KR102404533B1 - 전통 한약 조성물에서 18가지 성분을 분리하는 방법 - Google Patents

전통 한약 조성물에서 18가지 성분을 분리하는 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102404533B1
KR102404533B1 KR1020207009024A KR20207009024A KR102404533B1 KR 102404533 B1 KR102404533 B1 KR 102404533B1 KR 1020207009024 A KR1020207009024 A KR 1020207009024A KR 20207009024 A KR20207009024 A KR 20207009024A KR 102404533 B1 KR102404533 B1 KR 102404533B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
weight
parts
methanol
ods
solvent
Prior art date
Application number
KR1020207009024A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20200040886A (ko
Inventor
수오 센
추앙펭 장
단 비
펭 웨이
윤보 선
Original Assignee
쉬지아주앙 일링 파머서티컬 컴퍼니 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 쉬지아주앙 일링 파머서티컬 컴퍼니 리미티드 filed Critical 쉬지아주앙 일링 파머서티컬 컴퍼니 리미티드
Publication of KR20200040886A publication Critical patent/KR20200040886A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102404533B1 publication Critical patent/KR102404533B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C07H1/06—Separation; Purification
    • C07H1/08—Separation; Purification from natural products
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/265—Adsorption chromatography
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/63—Oleaceae (Olive family), e.g. jasmine, lilac or ash tree
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C45/00—Preparation of compounds having >C = O groups bound only to carbon or hydrogen atoms; Preparation of chelates of such compounds
    • C07C45/56—Preparation of compounds having >C = O groups bound only to carbon or hydrogen atoms; Preparation of chelates of such compounds from heterocyclic compounds
    • C07C45/562—Preparation of compounds having >C = O groups bound only to carbon or hydrogen atoms; Preparation of chelates of such compounds from heterocyclic compounds with nitrogen as the only hetero atom
    • C07C45/565—Preparation of compounds having >C = O groups bound only to carbon or hydrogen atoms; Preparation of chelates of such compounds from heterocyclic compounds with nitrogen as the only hetero atom by reaction with hexamethylene-tetramine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C45/00—Preparation of compounds having >C = O groups bound only to carbon or hydrogen atoms; Preparation of chelates of such compounds
    • C07C45/78—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C45/00—Preparation of compounds having >C = O groups bound only to carbon or hydrogen atoms; Preparation of chelates of such compounds
    • C07C45/78—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives
    • C07C45/79—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives by solid-liquid treatment; by chemisorption
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C67/00—Preparation of carboxylic acid esters
    • C07C67/48—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C67/00—Preparation of carboxylic acid esters
    • C07C67/48—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives
    • C07C67/56—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives by solid-liquid treatment; by chemisorption
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C69/00—Esters of carboxylic acids; Esters of carbonic or haloformic acids
    • C07C69/66—Esters of carboxylic acids having esterified carboxylic groups bound to acyclic carbon atoms and having any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, acyloxy, groups, groups, or in the acid moiety
    • C07C69/73—Esters of carboxylic acids having esterified carboxylic groups bound to acyclic carbon atoms and having any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, acyloxy, groups, groups, or in the acid moiety of unsaturated acids
    • C07C69/738—Esters of keto-carboxylic acids or aldehydo-carboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/18—Acyclic radicals, substituted by carbocyclic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/26—Acyclic or carbocyclic radicals, substituted by hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H17/00—Compounds containing heterocyclic radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H17/04—Heterocyclic radicals containing only oxygen as ring hetero atoms
    • C07H17/06—Benzopyran radicals
    • C07H17/065—Benzo[b]pyrans
    • C07H17/07—Benzo[b]pyran-4-ones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/50—Methods involving additional extraction steps
    • A61K2236/55—Liquid-liquid separation; Phase separation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C2601/00—Systems containing only non-condensed rings
    • C07C2601/12—Systems containing only non-condensed rings with a six-membered ring
    • C07C2601/16—Systems containing only non-condensed rings with a six-membered ring the ring being unsaturated

Abstract

본 발명은 전통 한약의 품질 분석 및 제어 분야에 속하며, 전통 한약 조성물내 18가지 성분들을 분리하는 방법을 제공하는 것으로서, 이 방법은: (1) 전통 한약 조성물을 전체 추출물로 만들고, 물, 10% 에탄올 및 30% 에탄올을 이 순서대로 사용하여 용출시켜 수지 분리하고, 및 30% 에탄올 용출물을 수집하여 30% 에탄올 추출물을 수득하고; (2) 상기 30% 에탄올 추출물을 역상 실리카겔 ODS-AQ-HG에 첨가하고 중압 분리 컬럼에서 분리함으로써 각각 번호를 붙인 다수의 용출 건조 페이스트를 수득하고; (3) 각각 번호를 붙인 용출 건조 페이스트를 용매인 30% 메탄올에 용해하고, 이 용액을 0.45 μm의 미세다공성 막에 통과시키고, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 1차 분리하고 상이한 체류 시간에 크로마토그래피 피크를 수집하고, 또한 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 정제하는 것을 포함하며, 최종적으로 18가지의 성분을 수득한다. 본 발명의 분리방법은 약학 조성물의 화학 성분들에 대한 심도있는 연구를 가능하게 한다.

Description

전통 한약 조성물에서 18가지 성분을 분리하는 방법
본 발명은 전통 한약의 품질 분석 및 제어 분야에 속하며, 구체적으로 전통 한약 조성물에서 18가지 성분을 분리하는 방법에 관한 것이다.
전통 한약 화합물은 전통적인 한약의 주요 형태이다. 수천년에 걸친 임상적 사용후, 상기 화합물은 단일 약제보다 더 강력한 치료 효과를 얻을 수 있으며, 이는 화합물 조성물의 과학적 의미를 충분이 입증했다.
연교(Fructus Forsythiae), 금은화(Flos Lonicerae) 및 마황(Herba Ephedrae)과 같은 13가지 전통 한약재로 구성되는 약학 조성물은 디스템퍼(distemper) 제거 및 해독, 폐의 환기 및 해열 등의 효과를 갖는다. 임상 연구에서 상기 약학 조성물은 인플루엔자 및 급성 상부기도 감염의 치료에 확실하고 두드러진 효과가 있음이 확인되었다.
이 화합물의 약리학적 작용 메카니즘 및 화합물로 조제한 약물의 적합성에 관하여 함축된 과학적 의미를 명확히 하기 위해, 물질의 기초에 대한 체계적인 연구를 수행할 필요가 있다.
본 발명의 목적은 전통 한약 조성물의 화학 성분들의 다양성 및 화학 구조의 복잡성 때문에 고극성 성분들을 신속하게 분리하기 어려운 문제를 해결하기 위한 것으로서, 전통 한약 조성물로부터 18가지의 성분을 분리하는 방법을 제공한는 것이다. 복합 역상 고속분리 기술은 전통 한약 조성물의 고극성 성분들을 단기간에 효율적으로 분리하여 일련의 대표적인 화합물을 수득할 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 전통 한약 조성물에서 18가지 성분들을 분리하는 방법을 제공하며, 여기서 전통 한약 조성물은 다음과 같은 중량부의 생약재들: 200 내지 300 중량부의 연교(Fructus Forsythiae), 60 내지 100 중량부의 마황(Herba Ephedrae), 40 내지 60 중량부의 대황(Radix et Rhizoma Rhei), 200 내지 300 중량부의 어성초(Herba Houttuyniae), 200 내지 300 중량부의 금은화(Flos Lonicerae), 200 내지 300 중량부의 대청(Radix Isatidis), 60 내지 100 중량부의 광곽향(Herba Pogostemonis), 200 내지 300 중량부의 관중(Rhizoma Dryopteris Crassirhizomae), 60 내지 100 중량부의 홍경천(Raidx Rhodiolae), 5 내지 9 중량부의 멘톨, 60 내지 100 중량부의 행인(Semen Armeniacae Amarum), 60 내지 100 중량부의 감초(Radix Glycyrrhizae), 200 내지 300 중량부의 석고(Gypsum Fibrosum)로 제조되며, 상기 분리방법은 다음과 같은 단계들을 포함한다:
(1) 전통 한약 조성물의 전체 추출물을 AB-8 거대다공성 수지로 분리한 뒤 물, 10% 에탄올 및 30% 에탄올을 이 순서대로 사용하여 용출시키고, 그 후 30% 에탄올 용출물을 수집하고, 용매를 회수하여 30% 에탄올 추출물을 수득하는 단계;
(2) 단계 (1)에서 수득된 30% 에탄올 추출물을 역상 실리카겔 ODS-AQ-HG, S-50μm에 로딩(loading)하고 혼합한다; 혼합된 ODS가 자연적으로 건조된 후, 이 혼합 ODS를 시료 컬럼에 가한 다음, 분리를 위하여 중간 압력('중압') 조제 액상 크로마토그래피를 사용한다. 분리 컬럼 충전물(packing)은 ODS-AQ-HG, S-50μm이다; 연속적으로 10% 메탄올을 사용하여 5개의 분획물을 용출 순서대로, 즉 10%-1, 10%-2, 10%-3, 10%-4 및 10%-5의 번호 순으로 수득하고; 또한 20% 메탄올을 용출에 사용하여 6개의 분획물을 용출 순서대로, 즉 20%-1, 20%-2, 20%-3, 20%-4, 20%-5 및 20%-6의 번호 순으로 수득하고; 용출물을 수집하고 용매를 회수하고, 각각 10%-1, 10%-2, 10%-3, 10%-4 및 10%-5로 번호를 붙인 용출 건조 추출물 및 20%-1, 20%-2, 20%-3, 20%-4, 20%-5 및 20%-6으로 번호를 붙인 용출 건조 추출물을 수득하는 단계;
(3) 상기 단계 (2)에서 수득한 10%-1 용출 건조 추출물을 30% 메탄올에 용해시킨 용액을 0.45μm의 미세다공성 막을 통해 여과 및 고성능 액체 크로마그래피에 의해 예비 분리하며; 여기서 이동상은 메탄올-물 22:78이며 유속은 1 ml/분이고 검출 파장은 210 nm이며; 체류 시간 3 내지 9분, 9 내지 11분, 19 내지 22분, 22 내지 26분, 26 내지 30분, 37 내지 41분 및 44 내지 48분에서 각각 크로마토그래피 피크(최대값)를 수집하고, 용매를 감압 하에 회수하며, 다음과 같은 분리 공정을 각각 수행한다;
3 내지 9분의 크로마토그래피 피크: 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제하고, 이동상: 메탄올-물 5:95, 유속: 10 ml/분, 검출 파장: 210 nm, 크로마토그래피 컬럼: YMC-Pack R & D ODS-A, 250 Х 20 mm, S-10 μm; 이들 조건 하에서 체류 시간이 25 내지 27분인 크로마토그래피 피크를 수집하고, 용매를 감압 하에 회수하여 화합물 14: 코르노사이드(Cornoside)를 수득한다;
9 내지 11분의 크로마토그래피 피크: 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제하고, 이동상: 메탄올-물 12:88, 유속: 10 ml/분, 검출 파장: 210 nm, 크로마토그래피 컬럼: YMC-Pack R & D ODS-A, 250 Х 20 mm, S-10 μm; 이들 조건 하에서 체류 시간이 32 내지 35분인 크로마토그래피 피크를 수집하고, 용매를 감압 하에 회수하여 화합물 10: 페루지노사이드(Ferruginoside) B를 수득한다;
19 내지 22분의 크로마토그래피 피크: 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제하고, 이동상: 메탄올-물 18:82, 유속: 10 ml/분, 검출 파장: 210 nm, 크로마토그래피 컬럼: YMC-Pack R & D ODS-A, 250 Х 20 mm, S-10 μm; 이들 조건 하에서 체류 시간이 31 내지 35분인 크로마토그래피 피크를 수집하고, 용매를 감압 하에 회수하여 화합물 9: 포르시토사이드(Forsythoside) E를 수득한다.
22 내지 26분의 크로마토그래피 피크: 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제하고, 이동상: 메탄올-물 16:84, 유속: 10 ml/분, 검출 파장: 210 nm, 크로마토그래피 컬럼: YMC-Pack R & D ODS-A, 250 Х 20 mm, S-10 μm; 이들 조건 하에서 체류 시간이 32 내지 37분인 크로마토그래피 피크를 수집하고, 용매를 감압 하에 회수하여 화합물 18: 3,4-디히드록시벤즈알데히드를 수득한다;
26 내지 30분의 크로마토그래피 피크: 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제하고, 이동상: 메탄올-물 18:82, 유속: 10 ml/분, 검출 파장: 210 nm, 크로마토그래피 컬럼: YMC-Pack R & D ODS-A, 250 Х 20 mm, S-10 μm; 이들 조건 하에서 체류 시간이 38 내지 42분인 크로마토그래피 피크를 수집하고, 용매를 감압 하에 회수하여 화합물 11: D-아미그달린(Amygdalin) 및 화합물 12: L-아미그달린의 혼합물을 수득한다;
37 내지 41분의 크로마토그래피 피크: 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제하고, 이동상: 메탄올-물 18:82, 유속: 10 ml/분, 검출 파장: 210 nm, 크로마토그래피 컬럼: YMC-Pack R & D ODS-A, 250 Х 20 mm, S-10 μm; 이들 조건 하에서 체류 시간이 52 내지 56분인 크로마토그래피 피크를 수집하고, 용매를 감압 하에 회수하여 화합물 13: 삼부니그린(Sambunigrin)을 수득한다;
44 내지 48분의 크로마토그래피 피크: 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제하고, 이동상: 메탄올-물 22:78, 유속: 10 ml/분, 검출 파장: 210 nm, 크로마토그래피 컬럼: YMC-Pack R & D ODS-A, 250 Х 20 mm, S-10 μm; 이들 조건 하에서 체류 시간이 41 내지 44분인 크로마토그래피 피크를 수집하고, 용매를 감압 하에 회수하여 화합물 15: 4-히드록시-4-메틸렌카르보메톡시-시클로헥사-2,5-디에논을 수득한다;
(4) 단계 (2)에서 수득한 20%-2 용출 건조 추출물을 30% 메탄올에 용해 및 0.45μm 미세다공성 막을 통해 여과하고, 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 예비 분리하며; 여기서 이동상은 메탄올-물 22:78이며 유속은 10 ml/분이고 검출 파장은 210 nm이며; 크로마토그래피 컬럼은 YMC-Pack R & D ODS-A, 250 x 20 mm, S-10 μm 이고; 체류 시간 14 내지 17분, 17 내지 19분, 22 내지 24분, 29 내지 34분, 및 35 내지 40분에서 각각 크로마토그래피 피크를 수집하고, 용매를 감압 하에 회수하며, 다음과 같은 분리 공정을 각각 수행한다;
14 내지 17분의 크로마토그래피 피크: 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제하고, 이동상: 아세토니트릴-물 15:85, 유속: 10 ml/분, 검출 파장: 210 nm, 크로마토그래피 컬럼: YMC-Pack R & D ODS-A, 250 Х 20 mm, S-10 μm; 이들 조건 하에서 체류 시간이 38 내지 40분 및 45 내지 47분인 크로마토그래피 피크들을 수집하고, 45 내지 47분의 크로마토그래피 피크일 때의 용매를 감압 하에 회수하여 화합물 7: 리안키아옥신간(Lianqiaoxingan) C를 수득한다; 38 내지 40분의 크로마토그래피 피크일 때의 용매를 감압 하에 회수 및 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 정제하고, 이동상: 아세토니트릴-물 13:87, 유속: 10 ml/분, 검출 파장: 210 nm, 크로마토그래피 컬럼: 250 x 20 mm, S-10 μm; 이들 조건 하에서 체류 시간이 52 내지 56분인 크로마토그래피 피크를 수집하고, 용매를 감압 하에 회수하여 화합물 6: 페루지노사이드(Ferruginoside) A를 수득한다;
17 내지 19분의 크로마토그래피 피크: 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제하고, 이동상: 아세토니트릴-물 15:85, 유속: 10 ml/분, 검출 파장: 210 nm, 크로마토그래피 컬럼: YMC-Pack R & D ODS-A, 250 Х 20 mm, S-10 μm; 이들 조건 하에서 체류 시간이 28 내지 30분 및 37 내지 44분인 크로마토그래피 피크들을 수집하고 용매를 감압 하에 회수하여 화합물 16: 리리오덴드린(Liriodendrin) 및 화합물 2: 포르시토사이드(Forsythoside) I를 각각 수득한다;
22 내지 24분의 크로마토그래피 피크: 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제하고, 이동상: 아세토니트릴-물 17:83, 유속: 10 ml/분, 검출 파장: 210 nm, 크로마토그래피 컬럼: YMC-Pack R & D ODS-A, 250 Х 20 mm, S-10 μm; 이들 조건 하에서 체류 시간이 22 내지 25분인 크로마토그래피 피크를 수집하고, 용매를 감압 하에 회수하여 화합물 8: 칼세올라리오사이드(Calceolarioside) C를 수득한다;
29 내지 34분 크로마토그래피 피크: 용매를 감압 하에 회수한 후, 대기(standing) 과정 동안 용매가 증발되고 남은 백색 고체가 침전되며, 이를 5000 rpm 에서 원심분리하여 화합물 17: 글리시리진(glycyrrhizin)-7-O-β-D-글루코시드를 수득하며; 상청액을 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제하고, 이동상: 아세토니트릴-물 16:84, 유속: 10 ml/분, 검출 파장: 210 nm, 크로마토그래피 컬럼: YMC-Pack R & D ODS-A, 250 Х 20 mm, S-10 μm; 이들 조건 하에서 체류 시간이 40 내지 45분인 크로마토그래피 피크를 수집하고, 용매를 감압 하에 회수하여 화합물 3: 포르시토사이드(Forsythoside) H를 수득한다;
35 내지 40분의 크로마토그래피 피크: 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제하고, 이동상: 아세토니트릴-물 16:84, 유속: 10 ml/분, 검출 파장: 210 nm, 크로마토그래피 컬럼: YMC-Pack R & D ODS-A, 250 Х 20 mm, S-10 μm; 이들 조건 하에서 체류 시간이 34 내지 45분인 크로마토그래피 피크를 수집하고, 용매를 감압 하에 회수하여 화합물 1: 포르시토사이드(Forsythoside) A를 수득한다;
(5) 단계 (2)에서 수득한 20%-4 분획물과 20%-5 분획물을 혼합하고, 30% 메탄올에 용해 및 0.45μm 미세다공성 막을 통해 여과하고, 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 예비 분리하며; 여기서 이동상은 아세토니트릴-물 15:85 이며 유속은 15 ml/분이고 검출 파장은 210 nm이며; 크로마토그래피 컬럼은 YMC-Pack R & D ODS-A, 250 x 20 mm, S-10 μm 이고; 체류 시간 15 내지 17분 및 35 내지 40분에서 크로마토그래피 피크를 수집하고, 용매를 감압 하에 회수한다; 여기서,
15 내지 17분의 크로마토그래피 피크: 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제하고, 이동상: 아세토니트릴-물 15:85, 유속: 12 ml/분, 검출 파장: 210 nm, 크로마토그래피 컬럼: YMC-Pack R & D ODS-A, 250 Х 20 mm, S-10 μm; 이들 조건 하에서 체류 시간이 15 내지 16분인 크로마토그래피 피크를 수집하고, 용매를 감압 하에 회수하여 화합물 5: 이소루그란도사이드(Isolugrandoside)를 수득한다;
35 내지 40분의 크로마토그래피 피크: 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제한다. 이동상: 메탄올-물 25:75, 유속: 12 ml/분, 검출 파장: 210 nm, 크로마토그래피 컬럼: YMC-Pack R & D ODS-A, 250 Х 20 mm, S-10 μm; 이들 조건 하에서 체류 시간이 26 내지 29분인 크로마토그래피 피크를 수집하고, 용매를 감압 하에 회수하여 화합물 4: 루그란도사이드(Lugrandoside)를 수득한다.
