' 7.55（2H，d，J=8.4Hz） 130.8
3''5'' 6.79（2H，d，J=8.4Hz） 116.2
4''   160.2
7'' 7.56（1H，d，J=16.2Hz） 145.2
8'' 6.39（1H，d，J=16.2Hz） 114.5
9''   167.2
a化学位移可能需互换
Figure dest_path_image001
Figure dest_path_image002
3.2已知化合物结构鉴定
化合物 2：黄色粉末，ESI-MS m/z：431[M-H] -，结合NMR数据确定该化合物的分子式为C 21H 20O 10。 1H-NMR（DMSO- d 6 ，600MHz） δ H ：12.88（1H，s，OH），7.89（1H，dd， J=1.2，8.4Hz，H-5），7.86（1H，t， J=7.8Hz，H-6），7.72（1H，dd， J=1.2，8.4Hz，H-7），7.66（1H，brs，H-4），7.28（1H，brs，H-2），5.17（1H，d， J=7.8Hz，anomeric-H），4.62（2H，s，CH 2OH），3.72~3.23（Glc-H）。 13C-NMR（DMSO- d 6 ，150MHz） δ H ：188.8（C-9），182.6（C-10），162.2（C-1），158.7（C-8），152.7（C-3），136.4（C-6），135.3（C-10a），132.7（C-4a），122.9（C-7），121.2（C-2），121.0（C-5），116.4（C-8a，C-9a），100.9（C-1'），77.7（C-5'），77.0（C-3'），73.7（C-2'），70.0（C-4'），62.5（CH 2OH），61.0（C-6'）。以上氢谱特征及碳谱数据与文献报道基本一致，鉴定该化合物为芦荟大黄素-8- O- β- D-吡喃葡萄糖苷。
化合物 3：黄色粉末，ESI-MS m/z：447[M-H] -，结合NMR数据确定该化合物的分子式为C 21H 20O 11。 1H-NMR（DMSO- d 6 ，600MHz） δ H ：12.66（1H，s，5-OH），7.31（1H，d， J=2.4Hz，H-2'），7.26（1H，d， J=2.4，8.4Hz，H-6'），6.87（1H，d， J=8.4Hz，H-5'），6.39（1H，d， J=2.4Hz，H-8），6.21（1H，d， J=2.4Hz，H-6），5.26（1H，d， J=1.8Hz，anomeric-H），0.82（3H，d， J=6.0Hz，CH 3）。 13C-NMR（DMSO- d 6 ，150MHz） δ C ：178.2（C-4），164.6（C-7），161.7（C-5），157.7（C-2），156.9（C-9），148.9（C-4'），145.6（C-3'），134.7（C-3），121.5（C-6'），121.2（C-1'），116.1（C-5'），115.9（C-2'），104.5（C-10），102.3（C-1''），99.1（C-6），94.1（C-8），71.6（C-4''），71.0（C-3''），70.8（C-2''），70.5（C-5''），17.9（C-6''）。以上氢谱特征及碳谱数据与文献报道基本一致，鉴定该化合物为槲皮苷。
化合物 4：黄色粉末，ESI-MS m/z：519[M-H] -，结合NMR数据确定该化合物的分子式为C 26H 32O 11。 1H-NMR（DMSO- d 6 ，600MHz） δ H ：6.99（1H，d， J=8.4Hz，H-5），6.78（1H，d， J=1.8Hz，H-2'），6.67（2H，m，H-5，H-6'），6.63（1H，s，H-2），6.50（1H，dd， J=1.8，8.4Hz，H-6），4.84（1H，d， J=7.8Hz，H-1''），4.09（1H，t， J=7.8Hz，H-9a），3.86（1H，t， J=8.4Hz，H-9b），3.72（6H，d， J=2.4Hz，2×OCH 3）。 13C-NMR（DMSO- d 6 ，150MHz） δ C ：178.9（C-9'），149.1（C-3'），147.9（C-3），145.7（C-4'），145.4（C-4），132.2（C-1'），130.0（C-1），121.8（C-6'），121.2（C-6），115.9（C-5'），115.6（C-5），114.3（C-2'），113.1（C-2），100.6（C-1''），77.4（C-5''），77.3（C-3''），73.7（C-2''），71.1（C-9），70.1（C-4''），61.1（C-6''），56.1（OCH 3），56.0（OCH 3），46.0（C-8'），41.3（C-8），37.3（C-7），33.9（C-7'）。以上碳谱数据与文献报道基本一致，鉴定该化合物为matairesinol-4'- O-glucoside。