본 발명에서, (1) 각 분리 단계에서 사용한 메탄올과 에탄올의 농도는 모두 부피 농도(vol%)이고; (2) 고성능 액체 크로마토그래피에 의한 예비 분리를 위해 이동상으로 사용한 메탄올-물의 용량비, 및 아세토니트릴-물의 용량비는 모두 부피비이며; (3) 고성능 액체 크로마토그래피에 의한 예비 분리후 수집한 각 체류 시간의 크로마토그래피 피크는 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제 및 분리하며, 이는 용매 회수 후 체류 시간에서의 각 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물로부터 수득한 시료를 추가 정제하는 것을 의미한다.
본 발명에서 제공하는 18가지 성분을 분리하는 방법에 따르면, 바람직하게는 단계 (1)에서 용출수, 10% 에탄올 및 30% 에탄올의 양은 한약 조성물에서 얻은 전체 추출물 1g에 대해 각각 40 ml의 용출수, 17.6 ml의 10% 에탄올 및 45 ml의 30% 에탄올이다.
본 발명에서 제공하는 18가지 성분을 분리하는 방법에 따르면, 바람직하게는 단계 (2)에서 역상 실리카겔 ODS-AQ-HG의 양은 단계 (1)에서 수득한 30% 에탄올 추출물 1g에 대해 8g의 역상 실리카겔 ODS-AQ-HG이며, 이 중에서 3g은 단계 (1)에서 수득한 1g의 30% 에탄올 추출물과 혼합하고, 나머지 5g은 중압 분리 컬럼의 충전용으로 사용한다.
바람직하게는, 단계 (2)에서 연속적으로 10% 메탄올을 사용하고; 5개의 분획물을 용출 순서대로 수득하고, 각 분획물에 대한 용출제(elute)의 양은 단계 (1)에서 수득한 1g의 30% 에탄올 추출물에 대해 66.7 ml의 10% 메탄올이고; 20% 메탄올을 용출에 사용하여 6개의 분획물을 용출 순서대로 수득하며, 이때 각 분획물에 대한 용출액의 양은 단계 (1)에서 수득한 1g의 30% 에탄올 추출물에 대해 44.4 내지 66.7 ml의 20% 메탄올이다.
본 발명에서 제공한 18가지 성분을 분리하는 방법에 따르면, 전통 한약 조성물은 생약들(crude drugs)을 다음의 중량부로 이용하여 제조한다:
200 중량부의 연교(Fructus Forsythiae), 300 중량부의 금은화(Flos Lonicerae), 200 중량부의 대청(Radix Isatidis), 40 중량부의 대황(Radix et Rhizoma Rhei), 60 중량부의 광곽향(Herba Pogostemonis), 300 중량부의 관중(Rhizoma Dryopteris Crassirhizomae), 100 중량부의 홍경천(Raidx Rhodiolae), 9 중량부의 멘톨, 60 중량부의 마황(Herba Ephedrae), 100 중량부의 행인(Semen Armeniacae Amarum), 200 중량부의 어성초(Herba Houttuyniae), 100 중량부의 감초(Radix Glycyrrhizae), 200 중량부의 석고(Gypsum Fibrosum).
바람직하게는, 전통 한약 조성물은 생약들을 다음의 중량부로 사용하여 제조한다:
300 중량부의 연교, 200 중량부의 금은화, 300 중량부의 대청, 60 중량부의 대황, 100 중량부의 광곽향, 200 중량부의 관중, 60 중량부의 홍경천, 5 중량부의 멘톨, 100 중량부의 마황, 60 중량부의 행인, 300 중량부의 어성초, 60 중량부의 감초 및 300 중량부의 석고.
바람직하게는, 전통 한약 조성물은 생약들을 다음의 중량부로 이용하여 제조한다:
278 중량부의 연교, 294 중량부의 금은화, 285 중량부의 대청, 55 중량부의 대황, 95 중량부의 광곽향, 290 중량부의 관중, 87 중량부의 홍경천, 8.5 중량부의 멘톨, 88 중량부의 마황, 80 중량부의 행인, 284 중량부의 어성초, 95 중량부의 감초 및 277 중량부의 석고.
본 발명에서 제공한 18가지 성분을 분리하는 방법에 따르면, 바람직하게는, 전통 한약 조성물의 전체 추출물은 다음의 단계에 따라 제조된다:
(1) 생약들을 중량비 기준으로 계량하고, 깨끗한 것을 취하여 분쇄하는 단계;
(2) 광곽향을 분쇄하고 10배의 물을 첨가해 휘발성 유분을 추출하며, 휘발성 유분의 추출 시간은 8시간이고, 휘발성 유분을 수집하고, 사용을 위해 보존하고; 추출물을 여과한 후 잔류물을 버리고 여과액만을 사용을 위해 보존하는 단계;
(3) 연교, 마황, 어성초 및 대황은 12배의 70% 에탄올로 각 회당 2.5시간 동안 3회, 추출하고; 추출물을 혼합 및 여과하고, 에탄올을 회수하며, 여과액은 사용을 위해 보존하는 단계;
(4) 금은화, 석고, 대청, 관중, 감초 및 홍경천은 12배의 물과 함께 비등처리하고, 행인을 여기에 첨가한 다음 각 회당 1시간씩 2회, 비등처리하고; 추출물을 혼합 및 여과하고, 수득된 여과액을 상기 단계 (2)에서 광곽향을 추출한 뒤 얻은 여과액과 여과액과 배합하고, 60℃에서 1.10 내지 1.15의 상대밀도를 갖는 투명한(clear) 추출물로 응축시키고, 다음에, 에탄올을 첨가하여 알코올 농도를 70%로 조정 후, 냉각(예컨대 4℃) 및 여과하고, 알코올 맛이 나지 않을 때까지 에탄올을 회수하여 투명한 추출물을 수득하고 추후 사용을 위해 보존하는 단계;
(5) 단계 (4)에서 수득한 투명한 추출물을 단계 (3)에서 수득한 알코올 추출물과 배합하고, 60℃에서 1.15 내지 1.20의 상대밀도를 갖는 투명한 추출물로 응축시키고; 이를 건조하여 전체 추출물을 수득하고 추후 사용을 위해 보존하는 단계.
약학 조성물은 연교, 금은화 및 마황 같은 13가지 전통 한약재를 이용하여 제조하며, 디스템퍼 제거 및 해독, 폐의 환기 및 해열 등의 효과를 갖고, 인플루엔자의 치료에 사용된다. 인플루엔자와 급성 상부기도 감염에 확실하고 두드러진 효과를 갖는다. 이 화합물의 약리학적 작용 메카니즘 및 화합물로 조제한 약물들의 상용성 조절에 관하여 함축된 과학적 의미를 명확히 하기 위해, 물질의 기초에 대한 체계적 연구를 수행할 필요가 있다.
상술한 내용 측면에서, 본 발명에 따른 약학 조성물의 화학적 성분들을 심도있게 연구했으며 (중국특허 CN1483463 A의 세부사항 참조), 18가지 성분들은 그의 전체 추출물에 대한 거대다공성 흡착 수지 컬럼으로부터 30% 에탄올 부분에서 분리 및 동정하였다. 18가지 성분들은 각각 포르시토사이드 A (1), 포르시토사이드 I (2), 포르시토사이드 H (3), 루그란도사이드 (4), 이소루그란도사이드 (5), 페루지노사이드 A (6), 리안키아옥신간 C (7), 칼세올라리오사이드 C (8), 포르시토사이드 E (9), 페루지노사이드 B (10), D-아미그달린 (11), L-아미그달린 (12), 삼부니그린 (13), 코르노사이드 (14), 4-히드록시-4-메틸렌카르보메톡시-시클로헥사-2,5-디에논 (15), 리리오덴드린 (16), 글리시리진-7-O-β-D-글루코사이드 (17), 3,4-디히드록시벤즈알데히드 (18)이다.
이들 중 화합물 (2) 내지 화합물 (8), 화합물 (10), 화합물 (13) 내지 화합물 (18)은 본 발명에 개시된 전체 추출물로부터 처음 분리된 것이고; 화합물 (4) 내지 화합물 (6), 화합물 (10), 화합물 (15) 및 화합물 (16)을 화합물 약물내의 각 단일 약물로부터 분리하는 것은 지금까지 보고된 바가 없고, 또한 DMSD-d6에 용해된 화합물 (8)에 대한 핵 자기(nuclear magneti) 데이터는 여기서 처음으로 제시한다.
본 발명의 기술적 해결방안에 따른 유리한 효과는 다음과 같다:
(1) 거대다공성 수지 흡착 컬럼 크로마토그래피, 역상 저압 컬럼 크로마토그래피 및 고압 조제 액체 크로마토그래피 기술을 조합하여 전통 한약 조성물에 함유된 큰 극성의 성분들을 효과적으로 분리할 수 있다;
(2) 본 발명의 기술적 해결방안은 전통 한약 조성물의 화학적 성분들에 대한 분리효율이 우수하며, 화합물 약물내 대표적인 단량체 화합물을 단시간에 수득할 수 있다;
(3) 단일 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 이용하는 선행 기술과 비교하여, 본 발명의 기술적 해결방안은 유기시약을 덜 소모하고 또한 분리과정에서 환경오염이 적다.
본 발명의 기술적 특징 및 내용을 더 상세히 이해하기 위해, 본 발명의 바람직한 구현예를 하기에서 보다 상세히 기술한다. 이들 본 발명의 바람직한 구현예를 실시예에서 설명하나, 본 발명은 다양한 형태로 수행될 수 있으며, 여기서 설명하는 구현예에 한정되지 않는다는 것을 이해해야 한다.
본 발명의 일 구현예에서, 전통 한약 조성물에서 18가지 성분을 분리하는 방법을 제공하며, 여기서 전통 한약 조성물은 다음 중량부의 생약들: 200 내지 300 중량부의 연교, 60 내지 100 중량부의 마황, 40 내지 60 중량부의 대황, 200 내지 300 중량부의 어성초, 200 내지 300 중량부의 금은화, 200 내지 300 중량부의 대청, 60 내지 100 중량부의 광곽향, 200 내지 300 중량부의 관중, 60 내지 100 중량부의 홍경천, 5 내지 9 중량부의 멘톨, 60 내지 100 중량부의 행인, 60 내지 100 중량부의 감초 및 200 내지 300 중량부의 석고를 이용하여 제조하고, 또한 이 분리방법은 다음의 단계들을 포함한다:
(1) 전통 한약 조성물을 전체 추출물로 조제한 다음에, 이 전체 추출물을 AB-8 거대다공성 수지로 분리한 뒤 물, 1 부피% 에탄올과 30 부피% 에탄올을 이 순서대로 사용하여 용출시키고, 이어서 30 부피%의 에탄올 용출물을 수집하고 용매를 회수하여 30% 에탄올 추출물을 수득한다;
(2) 상기 단계(1)에서 수득한 30% 에탄올 추출물을 역상 실리카겔 ODS-AQ-HG, S-50μm에 로딩하고, 혼합에 의해서 혼합 ODS를 수득하고; 혼합 ODS가 자연적으로 건조된 후, 이 혼합 ODS를 (예를 들어, 길이가 8 cm이고 직경이 4 cm인) 시료 컬럼에 충전하고, 분리를 위하여 중압 조제 액상 크로마토그래피를 사용하며, (예를 들어, 길이가 40cm이고 직경이 5cm인) 중압 분리 컬럼에 ODS-AQ-HG, S-50μm를 충전한다; 먼저, 10 부피%의 메탄올을 이용하여 5개의 분획물을 용출 순서대로, 즉 10%-1, 10%-2, 10%-3, 10%-4 및 10%-5의 번호 순으로 수득한다; 다음에, 20 부피%의 메탄올을 이용하여 6개의 분획물을 용출 순서대로, 즉 20%-1, 20%-2, 20%-3, 20%-4, 20%-5, 및 20%-6의 번호 순으로 수득한다; 10% 메탄올 용출물 및 20% 메탄올 용출물을 각각 수집하고 용매는 회수하며, 상기와 같이 10%-1, 10%-2, 10%-3, 10%-4 및 10%-5로 번호를 붙인 용출 건조 추출물, 및 20%-1, 20%-2, 20%-3, 20%-4, 20%-5 및 20%-6으로 번호를 붙인 용출 건조 추출물을 각각 수득한다;
(3) 상기 단계 (2)에서 수득한 10%-1 용출 건조 추출물을 30 부피% 메탄올에 용해하고, 이 용액을 0.45 μm 미세다공성 막을 통해 여과 및 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 예비 분리한다; 이동상은 메탄올-물 22:78이며 유속은 1 ml/분이고 검출 파장은 210 nm이며; 체류 시간 3 내지 9분, 9 내지 11분, 19 내지 22분, 22 내지 26분, 26 내지 30분, 37 내지 41분 및 44 내지 48분에서 각각 크로마토그래피 피크를 수집하고, 용매를 감압 하에 회수하며, 다음과 같은 분리 공정을 각각 수행한다(여기서의 분리 대상은 용매 회수 후 체류 시간에 각 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물로부터 얻은 시료이며; 각 피크는 3 내지 9분의 크로마토그래피 피크, 9 내지 11분의 크로마토그래피 피크, 19 내지 22분의 크로마토그래피 피크, 22 내지 26분의 크로마토그래피 피크, 26 내지 30분의 크로마토그래피 피크, 37 내지 41분의 크로마토그래피 피크, 및 44 내지 48분의 크로마토그래피 피크가 각각 하기와 같이 해당 번호의 분획물에 상응하여 차례대로 출현한다: 3 내지 9의 분획물, 9 내지 11의 분획물, 19 내지 22의 분획물, 22 내지 26의 분획물, 26 내지 30의 분획물, 37 내지 41의 분획물, 44 내지 48의 분획물);
용매 회수 후 3 내지 9분의 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물로부터 얻은 시료를 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제한다. 이동상: 메탄올-물 5:95, 유속: 10 ml/분, 검출 파장: 210 nm, 크로마토그래피 컬럼: YMC-Pack R & D ODS-A, 250 Х 20 mm, S-10 μm; 이들 조건 하에서 체류 시간이 25 내지 27분인 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물을 수집하고, 용매를 감압 하에 회수하여 화합물 14: 코르노사이드를 수득하고;
용매 회수 후 9 내지 11분의 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물로부터 얻은 시료를 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제한다. 이동상: 메탄올-물 12:88, 유속: 10 ml/분, 검출 파장: 210 nm, 크로마토그래피 컬럼: YMC-Pack R & D ODS-A, 250 Х 20 mm, S-10 μm; 이들 조건 하에서 체류 시간이 32 내지 35분인 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물을 수집하고, 용매를 감압 하에 회수하여 화합물 10: 페루지노사이드 B를 수득하고;
용매 회수 후 19 내지 22분의 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물로부터 얻은 시료를 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제한다. 이동상: 메탄올-물 18:82, 유속: 10 ml/분, 검출 파장: 210 nm, 크로마토그래피 컬럼: YMC-Pack R & D ODS-A, 250 Х 20 mm, S-10 μm; 이들 조건 하에서 체류 시간이 31 내지 35분인 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물을 수집하고, 용매를 감압 하에 회수하여 화합물 9: 포르시토사이드 E를 수득하고;
용매 회수 후 22 내지 26분의 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물로부터 얻은 시료를 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제한다. 이동상: 메탄올-물 16:84, 유속: 10 ml/분, 검출 파장: 210 nm, 크로마토그래피 컬럼: YMC-Pack R & D ODS-A, 250 Х 20 mm, S-10 μm; 이들 조건 하에서 체류 시간이 32 내지 37분인 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물을 수집하고, 용매를 감압 하에 회수하여 화합물 18: 3,4-디히드록시벤즈알데히드를 수득하고;
용매 회수 후 26 내지 30분의 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물로부터 얻은 시료를 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제한다. 이동상: 메탄올-물 18:82, 유속: 10 ml/분, 검출 파장: 210 nm, 크로마토그래피 컬럼: YMC-Pack R & D ODS-A, 250 Х 20 mm, S-10 μm; 이들 조건 하에서 체류 시간이 38 내지 42분인 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물을 수집하고, 용매를 감압 하에 회수하여 화합물 11: D-아미그달린 및 화합물 12: L-아미그달린의 혼합물을 수득하고;
용매 회수 후 37 내지 41분의 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물로부터 얻은 시료를 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제한다. 이동상: 메탄올-물 18:82, 유속: 10 ml/분, 검출 파장: 210 nm, 크로마토그래피 컬럼: YMC-Pack R & D ODS-A, 250 Х 20 mm, S-10 μm; 이들 조건 하에서 체류 시간이 52 내지 56분인 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물을 수집하고, 용매를 감압 하에 회수하여 화합물 13: 삼부니그린을 수득하고;
용매 회수 후 44 내지 48분의 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물로부터 얻은 시료를 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제한다. 이동상: 메탄올-물 22:78, 유속: 10 ml/분, 검출 파장: 210 nm, 크로마토그래피 컬럼: YMC-Pack R & D ODS-A, 250 Х 20 mm, S-10 μm; 이들 조건 하에서 체류 시간이 41 내지 44분인 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물을 수집하고, 용매를 감압 하에 회수하여 화합물 15: 4-히드록시-4-메틸렌카르보메톡시-시클로헥사-2,5-디에논을 수득한다;
(4) 상기 단계 (2)에서 수득한 20%-2 용출 건조 추출물을 30 부피% 메탄올에 용해하고, 이 용액을 0.45 μm 미세다공성 막을 통해 여과 및 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 예비 분리한다; 이동상은 메탄올-물 22:78이며 유속은 10 ml/분이고 검출 파장은 210 nm이며, 크로마토그래피 컬럼: YMC-Pack R & D ODS-A, 250 Х 20 mm, S-10μm 이고; 체류 시간 14 내지 17분, 17 내지 19분, 22 내지 24분, 29 내지 34분 및 35 내지 40분에서 각각 크로마토그래피 피크를 수집하고, 용매를 감압 하에 회수하며, 다음과 같은 분리 공정을 각각 수행한다(여기서의 분리 대상은 용매 회수 후 체류 시간에서 각 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물로부터 얻은 시료이며; 각 피크는 14 내지 17분의 크로마토그래피 피크, 17 내지 19분의 크로마토그래피 피크, 22 내지 24분의 크로마토그래피 피크, 29 내지 34분의 크로마토그래피 피크, 및 35 내지 40분의 크로마토그래피 피크가 각각 하기와 같이 해당 번호의 분획물에 상응하여 차례대로 출현한다: 14 내지 17의 분획물, 17 내지 19의 분획물, 22 내지 24의 분획물, 29 내지 34의 분획물, 및 35 내지 40의 분획물);
용매 회수 후 14 내지 17분의 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물로부터 얻은 시료를 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제하고, 이동상: 아세토니트릴-물 15:85, 유속: 10 ml/분, 검출 파장: 210 nm, 크로마토그래피 컬럼: YMC-Pack R & D ODS-A, 250 Х 20 mm, S-10 μm; 이들 조건 하에서 체류 시간이 38 내지 40분 및 45 내지 47분인 크로마토그래피 피크들에 상응하는 분획물을 수집하고, 상기 45 내지 47분의 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물 내의 용매를 감압 하에 회수하여 화합물 7: 리안키아옥신간 C를 수득하고; 또한 38분 내지 40분의 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물 내의 용매를 감압 하에 회수하고, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 정제한다. 이동상: 아세토니트릴-물 13:87, 유속: 10 ml/분, 검출 파장: 210 nm, 크로마토그래피 컬럼: YMC-Pack R & D ODS-A, 250 Х 20 mm, S-10 μm; 이들 조건 하에서 체류 시간이 52 내지 56분인 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물을 수집하고, 용매를 감압 하에 회수하여 화합물 6: 페루지노사이드 A를 수득하고;
용매 회수 후 17 내지 19분의 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물로부터 얻은 시료를 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제한다. 이동상:아세토니트릴-물 15:85, 유속: 10 ml/분, 검출 파장: 210 nm, 크로마토그래피 컬럼: YMC-Pack R & D ODS-A, 250 Х 20 mm, S-10 μm; 이들 조건 하에서 체류 시간이 28 내지 30분 및 37 내지 44분인 크로마토그래피 피크들에 상응하는 분획물을 수집하고, 용매를 감압 하에 회수하여 화합물 16: 리리오덴드린 및 화합물 2: 포르시토사이드 I을 각각 수득하고;
용매 회수 후 22 내지 24분의 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물로부터 얻은 시료를 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제한다. 이동상:아세토니트릴-물 17:83, 유속: 10 ml/분, 검출 파장: 210 nm, 크로마토그래피 컬럼: YMC-Pack R & D ODS-A, 250 Х 20 mm, S-10 μm; 이들 조건 하에서 체류 시간이 22 내지 25분인 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물을 수집하고, 용매를 감압 하에 회수하여 화합물 8: 칼세올라리오사이드 C를 수득하고;
감압 하에서 용매 회수 후 29 내지 34분의 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물로부터 얻은 시료에서, 대기 과정 동안 용매가 증발되고 남은 백색 고체가 침전되며, 이를 5000 rpm에서 원심분리하여 화합물 17: 글리시리진-7-O-β-D-글루코시드를 수득하며; 상청액을 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제한다. 이동상: 아세토니트릴-물 16:84, 유속: 10 ml/분, 검출 파장: 210 nm, 크로마토그래피 컬럼: YMC-Pack R & D ODS-A, 250 Х 20 mm, S-10 μm; 이들 조건 하에서 체류 시간이 40 내지 45분인 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물을 수집하고, 용매를 감압 하에 회수하여 화합물 3: 포르시토사이드 H를 수득하고;
용매 회수 후 35 내지 40분의 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물로부터 얻은 시료를 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제한다. 이동상: 아세토니트릴-물 16:84, 유속: 10 ml/분, 검출 파장: 210 nm, 크로마토그래피 컬럼: YMC-Pack R & D ODS-A, 250 Х 20 mm, S-10 μm; 이들 조건 하에서 체류 시간이 34 내지 45분인 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물을 수집하고, 용매를 감압 하에 회수하여 화합물 1: 포르시토사이드 A를 수득한다;
(5) 상기 단계 (2)에서 수득한 20%-4 및 20%-5 분획물을 혼합하고, 30 부피% 메탄올에 용해하고, 이 용액을 0.45 μm 미세다공성 막을 통해 여과 및 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 예비 분리한다; 이동상: 아세토니트릴-물 15:85, 유속: 15 ml/분, 검출 파장: 210 nm, 크로마토그래피 컬럼: YMC-Pack R & D ODS-A, 250 Х 20 mm, S-10 μm; 체류 시간 15 내지 17분 및 35 내지 40분인 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물을 수집하고 용매를 감압 하에 회수하며; 여기서,
용매 회수 후 15 내지 17분의 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물로부터 얻은 시료를 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제한다. 이동상: 아세토니트릴-물 15:85, 유속: 12 ml/분, 검출 파장: 210 nm, 크로마토그래피 컬럼: YMC-Pack R & D ODS-A, 250 Х 20 mm, S-10 μm; 이들 조건 하에서 체류 시간 15 내지 16분인 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물을 수집하고, 용매를 감압 하에 회수하여 화합물 5: 이소루그란도사이드를 수득하고;
용매 회수 후 35 내지 40분의 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물로부터 얻은 시료를 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제한다. 이동상: 메탄올-물 25:75, 유속: 12 ml/분, 검출 파장: 210 nm, 크로마토그래피 컬럼: YMC-Pack R & D ODS-A, 250 Х 20 mm, S-10 μm; 이들 조건 하에서 체류 시간 26 내지 29분인 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물을 수집하고, 용매를 감압 하에 회수하여 화합물 4: 루그란도사이드를 수득한다.
바람직한 구현예에 따르면, 단계 (1)에서 용출제로 사용하는 물, 10% 에탄올, 및 30% 에탄올의 양은 한약 조성물의 전체 추출물 1g에 대해 40 ml의 물, 한약 조성물의 전체 추출물 1g에 대해 17.6 ml의 10% 에탄올, 및 한약 조성물의 전체 추출물 1g에 대해 45 ml의 30% 에탄올이다.
바람직한 구현예에 따르면, 단계 (2)에서 역상 실리카겔 ODS-AQ-HG의 양은 단계(1)에서 수득한 30% 에탄올 추출물 1g에 대해 8g의 역상 실리카겔 ODS-AQ-HG이고, 이중에서 3g의 역상 실리카겔 ODS-AQ-HG는 단계 (1)에서 수득한 1g의 30% 에탄올 추출물과 혼합하며 나머지 5g은 중압 분리 컬럼의 충전용으로 사용한다.
바람직하게는, 단계 (2)에서 연속적으로 10% 메탄올과 20% 메탄올을 용출에 사용하며, 10% 메탄올로 용출시 5개의 분획물을 용출 순서대로 수득하고, 각 분획물에 있어서 용출제의 양은 단계 (1)에서 수득한 30% 에탄올 추출물 1g에 대해 66.7 ml의 10% 메탄올이고; 20% 메탄올로 용출시 6개의 분획물은 용출 순서대로 수득하며, 각 분획물에 있어서 용출제의 양은 단계 (1)에서 수득한 30% 에탄올 추출물 1g에 대하여 44.4 내지 66.7 ml의 20% 메탄올이다.
일부 구현예에서, 전통 한약 조성물은 다음 중량부의 생약들을 이용하여 제조한다:
200 중량부의 연교, 300 중량부의 금은화, 200 중량부의 대청, 40 중량부의 대황, 60 중량부의 광곽향, 300 중량부의 관중, 100 중량부의 홍경천, 9 중량부의 멘톨, 60 중량부의 마황, 100 중량부의 행인, 200 중량부의 어성초, 100 중량부의 감초, 200 중량부의 석고.
일부 구현예에서, 전통 한약 조성물은 다음 중량부의 생약들을 이용하여 제조한다:
300 중량부의 연교, 200 중량부의 금은화, 300 중량부의 대청, 60 중량부의 대황, 100 중량부의 광곽향, 200 중량부의 관중, 60 중량부의 홍경천, 5 중량부의 멘톨, 100 중량부의 마황, 60 중량부의 행인, 300 중량부의 어성초, 60 중량부의 감초, 300 중량부의 석고.
일부 구현예에서, 전통 한약 조성물은 다음 중량부의 생약들을 이용하여 제조한다:
278 중량부의 연교, 294 중량부의 금은화, 285 중량부의 대청, 55 중량부의 대황, 95 중량부의 광곽향, 290 중량부의 관중, 87 중량부의 홍경천, 8.5 중량부의 멘톨, 88 중량부의 마황, 80 중량부의 행인, 284 중량부의 어성초, 95 중량부의 감초, 277 중량부의 석고.
상술한 바와 같이 전통 한약 조성물의 전체 추출물은 다음의 단계에 따라 제조한다:
(1) 생약들을 중량비 기준으로 계량하고, 깨끗한 것을 취하여 분쇄하는 단계;
(2) 광곽향을 분쇄하고 10배의 물을 첨가해 휘발성 유분을 추출하며, 휘발성 유분의 추출 시간은 8시간, 휘발성 유분을 수집하고 사용을 위해 보존하고; 추출물을 여과한 후 잔류물을 버리고 여과액은 사용을 위해 보존는 단계;
(3) 연교, 마황, 어성초 및 대황은 12배의 70 중량% 에탄올로 각 회당 2.5시간 동안, 3회 추출하고, 이때 70% 에탄올의 중량은 상기 연교, 마황, 어성초 및 대황의 중량의 12배이고; 이어서 추출물을 혼합 및 여과하고 에탄올을 회수하고, 여과액은 사용을 위해 보존하는 단계;
(4) 금은화, 석고, 대청, 관중, 감초 및 홍경천은 물과 함께 비등처리하고, 상기 물의 중량은 상기 금은화, 석고, 대청, 관중, 감초 및 홍경천의 총 중량의 12배이고; 이어서 행인을 첨가한 다음 각 회당 1시간씩 2회 비등처리하고; 추출물을 혼합 및 여과하고, 수득된 여과액을 상기 단계 (2)에서 광곽향을 추출한 뒤 얻은 여과액과 배합하고, 60℃에서 1.10 내지 1.15의 상대밀도를 갖는 투명한 추출물로 응축시키고, 이어서 에탄올을 첨가하여 알코올 농도를 70%로 조정한 후 냉각(예컨대 4℃) 및 여과하고, 알코올 맛이 나지 않을 때까지 에탄올을 회수하여 투명한 추출물을 수득하고 사용을 위해 보존하는 단계;
(5) 단계 (4)에서 수득한 투명한 추출물을 단계 (3)에서 수득한 알코올 추출물과 배합하고, 60℃에서 1.15 내지 1.20의 상대밀도를 갖는 투명 추출물로 응축시키고; 이를 건조하여 전체 추출물을 수득하고 사용을 위해 보존하는 단계.