化合物 5：白色粉末，ESI-MS m/z：549[M-H] -，结合NMR数据确定该化合物的分子式为C 26H 30O 13。 1H-NMR（CD 3OD，600MHz） δ H ：7.70（1H，d， J=9.0Hz，H-5），7.40（2H，d， J=8.4Hz，H-2′，6′），7.09（2H，d， J=9.0Hz，H-3′，5′），6.48（1H，dd， J=2.4，9.0Hz，H-6），6.34（1H，d， J=2.4Hz，H-8），5.46（1H，d， J=1.2Hz，H-1′′′），5.39（1H，dd， J=2.4，13.2Hz，H-2），4.98（1H，d， J=7.2Hz，H-1″），4.04（1H，d， J=9.6Hz，H-5′′′a），3.89（1H，d， J=1.2Hz，H-2′′′），3.88（1H，dd， J=1.2，12.0Hz，H-6″a），3.79（1H，d， J=9.6Hz，H-5′′′b），2.99（1H，m，H-3a），2.74（1H，dd， J=2.4，16.8Hz，H-3b）。 13C-NMR（CD 3OD，150MHz） δ C ：193.2（C-4），166.7（C-7），165.3（C-8a），159.0（C-4′），134.3（C-1′），129.9（C-5），128.8（C-2′，6′），117.6（C-3′，5′），114.9（C-4a），111.8（C-6），110.7（C-1′′′），103.8（C-8），100.7（C-1″），80.7（C-2），80.6（C-3′′′），78.8（C-5″），78.6（C-2′′′），78.0（C-2″），77.9（C-3″），75.4（C-4′′′），71.4（C-4″），66.0（C-5′′′），62.4（C-6″），44.9（C-3）。以上氢谱特征及碳谱数据与文献报道基本一致，鉴定该化合物为芹糖甘草苷。
化合物 6：白色粉末，ESI-MS m/z：387[M-H] -，结合NMR数据确定该化合物的分子式为C 17H 24O 10。 1H-NMR（CD 3OD，600MHz） δ H ：7.60（1H，d， J=2.4Hz，H-3），5.55（1H，d， J=1.8Hz，H-1），5.48（1H，m，H-8），5.31（1H，s，H-7），5.29（1H，m，H-10a），5.25（1H，m，H-10b），4.67（1H，d， J=7.8Hz，H-1'），3.50（1H，s，7-OCH 3），3.18（1H，m，H-5），2.63（1H，m，H-9），1.85（1H，dd， J=6.0，13.2Hz，H-6a），1.69（1H，td， J=3.0，13.8Hz，H-6b）。 13C-NMR（CD 3OD，150MHz） δ C ：167.4（C-11），154.4（C-4），133.3（C-8），121.0（C-10），105.3（C-4），103.3（C-7），100.3（C-1'），98.5（C-1），78.3（C-5'），78.0（C-3'），74.6（C-2'），71.4（C-4'），62.6（C-6'），57.0（7-OCH 3），43.5（C-9），30.2（C-6），22.8（C-5）。以上氢谱特征及碳谱数据文献报道基本一致，鉴定该化合物为epi-vogeloside。