실시예
실시예 1
전통 한약 조성물을 다음 중량부의 생약들로 제조된다: 20kg의 연교, 30kg의 금은화, 20kg의 대청, 4kg의 대황, 6kg의 광곽향, 30kg의 관중, 10kg의 홍경천, 0.9kg의 멘톨, 6kg의 마황, 10kg의 행인, 20kg의 어성초, 10kg의 감초, 20kg의 석고; 여기서 전통 한약 조성물의 전체 추출물은 다음의 단계에 따라 제조한다:
(1) 생약들을 중량비 기준으로 계량하고, 깨끗한 것을 취하여 분쇄하는 단계;
(2) 광곽향을 분쇄하고 광곽향 중량 대비 10배의 물을 첨가해 휘발성 유분을 추출하며, 휘발성 유분의 추출 시간은 8시간이고, 휘발성 유분을 수집 및 사용을 위해 보존하고; 추출물을 여과한 후 잔류물을 버리고 여과액은 사용을 위해 보존하는 단계;
(3) 연교, 마황, 어성초 및 대황은 12배의 70 중량% 에탄올로 각 회당 2.5시간 동안 총 3회에 걸쳐 추출하고, 이때 70 중량% 에탄올의 중량은 상기 연교, 마황, 어성초 및 대황의 총 중량의 12배이며; 이어서 추출물을 혼합 및 여과하고 에탄올을 회수하며, 여과액은 사용을 위해 보존하는 단계;
(4) 금은화, 석고, 대청, 관중, 감초 및 홍경천은 물과 함께 비등처리하고, 이때 물의 중량은 상기 금은화, 석고, 대청, 관중, 감초 및 홍경천의 총 중량의 12배이며; 이어서 행인을 여기에 첨가한 다음 각 회당 1시간씩 2회 비등처리하고; 추출물을 혼합 및 여과하고, 수득된 여과액을 상기 단계 (2)에서 광곽향을 추출한 뒤 얻은 여과액과 조합하고, 60℃에서 1.15의 상대밀도를 갖는 투명한 추출물로 응축시키고, 이어서 에탄올을 첨가하여 알코올 농도를 70 중량%로 조정 후, 4℃에서 냉각 및 여과하고, 알코올 맛이 나지 않을 때까지 에탄올을 회수하여 투명한 추출물을 수득하고 사용을 위해 보존하는 단계;
(5) 단계 (4)에서 수득한 투명한 추출물을 단계 (3)에서 수득한 알코올 추출물과 조합한 다음, 60℃에서 1.20의 상대밀도를 갖는 투명한 추출물로 응축시키고; 이를 건조하여 전통 한약 조성물의 전체 추출물(제품번호: B1509001)을 수득하고 사용을 위해 보존한다.
분리방법의 단계들은 다음과 같았다:
1. 기구 및 재료
브루커 AVIIIHD 600 NMR 분광계 (브루커, 스위스);
아질런트 NMR VNMRS 600 핵자기공명 분광계 (아질런트, 미국);
시납트 G2-S 질량 분광계 (워터스, 미국);
콤비 플래시 Rf 중압-저압 조제 액체 크로마토그래프 (Teledvne ISCO, 미국);
워터스 2489-1525 조제 액체 크로마토그래프 (워터스, 미국);
NU3000 조제 액체 크로마토그래프 (지앙수 한방기술 주식회사);
밀리-Q 퓨어 워터 정수기 (US 밀리포어 컴퍼니);
AL204 분석 전자 저울 (메틀러 톨레도, 미국);
AB135-S 분석 전자 저울 (메틀러 톨레도, 미국);
TGL-16G 원심분리기 (상하이 안팅 사이언티픽 인스트루먼트 팩토리);
YMC ODS-A-HG 50μm 보존상 실리카겔 (YMC 일본);
YMC-Pack R & D ODS-A (길이 250 Х 직경 20 mm, 충전재 입자 크기 S-10 μm, 일본 YMC 코퍼레이션);
AB-8 거대다공성 수지(티안진 엔바이로먼탈 프로텍션 머터리얼 테크놀로지 주식회사);
본 발명의 전통 한약 조성물의 전체 추출물 (쉬지아쭈앙 일링 파마슈티칼 주식회사, 제품번호: B1509001);
크로마토그래피 퓨어 아세토니트릴 및 메탄올 (상하이 아다마스 리아전트 컴퍼니);
별도의 언급이 없는 한, 본 발명에서 사용한 화학 시약은 분석 시약이다 (베이징 케미칼 플랜트).
별도의 언급이 없는 한, 본 실시예에서 사용한 고성능 액체 크로마토그래에서 상기 다양한 액체 크로마토그래프를 선택하는 것은 본 발명의 기술적 해결방안에서 채택한 크로마토그래피 분석의 조건과 관계가 있다.
추출 및 분리
(1) 본 발명의 약학 조성물의 전체 추출물은 5 kg (제품번호: B1509001)이었고, 이를 AB-8 거대다공성 수지에 흡착한 후, 200 리터의 물, 88 리터의 10% 에탄올, 225 리터의 30% 에탄올, 250리터의 50% 에탄올, 150 리터의 70% 에탄올 및 162 리터의 95% 에탄올로 연속해서 용출시키고, 이어서 용매를 회수하여 상응하는 추출물을 수득하며, 이중 625.0g은 30% 에탄올 추출물이었다.
(2) 90.0g의 30% 에탄올 추출물을 취하고 270.0g의 역상 실리카겔 YMC ODS-AQ-HG (S-50μm)을 첨가해 혼합하고; 혼합된 ODS를 자연적으로 건조시킨 뒤, 이 혼합 ODS를 시료 컬럼에 로딩(적하)하고, 콤비 플래시 Rf 중압-저압 조제액 크로마토그래프를 이용하여 분리하고 (분리 컬럼 크기: 49 Х 460mm, 충전(packing): 450g ODS-AQ-HG (S-50μm)), 그리고 30리터의 10% 메탄올, 32리터의 20% 메탄올, 24리터의 30% 메탄올, 22리터의 35% 메탄올, 18리터의 40% 메탄올, 18리터의 45% 메탄올, 12리터의 50% 메탄올, 10리터의 70% 메탄올 및 6리터의 무수 메탄올을 각각 용출를 위해 사용하고; 각 용출부에서 용매를 감압 하에 회수하고; 5개의 분획물 (각 분획물의 용매량은 6리터임)을 10% 메탄올 용출부에서 용출 순서대로 수득했다: 4.5g 용출 건조 추출물 (번호: 10%-1), 4.0g 용출 건조 추출물 (번호: 10%-2), 3.5g 용출 건조 추출물 (번호: 10%-3), 2.0g 용출 건조 추출물 (번호: 10%-4) 및 0.9g 용출 건조 추출물 (번호: 10%-5); 또한 6개의 분획물 (각 분획물의 용매량은 6 리터임)을 20% 메탄올 용출부에서 용출 순서대로 수득했다: 2.4g 용출 건조 추출물 (번호: 20%-1), 8.6g 용출 건조 추출물 (번호: 20%-2), 3.8g 용출 건조 추출물 (번호: 20%-3), 3.1g 용출 건조 추출물 (번호: 20%-4), 4.0g 용출 건조 추출물 (번호: 20%-5) 및1.7g 용출 건조 추출물 (번호: 20%-6).
(3) 분획물 번호 10%-1에 해당하는 2.5g의 용출 건조 추출물을 취해 30% 메탄올에 용해하고, 이 용액을 0.45 μm 미세다공성 여과막을 통해 여과시킨 다음에, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 예비 분리했다 (이동상: 메탄올-물, 메탄올 대 물의 부피비는 22:78이며, 유속은 10 ml/분, 검출 파장은 210 nm, 및 크로마토그래피 컬럼은 YMC-Pack R & D ODS-A (250 Х 20 mm, S-10 μm)이었다); 체류 시간이 3 내지 9분, 9 내지 11분, 19 내지 22분, 22 내지 26분, 26 내지 30분, 37 내지 41분, 및 44 내지 48분인 크로마토그래피 피크들에 상응하는 분획물들을 각각 수집하고, 용매를 감압 하에 회수했다: 상기 분획물을 고효율 액체 크로마토그래피에 의해 정제하여, 다수의 단량체 화합물을 수득했다; 구체적인 분리조건은 다음과 같았다:
화합물 14의 분리: 용매 회수 후 3 내지 9분의 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물로부터 얻은 시료를 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제했다(이동상: 메탄올-물, 메탄올 대 물의 부피비는 5:95이며, 유속은 10 ml/분, 검출 파장은 210 nm, 및 크로마토그래피 컬럼은 YMC-Pack R & D ODS-A (250 Х 20 mm, S-10 μm)이었다); 이들 조건 하에서 체류 시간이 25 내지 27분인 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물을 수집하고, 용매를 감압 하에 회수하여 화합물 14 (22 mg)를 수득했다.
화합물 10의 분리: 용매 회수 후 9 내지 11분의 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물로부터 얻은 시료를 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제했다 (이동상: 메탄올-물, 메탄올 대 물의 부피비는 12:88이며, 유속은 10 ml/분, 검출 파장은 210 nm, 및 크로마토그래피 컬럼은 YMC-Pack R & D ODS-A (250 Х 20 mm, S-10 μm)이었다); 이들 조건 하에서 체류 시간이 32 내지 35분인 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물을 수집하고, 용매를 감압 하에 회수하여 화합물 10 (15 mg)을 수득했다.
화합물 9의 분리: 용매 회수 후 19 내지 22분의 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물로부터 얻은 시료를 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제했다(이동상: 메탄올-물, 메탄올 대 물의 부피비는 18:82이며, 유속은 10 ml/분, 검출 파장은 210 nm, 및 크로마토그래피 컬럼은 YMC-Pack R & D ODS-A (250 Х 20 mm, S-10 μm)이었다); 이들 조건 하에서 체류 시간이 31 내지 35분인 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물을 수집하고, 용매를 감압 하에 회수하여 화합물 9 (79 mg)를 수득했다.
화합물 18의 분리: 용매 회수 후 22 내지 26분의 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물로부터 얻은 시료를 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제했다 (이동상: 메탄올-물, 메탄올 대 물의 부피비는 16:84이며, 유속은 10 ml/분, 검출 파장은 210 nm, 및 크로마토그래피 컬럼은 YMC-Pack R & D ODS-A (250 Х 20 mm, S-10 μm)이었다); 이들 조건 하에서 체류 시간이 32 내지 37분인 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물을 수집하고, 용매를 감압 하에 회수하여 화합물 18 (8 mg)을 수득했다.
화합물 11 및 화합물 12의 분리: 용매 회수 후 26 내지 30분의 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물로부터 얻은 시료를 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제했다 (이동상: 메탄올-물, 메탄올 대 물의 부피비는 18:82이며, 유속은 10 ml/분, 검출 파장은 210 nm, 및 크로마토그래피 컬럼은 YMC-Pack R & D ODS-A (250 Х 20 mm, S-10 μm)이었다); 이들 조건 하에서 체류 시간이 38 내지 42분인 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물을 수집하고, 용매를 감압 하에 회수하여 화합물 11 및 12의 혼합물 (159 mg)을 수득했다.
화합물 13의 분리: 용매 회수 후 37 내지 41분의 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물로부터 얻은 시료를 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제했다 (이동상: 메탄올-물, 메탄올 대 물의 부피비는 18:82이며, 유속은 10 ml/분, 검출 파장은 210 nm, 및 크로마토그래피 컬럼은 YMC-Pack R & D ODS-A (250 Х 20 mm, S-10 μm)이었다); 이들 조건 하에서 체류 시간이 52 내지 56분인 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물을 수집하고, 용매를 감압 하에 회수하여 화합물 13 (8 mg)을 수득했다.
화합물 15의 분리: 용매 회수 후 44 내지 48분의 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물로부터 얻은 시료를 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제했다 (이동상: 메탄올-물, 메탄올 대 물의 부피비는 22:78이며, 유속은 10 ml/분, 검출 파장은 210 nm, 및 크로마토그래피 컬럼은 YMC-Pack R & D ODS-A (250 Х 20 mm, S-10 μm)이었다); 이들 조건 하에서 체류 시간이 41 내지 44분인 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물을 수집하고, 용매를 감압 하에 회수하여 화합물 15 (10 mg)를 수득했다.
(4) 분획물 번호 20%-2에 해당하는 2.9g의 용출 건조 추출물을 취해 30% 메탄올에 용해하고, 이 용액을 0.45 μm 미세다공성 여과막을 통해 여과시킨 다음에, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 예비 분리했다(이동상: 메탄올-물, 메탄올 대 물의 부피비는 22:78이며, 유속은 10 ml/분 , 검출 파장은 210 nm, 및 크로마토그래피 컬럼은 YMC-Pack R & D ODS-A (250 Х 20 mm, S-10 μm)이었다); 체류 시간이 14 내지 17분, 17 내지 19분, 22 내지 24분, 29 내지 34분 및 35 내지 40분인 크로마토그래피 피크들에 상응하는 분획물들을 각각 수집하고, 용매를 감압 하에 회수했다: 상기 분획물을 고효율 액체 크로마토그래피에 의해 정제하여, 다수의 단량체 화합물을 수득했다; 구체적인 분리조건은 다음과 같았다:
화합물 6 및 7의 분리: 용매 회수 후 14 내지 17분의 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물로부터 얻은 시료를 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제했다 (이동상: 아세토니트릴-물, 아세토니트릴 대 물의 부피비는 15:85이며, 유속은 10 ml/분, 검출 파장은 210 nm, 및 크로마토그래피 컬럼은 YMC-Pack R & D ODS-A (250 Х 20 mm, S-10 μm)이었다); 이들 조건 하에서 체류 시간이 38 내지 40분 및 45 내지 47분인 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물을 수집하고, 용매를 감압 하에 회수하며, 38 내지 40분의 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물과 더불어 화합물 7 (4 mg)을 수득했다; 38 내지 40분의 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물을 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 정제했다 (이동상: 아세토니트릴-물, 아세토니트릴 대 물의 부피비는 13:87이며, 유속은 10 ml/분, 검출 파장은 210 nm, 및 크로마토그래피 컬럼은 YMC-Pack R & D ODS-A (250 Х 20 mm, S-10 μm)이었다); 이들 조건 하에서 52 내지 56분의 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물을 수집하고, 용매를 감압 하에 회수하여 화합물 6 (4 mg)을 수득했다.
화합물 16 및 화합물 2의 분리: 용매 회수 후 17 내지 19분의 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물로부터 얻은 시료를 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제했다(이동상: 아세토니트릴-물, 아세토니트릴 대 물의 부피비는 15:85이며, 유속은 10 ml/분, 검출 파장은 210 nm, 및 크로마토그래피 컬럼은 YMC-Pack R & D ODS-A (250 Х 20 mm, S-10 μm)이었다); 이들 조건 하에서 체류 시간이 28 내지 30분 및 37 내지 44분인 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물을 수집하고, 용매를 감압 하에 회수하여 화합물 16 (3 mg) 및 화합물 2 (117 mg)를 수득했다.
화합물 8의 분리: 용매 회수 후 22 내지 24분의 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물로부터 얻은 시료를 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제했다(이동상: 아세토니트릴-물, 아세토니트릴 대 물의 부피비는 17:83이며, 유속은 10 ml/분, 검출 파장은 210 nm, 및 크로마토그래피 컬럼은 YMC-Pack R & D ODS-A (250 Х 20 mm, S-10 μm)이었다); 이들 조건 하에서 체류 시간이 22 내지 25분인 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물을 수집하고, 용매를 감압 하에 회수하여 화합물 8 (36 mg)을 수득했다.
화합물 17 및 화합물 3의 분리: 감압 하에 용매를 회수한 후 29 내지 34분의 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물로부터 얻은 시료를 실온에서 방치하고; 용매 증발 후, 백색 고체를 침전 및 5000 rpm으로 원심분리하여 화합물 17 (10 mg)을 수득했다. 상청액을 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제했다(이동상: 아세토니트릴-물, 아세토니트릴 대 물의 부피비는 16:84이며, 유속은 10 ml/분, 검출 파장은 210 nm, 및 크로마토그래피 컬럼은 YMC-Pack R & D ODS-A (250 Х 20 mm, S-10 μm)이었다); 이들 조건 하에서 체류 시간이 40 내지 45분인 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물을 수집하고, 용매를 감압 하에 회수하여 화합물 3 (19 mg)을 수득했다.
화합물 1의 분리: 용매 회수 후 35 내지 40분의 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물로부터 얻은 시료를 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제했다(이동상: 아세토니트릴-물, 아세토니트릴 대 물의 부피비는 16:84이며, 유속은 10 ml/분, 검출 파장은 210 nm, 및 크로마토그래피 컬럼은 YMC-Pack R & D ODS-A (250 Х 20 mm, S-10 μm)이었다); 이들 조건 하에서 체류 시간이 34 내지 45분인 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물을 수집하고, 용매를 감압 하에 회수하여 화합물 1 (161 mg)을 수득했다.
(5) 화합물 4 및 화합물 5의 분리: 분획물 번호 20%-4 및 20%-5에 각각 해당하는 분획물을 조합하고, 2.0g의 혼합 분획물을 30% 메탄올에 용해하고, 이 용액을 0.45 μm 미세다공성 여과막을 통해 여과시킨 다음에, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 예비 분리했다 (이동상: 아세토니트릴-물, 아세토니트릴 대 물의 부피비는 15:85이며, 유속은 15 ml/분, 검출 파장은 210 nm, 및 크로마토그래피 컬럼은 YMC-Pack R & D ODS-A (250 Х 20 mm, S-10 μm)이었다); 이들 조건 하에서 체류 시간이 13 내지 15분 및 15 내지 17분인 크로마토그래피 피크들에 상응하는 분획물들을 각각 수집하고, 용매를 감압 하에 회수했다.
용매 회수 후 35 내지 40분의 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물로부터 얻은 시료를 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제했다(이동상: 메탄올-물, 메탄올 대 물의 부피비는 25:75이며, 유속은 12 ml/분, 검출 파장은 210 nm, 및 크로마토그래피 컬럼은 YMC-Pack R & D ODS-A (250 Х 20 mm, S-10 μm)이었다); 이들 조건 하에서 체류 시간이 26 내지 29분인 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물을 수집하고, 용매를 감압 하에 회수하여 화합물 4 (32 mg)를 수득했다.
용매 회수 후 15 내지 17분의 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물로부터 얻은 시료를 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제했다 (이동상: 아세토니트릴-물, 아세토니트릴 대 물의 부피비는 15:85이며, 유속은 12 ml/분, 검출 파장은 210 nm, 및 크로마토그래피 컬럼은 YMC-Pack R & D ODS-A (250 Х 20 mm, S-10 μm)이었다); 이들 조건 하에서 체류 시간이 15 내지 16분인 크로마토그래피 피크에 상응하는 분획물을 수집하고, 용매를 감압 하에 회수하여 화합물 5 (4 mg)를 수득했다.
구조의 동정
화합물 1: 담녹색 유리상 고체 (메탄올), ESI-MS m/z: 623.2 [M-H]-, 및 상기 화합물의 분자식은 NMR 데이터에 근거하여 C29H36O15 로 결정되었다.
1H-NMR (DMSO-d 6 , 600 MHz)δ H : 6.63 (1H, d, J = 1.9 Hz, H-2), 6.64 (1H, d, J = 8.1 Hz, H-5), 6.50 (1H, dd, J = 8.1, 1.9 Hz, H-6), 2.69 (2H, m, H-7), 4.31 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-1'), 4.51 (1H, br s, H-1''), 1.05 (1H, d, J = 6.2 Hz, H-6'''), 7.05 (1H, br s, H-2'''), 6.77 (1H, d, J = 8.1 Hz, H-5'''), 7.00 (1H, br s, H-6'''), 7.50 (1H, d, J = 15.8 Hz, H-7'''), 6.26 ( 1H, d, J = 15.8 Hz, H-8''').
13C-NMR (DMSO-d 6 , 150 MHz)δ C : 129.3 (C-1), 115.6 (C-2), 145.1 (C-3), 143.6 (C-4), 116.4 (C-5), 119.6 (C-6), 35.2 (C-7), 70.4 (C-8), 103.0 (C-1'), 73.1 (C-2'), 73.6 (C-3'), 71.0 (C-4'), 74.0 (C-5'), 66.2 (C-6'), 100.6 (C-1''), 70.7 (C-2''), 70.4 (C-3''), 71.9 (C-4''), 68.5 (C-5''), 17.9 (C-6''), 125.6 (C-1'''), 115.0 (C-2'''), 145.7 (C-3'''), 148.6 (C-4'''), 115.9 (C-5'''), 121.5 (C-6'''), 145.7 (C-7'''), 113.9 (C-8'''), 166.0 (C-9''').
상기 수소 스펙트럼 특성 및 탄소 스펙트럼 데이터는 기본적으로 참고 문헌 [1]에 보고된 것과 일치하며, 화합물은 포르시토사이드 A로 확인되었다.
화합물 2: 담녹색 유리상 고체 (메탄올), ESI-MS m/z: 623.2 [M-H]-, 및 상기 화합물의 분자식은 NMR 데이터에 근거하여 C29H36O15 로 결정되었다.
1H-NMR (DMSO-d 6 , 600 MHz)δ H : 6.62 (1H, d, J = 1.8 Hz, H-2), 6.64 (1H, d, J = 8.1 Hz, H-5), 6.50 (1H, dd, J = 8.1, 1.8 Hz, H-6), 2.69 (2H, m, H-7), 4.35 (1H, d, J = 7.7 Hz, H-1'), 4.60 (1H, br s, H-1''), 1.14 (1H, d, J = 6.2 Hz, H-6''), 7.05 (1H, br s, H-2'''), 6.77 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5'''), 7.01 (1H, dd, J = 8.0, 1.7 Hz, H-6'''), 7.47 (1H, d, J = 15.8 Hz, H-7'''), 6.28 ( 1H, d, J = 15.8 Hz, H-8''').
13C-NMR (DMSO-d 6 , 150 MHz)δ C : 129.3 (C-1), 115.6 (C-2), 144.9 (C-3), 143.6 (C-4), 116.4 (C-5), 119.7 (C-6), 35.2 (C-7), 70.3 (C-8), 102.8 (C-1'), 71.5 (C-2'), 77.6 (C-3'), 68.3 (C-4'), 75.2 (C-5'), 66.6 (C-6'), 100.8 (C-1''), 70.8 (C-2''), 70.6 (C-3''), 72.0 (C-4''), 68.5 (C-5''), 18.1 (C-6''), 125.8 (C-1'''), 114.9 (C-2'''), 145.7 (C-3'''), 148.4 (C-4'''), 115.9 (C-5'''), 121.3 (C-6'''), 145.1 (C-7'''), 114.8 (C-8'''), 166.2 (C-9''').
상기 수소 스펙트럼 특성 및 탄소 스펙트럼 데이터는 기본적으로 참고 문헌 [1]에 보고된 것과 일치하며, 화합물은 포르시토사이드 I로 확인되었다.
화합물 3: 투명한 유리상 고체 (메탄올), ESI-MS m/z: 623.2 [M-H]-, 및 상기 화합물의 분자식은 NMR 데이터에 근거하여 C29H36O15 로 결정되었다.
1H-NMR (DMSO-d 6 , 600 MHz)δ H : 6.54 (1H, br s, H-2), 6.55 (1H, d, J = 8.2 Hz, H-5), 6.41 (1H, dd, J = 8.2, 2.0 Hz, H-6), 2.56 (2H, m, H-7), 4.49 (1H, d, J = 8.1 Hz, H-1'), 4.60 (1H, br s, H-1''), 1.14 (1H, d, J = 6.8 Hz, H-6''), 7.06 (1H, d, J = 1.9 Hz, H-2'''), 6.77 (1H, d, J = 8.2 Hz, H-5'''), 7.02 (1H, dd, J = 8.2, 1.9 Hz, H-6'''), 7.49 (1H, d, J =15.8 Hz, H-7'''), 6.28 ( 1H, d, J = 15.8 Hz, H-8''').
13C-NMR (DMSO-d 6 , 150 MHz) δ C : 129.1 (C-1), 115.4 (C-2), 144.8 (C-3), 143.4 (C-4), 116.2 (C-5), 119.5 (C-6), 35.0 (C-7), 69.8 (C-8), 100.2 (C-1'), 73.4 (C-2'), 74.1 (C-3'), 70.6 (C-4'), 75.4 (C-5'), 66.6 (C-6'), 100.7 (C-1''), 70.4 (C-2''), 70.3 (C-3''), 71.9 (C-4''), 68.4 (C-5''), 17.9 (C-6''), 125.6 (C-1'''), 114.9 (C-2'''), 145.5 (C-3'''), 148.3 (C-4'''), 115.8 (C-5'''), 121.2 (C-6'''), 144.8 (C-7'''), 114.2 (C-8'''), 165.6 (C-9''').
상기 수소 스펙트럼 특성 및 탄소 스펙트럼 데이터는 기본적으로 참고 문헌 [2]에 보고된 것과 일치하며, 화합물은 포르시토사이드 H로 확인되었다.
화합물 4: 투명한 유리상 고체 (메탄올), ESI-MS m/z: 639.2 [M-H]-, 및 상기 화합물의 분자식은 NMR 데이터에 근거하여 C29H36O16 로 결정되었다.
1H-NMR (DMSO-d 6 , 600 MHz)δ H : 6.64 (1H, o, H-2), 6.64 (1H, o, H-5), 6.51 (1H, br d, J = 7.3 Hz, H-6), 2.69 (2H, m, H-7), 4.31 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-1'), 4.19 (1H, d, J = 7.7 Hz, H-1''), 7.06 (1H, br s, H-2'''), 6.77 (1H, o, H-5'''), 7.01 (1H, d, J = 7.1 Hz, H-6'''), 7.49 (1H, d, J = 15.8 Hz, H-7'''), 6.26 (1H, d, J = 15.8 Hz, H-8''').
13C-NMR (DMSO-d 6 , 150 MHz) δ C : 129.7 (C-1), 116.8 (C-2), 145.4 (C-3), 140.0 (C-4), 116.3 (C-5), 120.0 (C-6), 35.5 (C-7), 71.7 (C-8), 103.1 (C-1'), 73.9 (C-2'), 74.4 (C-3'), 70.7 (C-4'), 73.7 (C-5'), 68.6 (C-6'), 103.7 (C-1''), 74.0 (C-2''), 77.0 (C-3''), 70.4 (C-4''), 77.3 (C-5''), 61.4 (C-6''), 125.9 (C-1'''), 115.4 (C-2'''), 146.1 (C-3'''), 149.1 (C-4'''), 116.0 (C-5'''), 121.9 (C-6'''), 145.4 (C-7'''), 114.2 (C-8'''), 166.7 (C-9''').
상기 수소 스펙트럼 특성 및 탄소 스펙트럼 데이터는 기본적으로 참고 문헌 [3]에 보고된 것과 일치하며, 화합물은 루그란도사이드로 확인되었다.
화합물 5: 투명한 유리상 고체 (메탄올), ESI-MS m/z: 639.2 [M-H]-, 및 상기 화합물의 분자식은 NMR 데이터에 근거하여 C29H36O16 로 결정되었다.
1H-NMR (DMSO-d 6 , 600 MHz)δ H : 6.64 (2H, br s, H-2, 5), 6.52 (1H, dd, J = 8.0, 1.7 Hz, H-6), 2.69 (2H, m, H-7), 4.36 (1H, d, J = 7.7 Hz, H-1'), 4.25 (1H, d, J = 7.7 Hz, H-1''), 7.06 (1H, br s, H-2'''), 6.78 (1H, d, J = 7.9 Hz, H-5'''), 7.01 (1H, d, J = 7.9 Hz, H-6'''), 7.48 (1H, d, J =15.9 Hz, H-7'''), 6.30 (1H, d, J = 15.9 Hz, H-8''').
13C-NMR (DMSO-d 6 , 150 MHz) δ C : 129.8 (C-1), 116.8 (C-2), 145.3 (C-3), 143.9 (C-4), 116.3 (C-5), 120.1 (C-6), 35.5 (C-7), 70.6 (C-8), 103.0 (C-1'), 71.9 (C-2'), 78.0 (C-3'), 68.3 (C-4'), 75.8 (C-5'), 68.5 (C-6'), 103.8 (C-1''), 74.0 (C-2''), 77.3 (C-3''), 70.5 (C-4''), 77.1 (C-5''), 61.5 (C-6''), 126.1 (C-1'''), 116.0 (C-2'''), 145.4 (C-3'''), 148.7 (C-4'''), 116.3 (C-5'''), 121.7 (C-6'''), 146.0 (C-7'''), 115.2 (C-8'''), 166.6 (C-9''').
상기 수소 스펙트럼 특성 및 탄소 스펙트럼 데이터는 기본적으로 참고 문헌 [4]에 보고된 것과 일치하며, 화합물은 이소루그란도사이드로 확인되었다.
화합물 6: 연갈색 유리상 고체 (메탄올), ESI-MS m/z: 639.2 [M-H]-, 및 상기 화합물의 분자식은 NMR 데이터에 근거하여 C29H36O16 로 결정되었다.
1H-NMR (DMSO-d 6 , 600 MHz)δ H : 6.55 (1H, br s, H-2), 6.54 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5), 6.42 (1H, dd, J = 8.0, 1.9 Hz, H-6), 2.56 (2H, m, H-7), 4.49 (1H, d, J = 8.1 Hz, H-1'), 4.24 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-1''), 7.06 (1H, br s, H-2'''), 6.77 (1H, d, J = 8.1 Hz, H-5'''), 7.02 (1H, dd, J = 8.1, 1.9 Hz, H-6'''), 7.49 (1H, d, J =15.8 Hz, H-7'''), 6.28 ( 1H, d, J = 15.8 Hz, H-8''').
13C-NMR (DMSO-d 6 , 150 MHz) δ C : 129.3 (C-1), 115.9 (C-2), 145.0 (C-3), 143.5 (C-4), 116.3 (C-5), 119.7 (C-6), 35.1 (C-7), 69.9 (C-8), 100.2 (C-1'), 74.3 (C-2'), 75.8 (C-3'), 70.2 (C-4'), 73.5 (C-5'), 68.4 (C-6'), 103.5 (C-1''), 73.6 (C-2''), 77.0 (C-3''), 70.1 (C-4''), 76.8 (C-5''), 61.2 (C-6''), 125.7 (C-1'''), 115.5 (C-2'''), 145.7 (C-3'''), 148.4 (C-4'''), 115.5 (C-5'''), 121.4 (C-6'''), 145.2 (C-7'''), 115.0 (C-8'''), 165.8 (C-9''').
상기 수소 스펙트럼 특성 및 탄소 스펙트럼 데이터는 기본적으로 참고 문헌 [4]에 보고된 것과 일치했다.
화합물 7: 연갈색 유리상 고체 (메탄올), ESI-MS m/z: 609.2 [M-H]-, 및 상기 화합물의 분자식은 NMR 데이터에 근거하여 C28H34O15 로 결정되었다.