化合物 7：白色粉末，ESI-MS m/z：387[M-H] -，结合NMR数据确定该化合物的分子式为C 17H 24O 10。 1H-NMR（CD 3OD，600MHz） δ H ：7.58（1H，d， J=2.4Hz，H-3），5.55（1H，d， J=1.2Hz，H-1），5.47（1H，m，H-8），5.31（1H，s，H-7），5.29（1H，m，H-10a），5.26（1H，m，H-10b），4.66（1H，d， J=7.8Hz，H-1'），3.54（1H，s，7-OCH 3），3.16（1H，m，H-5），2.67（1H，m，H-9），1.97（1H，m，H-6a），1.44（1H，m，H-6b）。 13C-NMR（CD 3OD，150MHz） δ C ：167.6（C-11），154.1（C-4），133.0（C-8），121.1（C-10），105.4（C-4），105.1（C-7），99.7（C-1'），97.9（C-1），78.4（C-5'），77.8（C-3'），74.7（C-2'），71.5（C-4'），62.6（C-6'），57.1（7-OCH 3），43.7（C-9），31.7（C-6），25.3（C-5）。以上氢谱特征与文献报道基本一致，并对碳信号进行归属，鉴定该化合物为vogeloside。
化合物 8：白色粉末，ESI-MS m/z：209[M+H] +，结合NMR数据确定该化合物的分子式为C 11H 12O 4。 1H-NMR（DMSO- d 6 ，600MHz） δ H ：7.46（1H，d， J=15.9Hz，H-7），7.04（1H，brs，H-2），6.99（1H，d， J=8.1Hz，H-6），6.75（1H，d， J=8.1Hz，H-5），6.24（1H，d， J=15.9Hz，H-8），4.15（2H，q， J=7.1Hz，H-10），1.24（3H，t， J=7.1Hz，H-11）。 13C-NMR（DMSO- d 6 ，150MHz） δ C ：166.5（C-9），148.6（C-4），145.0（C-7），145.6（C-3），121.3（C-6），125.3（C-1），115.7（C-5），114.7（C-2），113.9（C-8），59.6（C-10），14.3（C-11）。以上氢谱特征及碳谱数据与文献报道基本一致，鉴定该化合物为咖啡酸乙酯。
实施例2
按比例称取：连翘30kg、金银花20kg、板蓝根30kg、大黄6kg、广藿香10kg、绵马贯众20kg、红景天6kg、薄荷脑0.5kg、麻黄10kg、苦杏仁6kg、鱼腥草30kg、甘草6kg、石膏30kg，按照以下工艺提取：
（1）按照原料药重量比例称取中药材，净选，酌情碎断；
（2）广藿香碎断，加10倍量水提取挥发油，提油时间8小时，收集挥发油，备用；提取液过滤后，残渣弃去，滤液备用；
（3）连翘、麻黄、鱼腥草、大黄，用12倍量70%的乙醇提取3次，每次2.5小时，提取液合并过滤，回收乙醇，滤液备用；
（4）金银花、石膏、板蓝根、绵马贯众、甘草、红景天，加12倍量水煎煮至沸，加入苦杏仁，煎煮2次，每次1小时，提取液合并过滤，所得滤液与步骤（2）广藿香提油后的滤液合并，浓缩成在60℃时测定相对密度为1.10的清膏，加入乙醇，调节至醇浓度为70%，冷藏放置，过滤，回收乙醇至无醇味，得清膏备用；
（5）将步骤（4）所得清膏与步骤（3）所得醇提液合并，浓缩至在60℃时测定相对密度为1.15的清膏，干燥，得总浸膏，备用。
1、仪器和材料同实施例1。
2、提取和分离：
取本方案中药组合物总浸膏5kg，经d-101大孔树脂吸附，水、10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇洗脱，浓缩后得到各部位浸膏；其余步骤同实施例1。
3 、结果鉴定同实施例1，分离得到八种化合物与实施例1得到的完全相同。
实施例3
原料药配方为：连翘27.8kg、金银花29.4kg、板蓝根28.5kg、大黄5.5kg、广藿香9.5kg、绵马贯众29kg、红景天8.7kg、薄荷脑0.85kg、麻黄8.8kg、苦杏仁8kg、鱼腥草28.4kg、甘草9.5kg、石膏27.7kg，按照以下工艺提取：
（1）按照原料药重量比例称取中药材，净选，酌情碎断；
（2）广藿香碎断，加10倍量水提取挥发油，提油时间8小时，收集挥发油，备用；提取液过滤后，残渣弃去，滤液备用；
（3）连翘、麻黄、鱼腥草、大黄，用12倍量70%的乙醇提取3次，每次2.5小时，提取液合并过滤，回收乙醇，滤液备用；
（4）金银花、石膏、板蓝根、绵马贯众、甘草、红景天，加12倍量水煎煮至沸，加入苦杏仁，煎煮2次，每次1小时，提取液合并过滤，所得滤液与步骤（2）广藿香提油后的滤液合并，浓缩成在60℃时测定相对密度为1.13的清膏，加入乙醇，调节至醇浓度为70%，冷藏放置，过滤，回收乙醇至无醇味，得清膏备用；
（5）将步骤（4）所得清膏与步骤（3）所得醇提液合并，浓缩至在60℃时测定相对密度为1.18的清膏，干燥，得总浸膏，备用。
1、仪器和材料同实施例1。
2、提取和分离：
本方案中药组合物总浸膏5kg，经HPD-100大孔树脂吸附，水、10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇洗脱，浓缩后得到各部位浸膏；其余步骤同实施例1。
3、结果鉴定
同实施例1，分离得到八种化合物与实施例1得到的完全相同。
以上所述仅为本方案的较佳实施例而已，并不用以限制本方案，凡在本方案的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本方案的保护范围之内。

Claims (6)

  1. 一种中药组合物中八种成分的分离方法，该中药组合物由如下重量份的原料药制成：连翘200-300、麻黄60-100、大黄40-60、鱼腥草200-300、金银花200-300、板蓝根200-300、广藿香60-100、绵马贯众200-300、红景天60-100、薄荷脑5-9、苦杏仁60-100、甘草60-100和石膏200-300，其特征在于，所述分离方法包括以下步骤：
    （1）该中药组合物总浸膏，经AB-8大孔树脂吸附，依次用水、10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇洗脱，分别收集各部分洗脱液，浓缩后得到各部位浸膏；
    （2）取步骤（1）得到的50%乙醇洗脱部位浸膏，加入反相硅胶ODS-AQ-HG，待拌样自然晾干后，上样，利用反相ODS-AQ-HG开放柱分离，依次用甲醇-水体积比为20∶80、40∶60、60∶40、80∶20及100%甲醇进行洗脱，顺序得到Fr.A-Fr.E；
    （3）取步骤（2）得到的Fr.A样品，加入反相硅胶ODS-AQ-HG拌样，待拌样ODS自然晾干后，将拌样ODS加入到上样柱内，上中压制备液相进行分离，中压制备液相梯度分离，甲醇-水体积比为25∶75~60∶40，流速：25mL/min，以500mL等体积接收流份于锥形瓶中，减压浓缩，经薄层层析板检识合并流份并再次减压浓缩，得到Fr.A-1~Fr.A-7；
    （4）取步骤（3）得到的Fr.A-2样品与硅胶拌样，上硅胶柱，用二氯甲烷-甲醇体积比为8∶1等度分离，以50mL等体积接收流份，洗脱体积为800mL，薄层层析板检识合并流份得到Fr.A-1-1~Fr.A-1-4；
    （5）取步骤（4）得到的Fr.A-1-2样品用甲醇溶解，采用高效液相色谱法，流动相甲醇-水体积比为50∶50，流速：12mL/min，检测波长：210nm，进行初步分离，分别收集保留时间为6-8min，9-10min，12-13min的色谱峰，并减压回收溶剂，分别进行以下分离：
    6-8min色谱峰，经高效液相色谱法进一步纯化，流动相：乙腈-水体积比为25∶75，流速：12mL/min，检测波长210nm，色谱柱：YMC-Pack R&D ODS-A，250×20mm，S-10μm，在此条件下收集保留时间8-9min的色谱峰，减压回收溶剂后，得到化合物2：芦荟大黄素-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷；
    9-10min色谱峰，经高效液相色谱进一步纯化，流动相：甲醇-水体积比为45∶55，流速：12mL/min，检测波长210nm，色谱柱：YMC-Pack R&D ODS-A，250×20mm，S-10μm，在此条件下收集保留时间21-23min的色谱峰，减压回收溶剂后，得到化合物3：槲皮苷；
    10-12min色谱峰，经高效液相色谱进一步纯化，流动相：乙腈-水体积比为25∶75，流速：12mL/min，检测波长210nm，色谱柱：YMC-Pack R&D ODS-A，250×20mm，S-10μm，在此条件下收集保留时间9-10min的色谱峰，减压回收溶剂后，得到化合物4：罗汉松脂酚-4'-O-β-D-葡萄糖苷；