1H-NMR (DMSO-d 6 , 600 MHz)δ H : 6.63 (1H, brs, H-2), 6.62 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5), 6.50 (1H, dd, J = 8.0, 2.0 Hz, H-6), 2.69 (2H, m, H-7), 4.33 (1H, d, J = 7.7 Hz, H-1'), 4.89 (1H, t, J = 9.4 Hz, H-3'), 4.19 (1H, d, J = 7.6 Hz, H-1''), 7.05 (1H, br s, H-2'''), 6.77 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5'''), 7.01 (1H, dd, J = 8.0, 1.9 Hz, H-6'''), 7.47 (1H, d, J =15.7 Hz, H-7'''), 6.29 ( 1H, d, J = 15.7 Hz, H-8''').
13C-NMR (DMSO-d 6 , 150 MHz) δ C : 129.3 (C-1), 116.5 (C-2), 145.1 (C-3), 143.6 (C-4), 115.9 (C-5), 119.7 (C-6), 35.2 (C-7), 70.3 (C-8), 102.7 (C-1'), 71.5 (C-2'), 77.6 (C-3'), 67.9 (C-4'), 75.4 (C-5'), 68.1 (C-6'), 104.2 (C-1''), 73.4 (C-2''), 76.7 (C-3''), 69.7 (C-4''), 65.8 (C-5''), 125.8 (C-1'''), 114.8 (C-2'''), 145.7 (C-3'''), 148.4 (C-4'''), 115.6 (C-5'''), 121.3 (C-6'''), 145.1 (C-7'''), 114.9 (C-8'''), 166.3 (C-9''').
상기 수소 스펙트럼 특성은 기본적으로 참고 문헌 [5]에 보고된 것과 일치했다. 화합물의 구조는 추가로 2차원 스펙트럼으로 확인했으며, 탄소 신호는 상기 화합물을 리안키아옥신간 C로 동정하기 위해 할당했다.
화합물 8: 연갈색 유리상 고체 (메탄올), ESI-MS m/z: 609.2 [M-H]-, 및 상기 화합물의 분자식은 NMR 데이터에 근거하여 C28H34O15 로 결정되었다.
1H-NMR (DMSO-d 6 , 600 MHz)δ H : 6.64 (1H, brs, H-2), 6.63 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5), 6.51 (1H, dd, J = 8.0, 1.8 Hz, H-6), 2.70 (2H, m, H-7), 3.62, 3.89 (2H, m, H-8), 4.30 (1H, d, J = 8.1 Hz, H-1'), 4.64 (1H, t, J = 9.8 Hz, H-4'), 4.15 (1H, d, J = 7.6 Hz, H-1''), 7.06 (1H, br s, H-2'''), 6.77 (1H, d, J = 7.9 Hz, H-5'''), 7.02 (1H, dd, J = 7.9, 1.4 Hz, H-6'''), 7.49 (1H, d, J =15.8 Hz, H-7'''), 6.27 ( 1H, d, J = 15.8 Hz, H-8''').
13C-NMR (DMSO-d 6 , 150 MHz) δ C : 129.3 (C-1), 115.6 (C-2), 145.7 (C-3), 143.6 (C-4), 116.4 (C-5), 119.6 (C-6), 35.2 (C-7), 70.3 (C-8), 102.8 (C-1'), 74.0 (C-2'), 73.6 (C-3'), 71.3 (C-4'), 73.3 (C-5'), 68.2 (C-6'), 103.9 (C-1''), 73.4 (C-2''), 76.5 (C-3''), 69.6 (C-4''), 65.8 (C-5''), 125.6 (C-1'''), 115.0 (C-2'''), 145.0 (C-3'''), 148.6 (C-4'''), 115.9 (C-5'''), 121.6 (C-6'''), 145.8 (C-7'''), 113.9 (C-8'''), 166.3 (C-9''').
상기 수소 스펙트럼 특성 및 탄소 스펙트럼 데이터는 기본적으로 참고 문헌 [6]에 보고된 것과 일치했다. 탄소 및 탄화수소 신호는 2차원 핵자기 데이터에 의해 할당되었으며, 상기 화합물은 칼세올라리오사이드 C로 확인되었다.
화합물 9: 투명한 유리상 고체 (메탄올), ESI-MS m/z: 461.2 [M-H]-, 및 상기 화합물의 분자식은 NMR 데이터에 근거하여 C20H30O12 로 결정되었다.
1H-NMR (DMSO-d 6 , 400 MHz) δ H : 6.59 (1H, d, J = 3.2 Hz, H-2), 6.61 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5), 6.47 (1H, dd, J = 8.0, 2.0 Hz, H-6), 2.64 (2H, t, J =7.6 Hz, H-7), 1.11 (3H, d, J = 6.4 Hz, H-6'').
13C-NMR (DMSO-d 6 , 100 MHz) δ C : 129.3 (C-1), 116.3 (C-2), 144.9 (C-3), 143.5 (C-4), 115.5 (C-5), 119.5 (C-6), 35.2 (C-7), 70.1 (C-8), 103.0 (C-1'), 73.4 (C-2'), 76.7 (C-3'), 70.2 (C-4'), 75.4 (C-5'), 67.0 (C-6'), 100.8 (C-1''), 70.7 (C-2''), 70.5 (C-3''), 72.0 (C-4''), 68.4 (C-5''), 18.0 (C-6'').
상기 수소 스펙트럼 특성 및 탄소 스펙트럼 데이터는 기본적으로 참고 문헌 [7]에 보고된 것과 일치하며, 상기 화합물은 포르시토사이드 E로 확인되었다.
화합물 10: 투명한 유리상 고체 (메탄올), ESI-MS m/z: 477.2 [M-H]-, 및 상기 화합물의 분자식은 NMR 데이터에 근거하여 C20H30O13 로 결정되었다.
1H-NMR(DMSO-d 6 , 600 MHz) δ H : 6.60 (1H, d, J =1.8 Hz, H-2), 6.61 (1H, d, J = 8.2 Hz, H-5), 6.47 (1H, dd, J = 8.2, 1.8 Hz, H-6), 4.15 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-1'), 4.22 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-1').
13C-NMR (DMSO-d 6 , 150 MHz) δ C : 129.3 (C-1), 116.3 (C-2), 144.9 (C-3), 143.5 (C-4), 115.5 (C-5), 119.5 (C-6), 35.1 (C-7), 70.0 (C-8), 102.8 (C-1'), 73.4 (C-2'), 76.7 (C-3'), 69.9 (C-4'), 75.7 (C-5'), 68.4 (C-6'), 103.3 (C-1''), 73.4 (C-2''), 76.9 (C-3''), 70.0 (C-4''), 76.7 (C-5''), 61.0 (C-6'').
상기 수소 스펙트럼 특성 및 탄소 스펙트럼 데이터는 기본적으로 참고 문헌 [8]에 보고된 것과 일치하며, 상기 화합물은 페루지노사이드 B로 확인되었다.
화합물 11 및 화합물 12는 백색 분말형 고체 (메탄올)이며, 핵자기 공명 스펙트럼에서 측정 대상 성분이 에피머쌍의 혼합물임을 나타냈다.
NMR 데이터를 참고 문헌[9]에 보고된 것과 비교하면, 이 성분은 D-아미그달린과 L-아미그달린의 혼합물인 것을 확인할 수 있으며, 이 혼합물의 분자량은 ESI-MS m/z: 456.2 [M-H]- 이었다.
화합물 11, D-아미그달린의 NMR 데이터는 다음과 같이 할당되었다: 1H-NMR (DMSO-d 6 , 400 MHz)δ H : 7.55 (2H, o, H-4, 8), 7.48 (3H, o, H-5, 6, 7), 5.99 (1H, s, H-2), 4.20-4.60 (2H, o, H-1',1'')； 13C-NMR (DMSO-d 6 , 100 MHz) δ C : 118.9 (C-1), 68.5 (C-2), 133.9 (C-3), 129.6 (C-6), 127.3 (C-5,7), 129.0 (C-4,8), 103.7 (C-1'), 73.1 (C-2'), 76.8 (C-3'), 70.1 (C-4'), 76.6 (C-5'), 66.8 (C-6'), 101.6 (C-1''), 73.8 (C-2''), 76.8 (C-3''), 70.1 (C-4''), 76.5 (C-5''), 61.1 (C-6'').
화합물 12, L-아미그달린의 NMR 데이터는 다음과 같이 할당되었다: 1H-NMR (DMSO-d 6 , 400 MHz)δ H : 7.55 (2H, o, H-4, 8), 7.48 (3H, o, H-5,6,7), 5.99 (1H, s, H-2), 4.20-4.60 (2H, o, H-1', 1'')；13C-NMR (DMSO-d 6 , 100 MHz) δ C : 118.2 (C-1), 69.0 (C-2), 133.8 (C-3), 128.9 (C-4,8), 127.5 (C-5,7), 129.6 (C-6), 104.0 (C-1'), 72.9 (C-2'), 76.8 (C-3'), 70.3 (C-4'), 76.5 (C-5'), 67.1 (C-6'), 101.0 (C-1''), 73.6　　 (C-2''), 76.8 (C-3''), 70.0 (C-4''), 76.2 (C-5''), 61.1 (C-6'').
화합물 13: 비정질 고체 (메탄올) ESI-MS m/z: 340.1 [M + HCOO]-. 및 상기 화합물의 분자식은 NMR 데이터에 근거하여 C14H17O6 로 결정되었다.
1H-NMR (DMSO-d 6 , 600 MHz) δ H : 7.56 (2H, d, J = 7.7 Hz, H-2,6), 7.48 (2H, o, H-3,5), 7.48 (1H, o, H-4), 6.03 (1H, s, H-7), 4.19 (1H, d, J = 6.6 Hz, H-1'), 3.70 (1H, br d, J = 11.6 Hz, H-6'a), 3.51 (1H, br d, J = 11.0 Hz, H-6'b), 3.09 (4H, o, H-2', H-3', H-4', H-5').
13C-NMR (DMSO-d 6 , 150 MHz)δc:134.4 (C-1), 128.1 (C-2,6), 129.7 (C-3,5), 130.3 (C-4), 67.3 (C-7), 119.5 (C-8), 101.8 (C-1'), 73.9 (C-2'), 77.2 (C-3'), 70.6 (C-4'), 78.0 (C-5'), 61.8 (C-6').
상기 수소 스펙트럼 특성 및 탄소 스펙트럼 데이터는 기본적으로 참고 문헌 [10]에 보고된 것과 일치하며, 상기 화합물은 삼부니그린으로 확인되었다.
화합물 14: 비정질 고체 (메탄올) ESI-MS m/z: 315.1 [M-H]-. 및 상기 화합물의 분자식은 NMR 데이터에 근거하여 C14H20O8 로 결정되었다.
1H-NMR (DMSO-d 6 , 600 MHz)δ H : 6.04 (2H, d, J = 10.1 Hz, H-2, 6), 6.97 (2H, dd, J = 10.1 Hz, 2.6 Hz H-3, 5), 4.07 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-1'), 1.89 (2H, m, H-1'').
13C-NMR (DMSO-d 6 , 150 MHz) δ C : 185.3 (C-1), 126.4 (C-2, 6), 153.4 (C-3 or C-5), 153.3 (C-3 or C-5), 67.3 (C-4), 39.7 (C-1'), 63.9 (C-2'), 102.9 (C-1''), 73.4 (C-2''), 76.9 (C-3''), 70.0 (C-4''), 76.7 (C-5''), 61.0 (C-6'').
상기 수소 스펙트럼 특성 및 탄소 스펙트럼 데이터는 기본적으로 참고 문헌 [11]에 보고된 것과 일치하며, 상기 화합물은 코르노사이드로 확인되었다.
화합물 15: 비정질 고체 (메탄올) ESI-MS m/z: 195.1 [M-H]-. 및 상기 화합물의 분자식은 NMR 데이터에 근거하여 C10H12O4 로 결정되었다.
1H-NMR (DMSO-d 6 , 600 MHz)δ H : 7.02 (2H, br d, J = 10.0 Hz H-2, 6), 6.08 (2H, br d, J = 10.0 Hz, H-3, 5), 2.69 (2H, s, H-1'), 4.01 (2H, q, J = 14.2 Hz, 7.1 Hz, H-3'), 1.13 (3H, td, J = 7.1 Hz, 1.4 Hz, H-4').
13C-NMR (DMSO-d 6 , 150 MHz) δ C : 185.2 (C-1), 126.8 (C-2, C-6), 151.7 (C-3, C-5), 66.6 (C-4), 44.9 (C-1'), 168.6 (C-2'), 60.2 (C-3'), 14.1 (C-4').
상기 수소 스펙트럼 특성 및 탄소 스펙트럼 데이터는 기본적으로 참고 문헌 [12]에 보고된 것과 일치하며, 상기 화합물은 4-히드록시-4-메틸렌카르보메톡시-시클로헥사-2,5-디에논으로 확인되었다.
화합물 16: 백색 결정 (메탄올) ESI-MS m/z: 787.2 [M + HCOO]-. 765.3 [M + Na]+, 및 상기 화합물의 분자식은 NMR 데이터에 근거하여 C34H46O18 로 결정되었다.
1H-NMR (DMSO-d 6 , 600 MHz) δ H : 3.76 (12H, s, OCH3-2, 2', 6, 6'), 6.66 (4H, s, H-3, 3', 5, 5'), 4.67 (2H, d, J = 3.8 Hz, H-7, 7'), 4.20 (2H, m, H-9α, 9'α), 3.83 (2H, dd, J = 9.2, 3.4 Hz, H-9β, 9'β).
13C-NMR (DMSO-d 6 , 150 MHz) δc: 137.3 (C-1, 1'), 152.8 (C-2, 2', 6, 6'), 104.3 (C-3, 3', 5, 5'), 133.8 (C-4, 4'), 85.2 (C-7, 7'), 53.7 (C-8, 8'), 71.5 (C-9, 9'), 56.6 (OCH3 -2, 2', 6, 6'), 102.8 (C-1'', 1'''), 74.3 (C-2'', 2'''), 77.3 (C-3'', 3'''), 70.0 (C-4'', 4'''), 76.6 (C-5'', 5'''), 61.0 (C-6'', 6''').
상기 수소 스펙트럼 특성 및 탄소 스펙트럼 데이터는 기본적으로 참고 문헌 [13, 14]에 보고된 것과 일치하며, 상기 화합물은 리리오덴드린으로 확인되었다.
화합물 17: 백색 분말 (메탄올), ESI-MS m/z : 417.1 [M-H]-, 및 상기 화합물의 분자식은 NMR 데이터에 근거하여 C21H22O9 로 결정되었다.
1H-NMR (DMSO-d 6 , 600 MHz) δ H : 5.53 (1H, dd, J = 12.7, 2.8 Hz, H-2), 7.65 (1H, d, J = 8.6 Hz, H-5), 6.35 (1H, d, J = 2.2 Hz, H-8), 6.51 (1H, dd, J = 8.6, 2.2 Hz, H-6), 7.45 (2H, d, J = 8.7 Hz, H-2', 6'), 7.07 (2H, d, J = 8.8 Hz, H-3', 5'), 3.15 (1H, o, H-3a) 2.68 (1H, dd, J = 16.7, 2.9 Hz, H-3b), 3.2-3.5 (4H, m, , 2'', 3'', 4'', 5''), 4.89 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-6''a), 3.70 (1H, d, J = 12.0 Hz, H-6''b).
13C-NMR (DMSO-d 6 , 150 MHz) δ C : 78.8 (C-2), 43.3 (C-3), 190.0 (C-4), 132.5 (C-5), 110.7 (C-6), 164.8 (C-7), 113.6 (C-8), 163.2 (C-9), 102.7 (C-10), 128.5 (C-1'), 128.1 (C-2', 6'), 116.3 (C-3', 5'), 157.6 (C-4'), 100.4 (C-1''), 73.3 (C-2''), 76.7 (C-3''), 69.8 (C-4''), 77.2 (C-5''), 60.8 (C-6'').
상기 수소 스펙트럼 특성 및 탄소 스펙트럼 데이터는 기본적으로 참고 문헌 [15]에 보고된 것과 일치하며, 상기 화합물은 글리시리진-7-O-β-D-글루코사이드로 확인되었다.