    （6）取步骤（4）得到的Fr.A-1-3样品用甲醇溶解，采用高效液相色谱法，流动相甲醇-水体积比为30∶70，流速：12mL/min，检测波长：210nm，进行初步分离，分别收集保留时间为10-11min，17-19min，21-24min的色谱峰，并减压回收溶剂，17-19min为化合物6：表断马钱子甙半缩醛内酯，21-24min为化合物7：断马钱子甙半缩醛内酯，10-11min色谱峰，经高效液相色谱进一步纯化，流动相：乙腈-水体积比为15∶85，流速：12mL/min，检测波长210nm，色谱柱：YMC-Pack R&D ODS-A，250×20mm，S-10μm，在此条件下收集保留时间14-16min的色谱峰，减压回收溶剂后，得到化合物5：芹糖甘草苷；
    （7）取步骤（3）得到的Fr.A-3样品用甲醇溶解，采用高效液相色谱法，流动相甲醇-水体积比为60∶40，流速：12mL/min，检测波长：210nm，进行初步分离，分别收集保留时间为14-15min，19-21min的色谱峰，并减压回收溶剂，19-21min的色谱峰收集液在二氯甲烷-甲醇溶液体积比为2∶1中析出白色沉淀，得到化合物8；14-15min色谱峰经高效液相色谱进一步纯化，流动相：乙腈-水体积比为30∶70，流速：12mL/min，检测波长210nm，色谱柱：YMC-Pack R&D ODS-A，250×20mm，S-10μm，在此条件下收集保留时间18-20min的色谱峰，减压回收溶剂后，得到化合物1：10-O-(p-hydroxycinnamoyl)-adoxosidic acid。
  2. 根据权利要求1所述的八种成分的分离方法，其特征在于，所述分离方法包括以下步骤：
    （1）该中药组合物总浸膏5kg，经AB-8大孔树脂吸附，依次用水150L、10%乙醇87.5L、30%乙醇225L、50%乙醇洗脱250L，浓缩后得到各部位浸膏；
    （2）取步骤（1）得到的50%乙醇洗脱部位浸膏200g，加入反相硅胶ODS-AQ-HG S-50μm 200g拌样，待拌样ODS自然晾干后，上样，利用反相ODS-AQ-HG S-50μm开放柱分离，样高比为1∶4，以减压方式依次用体积比为甲醇-水20∶80洗脱6L，40∶60洗脱7L，60∶40洗脱7L，80∶20洗脱5L及100%甲醇3L进行洗脱，顺序得到Fr.A-Fr.E；
    （3）取步骤（2）得到的Fr.A样品50.0g，加入反相硅胶ODS-AQ-HG S-50μm 50g拌样，待拌样ODS自然晾干后，将拌样ODS加入到上样柱内，上中压制备液相进行分离，分离柱填料为ODS-AQ-HG S-50μm，中压制备液相梯度分离，甲醇-水体积比为25∶75~60∶40，流速：25mL/min，以500mL等体积接收流份于锥形瓶中，减压浓缩，经薄层层析板检识合并流份并再次减压浓缩，得到Fr.A-1~Fr.A-7；
    （4）取步骤（3）得到的Fr.A-2样品3.2g与6.4g硅胶200~300目拌样，上硅胶柱，样高比1∶50，用二氯甲烷-甲醇体积比为8∶1等度分离，以50mL等体积接收流份，洗脱体积为800mL，薄层层析板检识合并流份得到Fr.A-1-1~Fr.A-1-4；
    （5）取步骤（4）得到的Fr.A-1-2样品用甲醇溶解，溶解液过0.45μm微孔滤膜，采用高效液相色谱法，流动相甲醇-水体积比为50∶50，流速：12mL/min，检测波长：210nm，进行初步分离，分别收集保留时间为6-8min，9-10min，12-13min的色谱峰，并减压回收溶剂，分别进行以下分离：
    6-8min色谱峰，经高效液相色谱法进一步纯化，流动相：乙腈-水体积比为25∶75，流速：12mL/min，检测波长210nm，色谱柱：YMC-Pack R&D ODS-A，250×20mm，S-10μm，在此条件下收集保留时间8-9min的色谱峰，减压回收溶剂后，得到化合物2：芦荟大黄素-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷；
    9-10min色谱峰，经高效液相色谱进一步纯化，流动相：甲醇-水体积比为45∶55，流速：12mL/min，检测波长210nm，色谱柱：YMC-Pack R&D ODS-A，250×20mm，S-10μm，在此条件下收集保留时间21-23min的色谱峰，减压回收溶剂后，得到化合物3：槲皮苷；