화합물 18: 연황색 비정질 고체 (메탄올), ESI-MS m/z: 137.0 [M-H]-, 및 상기 화합물의 분자식은 NMR 데이터에 근거하여 C7H6O3 로 결정되었다.
1H-NMR (DMSO-d 6 , 600 MHz)δ H : 9.68 (CHO), 7.22 (1H, br s, H-2), 6.89 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-3), 7.25 (1H, br d, J = 7.8 Hz, H-4).
13C-NMR (DMSO-d 6 , 150 MHz) δ C : 191.1 (CHO), 128.8 (C-1), 115.5 (C-2), 145.9 (C-3), 152.2 (C-4), 114.3 (C-5), 124.5 (C-6).
상기 수소 스펙트럼 특성 및 탄소 스펙트럼 데이터는 기본적으로 참고 문헌 [16, 17]에 보고된 것과 일치하며, 상기 화합물은 3,4-디히드록시벤즈알데히드로 확인되었다.
실시예 2
전통 한약 조성물을 다음 중량부의 생약들로 제조하였다: 30kg의 연교, 20kg의 금은화, 30kg의 대청, 6kg의 대황, 10kg의 광곽향, 20kg의 관중, 6kg의 홍경천, 0.5kg의 멘톨, 10kg의 마황, 6kg의 행인, 30kg의 어성초, 6kg의 감초, 30kg의 석고; 여기서 전통 한약 조성물의 전체 추출물은 다음의 단계에 따라 제조한다:
(1) 생약들을 중량비 기준으로 계량하고, 깨끗한 것을 취하여 분쇄하는 단계;
(2) 광곽향을 분쇄하고 광곽향 중량 대비 10배의 물을 첨가해 휘발성 유분을 추출하며, 휘발성 유분의 추출 시간은 8시간이고, 휘발성 유분을 수집 및 추후 사용을 위해 보존하고; 추출물을 여과한 후 잔류물을 버리고 여과액은 사용을 위해 보존하는 단계;
(3) 연교, 마황, 어성초 및 대황은 12배의 70 중량% 에탄올로 각 회당 2.5시간 동안 총 3회에 걸쳐 추출하고, 이때 70 중량% 에탄올의 중량은 상기 연교, 마황, 어성초 및 대황의 총 중량의 12배이며; 이어서 추출물을 혼합 및 여과하고 에탄올을 회수하며, 여과액은 사용을 위해 보존하는 단계;
(4) 금은화, 석고, 대청, 관중, 감초 및 홍경천은 물과 함께 비등처리하고, 이때 물의 중량은 상기 금은화, 석고, 대청, 관중, 감초 및 홍경천의 총 중량의 12배이며; 이어서 행인을 여기에 첨가한 다음 각 회당 1시간씩 2회 비등처리하고; 추출물을 혼합 및 여과하고, 수득된 여과액을 상기 단계 (2)에서 광곽향을 추출한 뒤 얻은 여과액과 조합하고, 60℃에서 1.10의 상대밀도를 갖는 투명한 추출물로 응축시키고, 이어서 에탄올을 첨가하여 알코올 농도를 70 중량%로 조정 후, 4℃에서 냉각 및 여과하고, 알코올 맛이 나지 않을 때까지 에탄올을 회수하여 투명한 추출물을 수득하고 추후 사용을 위해 보존하는 단계;
(5) 단계 (4)에서 수득한 투명한 추출물을 단계 (3)에서 수득한 알코올 추출물과 조합한 다음, 60℃에서 1.15의 상대밀도를 갖는 정제 추출물로 응축시키고; 이를 건조하여 전통 한약 조성물의 전체 추출물을 수득하고 추후 사용을 위해 보존한다.
상기 분리방법의 단계들은 실시예 1에서와 동일하다. 결과로서, 실시예 1에서 설명한 18가지 화합물을 분리했다.
실시예 3
전통 한약 조성물을 다음 중량부의 생약들로 제조된다: 27.8kg의 연교, 29.4kg의 금은화, 28.5kg의 대청, 5.5kg의 대황, 9.5kg의 광곽향, 29kg의 관중, 8.7kg의 홍경천, 0.85kg의 멘톨, 8.8kg의 마황, 8kg의 행인, 28.4kg의 어성초, 9.5kg의 감초, 27.7kg; 여기서 전통 한약 조성물의 전체 추출물은 다음의 단계에 따라 제조한다:
(1) 생약들을 중량비 기준으로 계량하고, 깨끗한 것을 취하여 분쇄하는 단계;
(2) 광곽향을 분쇄하고 광곽향 중량 대비 10배의 물을 첨가해 휘발성 유분을 추출하며, 휘발성 유분의 추출 시간은 8시간이고, 휘발성 유분을 수집 및 추후 사용을 위해 보존하고; 추출물을 여과한 후 잔류물을 버리고 여과액은 사용을 위해 보존하는 단계;
(3) 연교, 마황, 어성초 및 대황은 12배의 70 중량% 에탄올로 각 회당 2.5시간 동안 총 3회에 걸쳐 추출하고, 이때 70 중량% 에탄올의 중량은 상기 연교, 마황, 어성초 및 대황의 총 중량의 12배이며; 이어서 추출물을 혼합 및 여과하고 에탄올을 회수하며, 여과액은 사용을 위해 보존하는 단계;
(4) 금은화, 석고, 대청, 관중, 감초 및 홍경천은 물과 함께 비등처리하고, 이때 물의 중량은 상기 금은화, 석고, 대청, 관중, 감초 및 홍경천의 총 중량의 12배이며; 이어서 행인을 여기에 첨가한 다음 각 회당 1시간씩 2회 비등처리하고; 추출물을 혼합 및 여과하고, 수득된 여과액을 상기 단계(2)에서 광곽향을 추출한 뒤 얻은 여과액과 조합하고, 60℃에서 1.13의 상대밀도를 갖는 투명한 추출물로 응축시키고, 이어서 에탄올을 첨가하여 알코올 농도를 70 중량%로 조정 후, 4℃에서 냉각 및 여과하고, 알코올 맛이 나지 않을 때까지 에탄올을 회수하여 투명한 추출물을 수득하고 추후 사용을 위해 보존하는 단계;
(5) 단계(4)에서 수득한 투명한 추출물을 단계(3)에서 수득한 알코올 추출물과 조합한 다음, 60℃에서 1.18의 상대밀도를 갖는 투명한 추출물로 응축시키고; 이를 건조하여 전통 한약 조성물의 전체 추출물을 수득하고 사용을 위해 보존한다.
상기 분리방법의 단계들은 실시예 1에서와 동일하다. 결과로서, 실시예 1에서 설명한 18가지 화합물을 분리했다.
본 실시예에 언급된 참고 문헌들은 다음과 같다:
[1] Fan Yi, Chen Ling, Zhu Jie, et al., Chemical compositions of Forsythia leaf [J]. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae, 2015, 12 (24): 22-25.
[2] Wang F N, Ma Z Q, Liu Y, et al., New Phenylethanoid Glycosides from the Fruits of Forsythia Suspense (Thunb.) Vahl [J]. Molecules, 2009, 14 (3): 1324-1331.
[3] Zheng Xiaoke, Li Jun, Feng Sanitary, et al., Studies on the phenylethanol glycosides of Lithocholic grass [J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs, 2002, 33 (10): 19-21.
[4] Lin Sheng, Liu Mingtao, Wang Sujuan, et al., Powder glycosides and phenylethanol glycosides of the Ligustrum sinense [J]. China Journal of Traditional Chinese medicine, 2010, 35 (8): 992-996.
[5] Xia Y G , Yang B Y , Liang J, et al., Caffeoyl Phenylethanoid Glycosides from Unripe Fruits of Forsythia Suspensai [J]. CHEM NAT COMPD+, 2015, 51 (4): 656-659.
[6] Nicoletti M, Galeffi C, Messana I, et al., Phenylpropanoid glycosides from Calceolaria hypericina [J]. Phytochemistry, 1988, 27 (2): 639-641.
[7] Endo K, Hikino H. Structures of rengyol, rengyoxide and rengyolone, new cyclohexylethane derivatives from Forsythia suspensa fruits [J]. Can. J. Chem., 1984, 62 (9): 2011-2014.
[8] Calis I, Tasdemir D, Sticher O, et al., Phenylethanoid Glycosides from Digitalis. ferruginea subsp. farruginea (=D.aurea LiNDLEY)(Scrophulariaceae) [J]. Chem. Pharm. Bull., 1999, 47 (9): 1305-1307.
[9] Xiao Wei, Xie Xue, Song Yaling, et al., Preparation method of Amygdalin: China, CN105461765A [P], 2016-04-06.
[10] Liu Hua, Shen Juanjuan, Zhang Dongming, et al., Studies on the polar components of Elsholtzia haichowensis Sun [J]. China Journal of Experimental Traditional Medical Formulae, 2010, 16 (8): 84-86.
[11] Hong M L, Jin K K, Jai M J, et al., Analysis of the inhibitory activity of Abeliophyllum distichum leaf constituents against aldose reductase by using high-speed counter current chromatography[J]. Arch. Pharm. Res., 2013, 36(9): 1104-1112.
[12] Muhammad P, Ahmad S, Nawaz H R , et al., New acetylated quinols from Ajuga parviflora [J]. Fitoterapia, 1999, 70 (3): 229-232.
[13] Lami N, Kadota S, Kikuchi T, et al., Constituents of the roots of Boerhaavia diffusa L. III. Identification of Ca2+ channel antagonistic compound from the methanol extract [J]. Chem. Pharm. Bull., 1991, 39 (6): 1551-1555.
[14] He Jun, Zhang Xunjie, Ma Bingzhi, et al., Studies on chemical constituents of Solanum lyratum thunb [J]. Chinese Pharmaceutical Journal, 2015, 50 (23): 2035-2038.
[15] Jin Q H, Lee C, Lee J W, et al., Chemical Constituents from the Fruits of Prunus mume [J]. Nat. Prod. Sci., 2012, 18 (3): 200-203.
[16] Kang H S, Choi J H, Cho W K, et al., A Sphingolipid and Tyrosinase Inhibitorsfrom the Fruiting Body of Phellinus linteus [J]. Arch. Pharm. Res., 2004, 27 (7): 742-750.
[17] Trimbak B M, Tushar M K, Ramakrishna G B. Oxidative decarboxylation of arylacetic acids in water: One-pot transition-metal-free synthesis of aldehydes and ketones[J]. Tetrahedron Letters, 2017, 58(29): 2822-2825.
본 발명의 실시예를 상가와 같이 기술하였으나, 이러한 상세한 설명은 예시적인 것일 뿐 전부를 총망라한 것은 아니며, 본 발명은 상술한 실시예에에 한정되지 않는다. 따라서, 본 발명은 상기 실시예의 범위나 사상에서 벗어나지 않는 범위에서 다양한 변형과 수정이 가능하다는 것이 당해 분야의 지식을 가진 자에게는 명백할 것이다.

Claims (8)

  1. 전통 한약 조성물에서 18가지 성분들을 분리하는 방법으로서,
    상기 전통 한약 조성물은 200 내지 300 중량부의 연교 (Fructus Forsythiae), 60 내지 100 중량부의 마황 (Herba Ephedrae), 40 내지 60 중량부의 대황 (Radx et Rhizoma Rhei), 200 내지 300 중량부의 어성초 (Herba Houttuyniae), 200 내지 300 중량부의 금은화 (Flos Lonicerae), 200 내지 300 중량부의 대청 (Radix Isatidis), 60 내지 100 중량부의 광곽향 (Herba Pogostemonis), 200 내지 300 중량부의 관중 (Rhizoma Dryopteris Crassirhizomae), 60 내지 100 중량부의 홍경천 (Raidx Rhodiolae), 5 내지 9 중량부의 멘톨, 60 내지 100 중량부의 행인 (Semen Armeniacae Amarum), 60 내지 100 중량부의 감초 (Radix Glycyrrhizae) 및 200 내지 300 중량부의 석고 (Gypsum Fibrosum)로 이루어진 생약들로부터 제조되고, 상기 분리방법은 다음의 단계들을 포함하며:
    (1) 전통 한약 조성물의 전체 추출물을 AB-8 거대다공성 수지로 분리한 뒤, 물, 10% 에탄올 및 30% 에탄올을 순차적으로 사용하여 용출한 다음, 그 후 30% 에탄올 용출물을 수집하고 용매를 회수하여 30% 에탄올 추출물을 수득하는 단계;
    (2) 단계 (1)에서 얻은 30% 에탄올 추출물을 역상 실리카겔 ODS-AQ-HG, S-50μm에 로딩한 후 혼합하고; 혼합된 ODS가 자연 건조된 후, 상기 혼합 ODS를 시료 컬럼에 로딩한 다음, 분리를 위하여 중압 조제 액상 크로마토그래피를 사용하고, 분리 컬럼 충전물은 ODS-AQ-HG, S-50μm이며; 연속적으로 10 % 메탄올을 사용하고, 5개의 분획물은 용출 순서대로 수득되며, 이들의 수는 10%-1, 10%-2, 10%-3, 10%-4 및 10%-5이고; 20% 메탄올을 용출에 사용하여 6개의 분획물은 용출 순서대로 수득되며, 이들의 수는 20%-1, 20%-2, 20%-3, 20%-4, 20%-5 및 20%-6이며; 용출물을 수집하고 용매를 각각 회수하고, 각각 10%-1, 10%-2, 10%-3, 10%-4 및 10%-5로 번호를 붙인 용출 건조 추출물 및 20%-1, 20%-2, 20%-3, 20%-4, 20%-5 및 20%-6으로 번호를 붙인 용출 건조 추출물을 수득하는 단계;
    (3) 상기 단계 (2)에서 수득한 10%-1 용출 건조 추출물을 30% 메탄올에 용해시키고, 상기 용액을 0.45 μm의 미세다공성 막을 통해 여과 및 고성능 액체 크로마그래피에 의해 예비 분리하며; 여기서 이동상은 메탄올-물 22:78이며 유속은 1 ml/분이고 검출 파장은 210 nm이며; 체류 시간 3 내지 9분, 9 내지 11분, 19 내지 22분, 22 내지 26분, 26 내지 30분, 37 내지 41분 및 44 내지 48분에서 각각 크로마토그래피 피크를 수집하고, 용매를 감압 하에 회수하는 단계로; 다음과 같은 분리가 각각 수행된다:
    3 내지 9분의 크로마토그래피 피크: 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제하고, 이동상: 메탄올-물 5:95, 유속: 10 ml/분, 검출 파장: 210 nm, 크로마토그래피 컬럼: YMC-Pack R & D ODS-A, 250 Х 20 mm, S-10 μm이며, 이들 조건 하에서 체류 시간이 25 내지 27분인 크로마토그래피 피크를 수집하고, 용매를 감압 하에 회수하여 화합물 14: 코르노사이드를 수득한다;
    9 내지 11분의 크로마토그래피 피크: 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제하고, 이동상: 메탄올-물 12:88, 유속: 10 ml/분, 검출 파장: 210 nm, 크로마토그래피 컬럼: YMC-Pack R & D ODS-A, 250 Х 20 mm, S-10 μm이며, 이들 조건 하에서 체류 시간이 32 내지 35분인 크로마토그래피 피크를 수집하고, 용매를 감압 하에 회수하여 화합물 10: 페루지노사이드 B를 수득한다;
    19 내지 22분의 크로마토그래피 피크: 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제하고, 이동상: 메탄올-물 18:82, 유속: 10 ml/분, 검출 파장: 210 nm, 크로마토그래피 컬럼: YMC-Pack R & D ODS-A, 250 Х 20 mm, S-10 μm이며, 이들 조건 하에서 체류 시간이 31 내지 35분인 크로마토그래피 피크를 수집하고, 용매를 감압 하에 회수하여 화합물 9: 포르시토사이드 E를 수득한다;
    22 내지 26분의 크로마토그래피 피크: 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제하고, 이동상: 메탄올-물 16:84, 유속: 10 ml/분, 검출 파장: 210 nm, 크로마토그래피 컬럼: YMC-Pack R & D ODS-A, 250 Х 20 mm, S-10 μm이며, 이들 조건 하에서 체류 시간이 32 내지 37분인 크로마토그래피 피크를 수집하고, 용매를 감압 하에 회수하여 화합물 18: 3,4-디히드록시벤즈알데히드를 수득한다;