    10-12min色谱峰，经高效液相色谱进一步纯化，流动相：乙腈-水体积比为25∶75，流速：12mL/min，检测波长210nm，色谱柱：YMC-Pack R&D ODS-A，250×20mm，S-10μm，在此条件下收集保留时间9-10min的色谱峰，减压回收溶剂后，得到化合物4：罗汉松脂酚-4'-O-β-D-葡萄糖苷；
    （6）取步骤（4）得到的Fr.A-1-3样品用甲醇溶解，溶解液过0.45μm微孔滤膜，采用高效液相色谱法，流动相甲醇-水体积比为30∶70，流速：12mL/min，检测波长：210nm，进行初步分离，分别收集保留时间为10-11min，17-19min，21-24min的色谱峰，并减压回收溶剂，17-19min为化合物6：表断马钱子甙半缩醛内酯，21-24min为化合物7：断马钱子甙半缩醛内酯，10-11min色谱峰，经高效液相色谱进一步纯化，流动相：乙腈-水体积比为15∶85，流速：12mL/min，检测波长210nm，色谱柱：YMC-Pack R&D ODS-A，250×20mm，S-10μm，在此条件下收集保留时间14-16min的色谱峰，减压回收溶剂后，得到化合物5：芹糖甘草苷；
    （7）取步骤（3）得到的Fr.A-3样品用甲醇溶解，溶解液过0.45μm微孔滤膜，采用高效液相色谱法，流动相为甲醇-水体积比60∶40，流速：12mL/min，检测波长：210nm，进行初步分离，分别收集保留时间为14-15min，19-21min的色谱峰，并减压回收溶剂，19-21min的色谱峰收集液在二氯甲烷-甲醇溶液体积比为2∶1中析出白色沉淀，得到化合物8；14-15min色谱峰经高效液相色谱进一步纯化，流动相：乙腈-水体积比为30∶70，流速：12mL/min，检测波长210nm，色谱柱：YMC-Pack R&D ODS-A，250×20mm，S-10μm，在此条件下收集保留时间18-20min的色谱峰，减压回收溶剂后，得到化合物1：10-O-(p-hydroxycinnamoyl)-adoxosidic acid。
  3. 根据权利要求1-2任一项所述的八种成分的分离方法，其特征在于，所述中药组合物是由如下重量份的原料药制成：
    连翘200、金银花300、板蓝根200、大黄40、广藿香60、绵马贯众300、红景天100、薄荷脑9、麻黄60、苦杏仁100、鱼腥草200、甘草100和石膏200。
  4. 根据权利要求1-2任一项所述的八种成分的分离方法，其特征在于，所述中药组合物是由如下重量份的原料药制成：
    连翘300、金银花200、板蓝根300、大黄60、广藿香100、绵马贯众200、红景天60、薄荷脑5、麻黄100、苦杏仁60、鱼腥草300、甘草60和石膏300。
  5. 根据权利要求1-2任一项所述的八种成分的分离方法，其特征在于，所述中药组合物是由如下重量份的原料药制成：
    连翘278、金银花294、板蓝根285、大黄55、广藿香95、绵马贯众290、红景天87、薄荷脑8.5、麻黄88、苦杏仁80、鱼腥草284、甘草95和石膏277。
  6. 根据权利要求1-2任一项所述的八种成分的分离方法，其特征在于，所述中药组合物总浸膏由以下步骤制成：
    （1）按照原料药重量比例称取中药材，净选，酌情碎断；
    （2）广藿香碎断，加10倍量水提取挥发油，提油时间8小时，收集挥发油，备用；提取液过滤后，残渣弃去，滤液备用；
    （3）连翘、麻黄、鱼腥草、大黄，用12倍量70%的乙醇提取3次，每次2.5小时，提取液合并过滤，回收乙醇，滤液备用；
    （4）金银花、石膏、板蓝根、绵马贯众、甘草、红景天，加12倍量水煎煮至沸，加入苦杏仁，煎煮2次，每次1小时，提取液合并过滤，所得滤液与步骤（2）广藿香提油后的滤液合并，浓缩成在60℃时测定相对密度为1.10-1.15的清膏，加入乙醇，调节至醇浓度为70%，冷藏放置，过滤，回收乙醇至无醇味，得清膏备用；
    （5）将步骤（4）所得清膏与步骤（3）所得醇提液合并，浓缩至在60℃时测定相对密度为1.15-1.20的清膏，干燥，得总浸膏，备用。。
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