    26 내지 30분의 크로마토그래피 피크: 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제하고, 이동상: 메탄올-물 18:82, 유속: 10 ml/분, 검출 파장: 210 nm, 크로마토그래피 컬럼: YMC-Pack R & D ODS-A, 250 Х 20 mm, S-10 μm이며, 이들 조건 하에서 체류 시간이 38 내지 42분인 크로마토그래피 피크를 수집하고, 용매를 감압 하에 회수하여 화합물 11: D-아미그달린 및 화합물 12: L-아미그달린의 혼합물을 수득한다;
    37 내지 41분의 크로마토그래피 피크: 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제하고, 이동상: 메탄올-물 18:82, 유속: 10 ml/분, 검출 파장: 210 nm, 크로마토그래피 컬럼: YMC-Pack R & D ODS-A, 250 Х 20 mm, S-10 μm이며, 이들 조건 하에서 체류 시간이 52 내지 56분인 크로마토그래피 피크를 수집하고, 용매를 감압 하에 회수하여 화합물 13: 삼부니그린을 수득한다;
    44 내지 48분의 크로마토그래피 피크: 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제하고, 이동상: 메탄올-물 22:78, 유속: 10 ml/분, 검출 파장: 210 nm, 크로마토그래피 컬럼: YMC-Pack R & D ODS-A, 250 Х 20 mm, S-10 μm이며, 이들 조건 하에서 체류 시간이 41 내지 44분인 크로마토그래피 피크를 수집하고, 용매를 감압 하에 회수하여 화합물 15: 4-히드록시-4-메틸렌카르보메톡시-시클로헥사-2,5-디에논을 수득한다;
    (4) 단계 (2)에서 수득한 20%-2 용출 건조 추출물을 30% 메탄올에 용해시키고 0.45 μm 미세다공성 막을 통해 여과하고, 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 예비 분리하며; 이동상은 메탄올-물 22:78이며 유속은 10 ml/분이고 검출 파장은 210 nm이며; 크로마토그래피 컬럼은 YMC-Pack R & D ODS-A, 250 x 20 mm, S-10 μm이고; 체류 시간 14 내지 17분, 17 내지 19분, 22 내지 24분, 29 내지 34분 및 35 내지 40분에서 각각 크로마토그래피 피크를 수집하고, 용매를 감압 하에 회수하고, 다음과 같은 분리 공정을 각각 수행하는 단계로;
    14 내지 17분의 크로마토그래피 피크: 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제하고, 이동상: 아세토니트릴-물 15:85, 유속: 10 ml/분, 검출 파장: 210 nm, 크로마토그래피 컬럼: YMC-Pack R & D ODS-A, 250 Х 20 mm, S-10 μm이며, 이들 조건 하에서 체류 시간이 38 내지 40분 및 45 내지 47분인 크로마토그래피 피크를 수집하고, 45 내지 47분의 크로마토그래피 피크일 때의 용매를 감압 하에 회수하여 화합물 7: 리안키아옥신간 C를 수득하고; 38 내지 40분의 크로마토그래피 피크일 때의 용매를 감압 하에 회수 및 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 정제하며, 이동상: 아세토니트릴-물 13:87; 유속: 10 ml/분, 검출 파장: 210 nm, 크로마토그래피 컬럼: 250 x 20 mm, S-10 μm이며, 이들 조건 하에서 체류 시간이 52 내지 56분인 크로마토그래피 피크를 수집하고, 용매를 감압 하에 회수하여 화합물 6: 페루지노사이드 A를 수득하고;
    17 내지 19분의 크로마토그래피 피크: 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제하고, 이동상: 아세토니트릴-물 15:85, 유속: 10 ml/분, 검출 파장: 210 nm, 크로마토그래피 컬럼: YMC-Pack R & D ODS-A, 250 Х 20 mm, S-10 μm이며, 이들 조건 하에서 체류 시간이 28 내지 30분 및 37 내지 44분인 크로마토그래피 피크를 수집하고, 용매를 감압 하에 회수하여 화합물 16: 리리오덴드린 및 화합물 2: 포르시토사이드 I를 각각 수득하고;
    22 내지 24분의 크로마토그래피 피크: 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제하고, 이동상: 아세토니트릴-물 17:83, 유속: 10 ml/분, 검출 파장: 210 nm, 크로마토그래피 컬럼: YMC-Pack R & D ODS-A, 250 Х 20 mm, S-10 μm이며, 이들 조건 하에서 체류 시간이 22 내지 25분인 크로마토그래피 피크를 수집하고, 용매를 감압 하에 회수하여 화합물 8: 칼세올라리오사이드 C를 수득하고;
    29 내지 34분 크로마토그래피 피크: 용매를 감압 하에 회수한 후, 대기 과정 동안 백색 고체가 침전되며, 이를 5000 rpm에서 원심분리하여 화합물 17: 글리시리진-7-O-β-D-글루코시드를 수득하고; 상청액을 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제하고, 이동상: 아세토니트릴-물 16:84, 유속: 10 ml/분, 검출 파장: 210 nm, 크로마토그래피 컬럼: YMC-Pack R & D ODS-A, 250 Х 20 mm, S-10 μm이며, 이들 조건 하에서 체류 시간이 40 내지 45분인 크로마토그래피 피크를 수집하고, 용매를 감압 하에 회수하여 화합물 3: 포르시토사이드 H를 수득하고;
    35 내지 40분의 크로마토그래피 피크: 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제하고,이동상: 아세토니트릴-물 16:84, 유속: 10 ml/분, 검출 파장: 210 nm, 크로마토그래피 컬럼: YMC-Pack R & D ODS-A, 250 Х 20 mm, S-10 μm이며, 이들 조건 하에서 체류 시간이 34 내지 45분인 크로마토그래피 피크를 수집하고, 용매를 감압 하에 회수하여 화합물 1: 포르시토사이드 A를 수득한다;
    (5) 단계 (2)에서 수득한 20%-4 분획물과 20%-5 분획물을 혼합하고, 30% 메탄올에 용해 및 0.45 μm 미세다공성 막을 통해 여과하고, 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 예비 분리하고; 이동상은 아세토니트릴-물 15:85이며 유속은 15 ml/분이고 검출 파장은 210 nm 이며; 크로마토그래피 컬럼: YMC-Pack R & D ODS-A, 250 x 20 mm, S-10 μm이고; 체류 시간 15 내지 17분 및 35 내지 40분에서 각각 크로마토그래피 피크를 수집하고, 용매를 감압 하에 회수하는 단계로; 여기서,
    15 내지 17분의 크로마토그래피 피크: 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제하고, 이동상: 아세토니트릴-물 15:85, 유속: 12 ml/분, 검출 파장: 210 nm, 크로마토그래피 컬럼: YMC-Pack R & D ODS-A, 250 Х 20 mm, S-10 μm이며, 이들 조건 하에서 체류 시간이 15 내지 16분인 크로마토그래피 피크를 수집하고, 용매를 감압 하에 회수하여 화합물 5: 이소루그란도사이드를 수득하고;
    35 내지 40분의 크로마토그래피 피크: 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제하고, 여기서 이동상: 메탄올-물 25:75, 유속: 12 ml/분, 검출 파장: 210 nm, 크로마토그래피 컬럼: YMC-Pack R & D ODS-A, 250 Х 20 mm, S-10 μm이며, 이들 조건 하에서 체류 시간이 26 내지 29분인 크로마토그래피 피크를 수집하고, 용매를 감압 하에 회수하여 화합물 4: 루그란도사이드를 수득하며,
    상기 전통 한약 조성물의 전체 추출물은 다음의 단계에 따라 제조되는 것인 전통 한약 조성물에서 18가지 성분들을 분리하는 방법:
    (1) 멘톨을 포함하는 13가지의 상기 생약들을 중량비 기준으로 계량하고, 깨끗한 것을 취하여 분쇄하는 단계;
    (2) 분쇄된 광곽향을 추가적으로 분쇄하고, 상기 광곽향의 중량 대비 10배의 물을 첨가해 휘발성 유분을 추출하고, 상기 휘발성 유분의 추출 시간은 8시간이며, 상기 휘발성 유분을 수집하고 사용을 위해 보존하며, 추출물을 여과하고, 잔류물을 버리고 여과액은 사용을 위해 보존하는 단계;
    (3) 연교, 마황, 어성초 및 대황은 12배의 70% 에탄올로 각 회당 2.5시간 동안 3회 추출하고; 추출물을 혼합 및 여과하고 에탄올을 회수하며, 여과액은 사용을 위해 보존하는 단계;
    (4) 금은화, 석고, 대청, 관중, 감초 및 홍경천은 12배의 물과 함께 비등처리하고, 이어서 행인을 첨가한 다음 각 회당 1시간씩 2회 비등처리하고, 추출물을 혼합 및 여과하고, 수득된 여과액을 상기 단계 (2)에서 광곽향을 추출한 뒤 얻은 여과액과 배합하고, 60℃에서 1.10 내지 1.15의 상대밀도를 갖는 투명한 추출물로 응축시키고, 이어서 에탄올을 첨가하여 알코올 농도를 70%로 조정 후, 냉각 및 여과하고, 알코올 맛이 없어질 때까지 에탄올을 회수하여 투명한 추출물을 수득하고 사용을 위해 보존하는 단계;
    (5) 단계 (4)에서 수득한 투명한 추출물을 단계 (3)에서 수득한 알코올 추출물과 배합하고, 60℃에서 1.15 내지 1.20의 상대밀도를 갖는 투명한 추출물로 응축시키고; 이를 건조하여 전체 추출물을 수득하고 사용을 위해 보존하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단계 (1)에서, 용출수, 10% 에탄올, 및 30% 에탄올의 양은 한약조성물의 전체 추출물 1g에 대해 각각 40 ml의 용출수, 17.6 ml의 10% 에탄올 및 45 ml의 30% 에탄올인 것인 전통 한약 조성물에서 18가지 성분들을 분리하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 단계 (2)에서 역상 실리카겔 ODS-AQ-HG의 양은: 단계 (1)에서 수득한 30% 에탄올 추출물 1g에 대해 8g의 역상 실리카겔 ODS-AG-HG이고, 여기서 3g은 단계 (1)에서 수득한 30% 에탄올 추출물 1g과 혼합되며 나머지 5g은 중압 분리 컬럼에 충전용으로 사용되는 것인 전통 한약 조성물에서 18가지 성분들을 분리하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 단계 (2)에서, 연속적으로 10% 메탄올이 사용되고; 5개의 분획물을 용출 순서대로 수득하며, 각 분획물에 대한 용출제의 양은 단계 (1)에서 수득한 30% 에탄올 추출물 1g에 대해 66.7 ml의 10% 메탄올이고; 20% 메탄올이 용출에 사용되고, 6개의 분획물을 용출 순서대로 수득하며, 각 분획물에 대한 용출제의 양은 단계 (1)에서 수득한 30% 에탄올 추출물 1g에 대해 44.4 내지 66.7 ml의 20% 메탄올인 것인 전통 한약 조성물에서 18가지 성분들을 분리하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전통 한약 조성물은 다음 중량부의 생약들:
    200 중량부의 연교, 300 중량부의 금은화, 200 중량부의 대청, 40 중량부의 대황, 60 중량부의 광곽향, 300 중량부의 관중, 100 중량부의 홍경천, 9 중량부의 멘톨, 60 중량부의 마황, 100 중량부의 행인, 200 중량부의 어성초, 100 중량부의 감초, 200 중량부의 석고로 제조되는 것인 전통 한약 조성물에서 18가지 성분들을 분리하는 방법.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전통 한약 조성물은 다음 중량부의 생약들:
    300 중량부의 연교, 200 중량부의 금은화, 300 중량부의 대청, 60 중량부의 대황, 100 중량부의 광곽향, 200 중량부의 관중, 60 중량부의 홍경천, 5 중량부의 멘톨, 100 중량부의 마황, 60 중량부의 행인, 300 중량부의 어성초, 60 중량부의 감초, 300 중량부의 석고로 제조되는 것인 전통 한약 조성물에서 18가지 성분들을 분리하는 방법.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전통 한약 조성물은 다음 중량부의 생약들:
    278 중량부의 연교, 294 중량부의 금은화, 285 중량부의 대청, 55 중량부의 대황, 95 중량부의 광곽향, 290 중량부의 관중, 87 중량부의 홍경천, 8.5 중량부의 멘톨, 88 중량부의 마황, 80 중량부의 행인, 284 중량부의 어성초, 95 중량부의 감초 및 277 중량부의 석고로 제조되는 것인 전통 한약 조성물에서 18가지 성분들을 분리하는 방법.
  8. 삭제
KR1020207009024A 2017-09-05 2018-09-05 전통 한약 조성물에서 18가지 성분을 분리하는 방법 KR102404533B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710789895.5A CN109422780B (zh) 2017-09-05 2017-09-05 一种中药组合物中十八种成分的分离方法
CN201710789895.5 2017-09-05
PCT/CN2018/104148 WO2019047848A1 (zh) 2017-09-05 2018-09-05 一种中药组合物中十八种成分的分离方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20200040886A KR20200040886A (ko) 2020-04-20
KR102404533B1 true KR102404533B1 (ko) 2022-06-02

Family

ID=65513453

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020207009024A KR102404533B1 (ko) 2017-09-05 2018-09-05 전통 한약 조성물에서 18가지 성분을 분리하는 방법

Country Status (6)

Country Link
US (1) US11458417B2 (ko)
EP (1) EP3680248A4 (ko)
KR (1) KR102404533B1 (ko)
CN (1) CN109422780B (ko)
SG (1) SG11202001801PA (ko)
WO (1) WO2019047848A1 (ko)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112014481B (zh) * 2019-05-29 2022-10-25 湖北梦阳药业股份有限公司 一种生白口服液指纹图谱的检测方法
CN111337586B (zh) * 2020-01-09 2022-09-20 西南大学 一种基于代谢组筛选的标记类黄酮评价金银花特性的方法
CN114573539A (zh) * 2020-12-02 2022-06-03 中国科学院大连化学物理研究所 一种从桑黄药材中制备化合物Phellibaumin D的方法
CN116626183B (zh) * 2023-04-07 2024-02-06 湖南易能生物医药有限公司 一种包含黄芩的中药复方的指纹图谱构建方法及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100350916C (zh) 2005-01-24 2007-11-28 王永钧 复方积雪草中药组合物有效成分的提取方法
CN101797307A (zh) 2010-04-09 2010-08-11 广州中医药大学 一种含苯乙醇苷的枇杷叶紫珠提取物及其制备方法
CN103800523A (zh) 2012-11-13 2014-05-21 河北以岭医药研究院有限公司 一种抗病毒中药组合物的制备方法及指纹图谱的测定方法

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1194752C (zh) 2003-07-01 2005-03-30 河北以岭医药研究院有限公司 一种抗病毒中药组合物及制备方法
CN1318439C (zh) 2003-12-24 2007-05-30 天津市南开医院 苦杏仁苷的制备方法和苦杏仁苷在制备促进心脑胰及伤口血液循环的苦杏仁苷制剂中的应用
CN101862391B (zh) * 2009-04-17 2014-12-17 北京以岭药业有限公司 一种中药组合物在制备治疗人禽流感药物中的应用
CN102727653B (zh) * 2011-04-01 2015-09-09 北京中医药大学 防治急性冠脉综合征的药物组合物的制备方法及其活性部位
CN103304609B (zh) * 2012-03-10 2016-01-20 中国科学院广州生物医药与健康研究院 鱼腥草素杂合黄酮体及其制备方法和用途
CN104547209A (zh) * 2013-10-25 2015-04-29 石家庄以岭药业股份有限公司 一种中药组合物的制备方法
CN105287610B (zh) * 2014-06-27 2021-11-16 石家庄以岭药业股份有限公司 连翘酯苷i的应用及其制备方法
CN104861015A (zh) * 2015-01-16 2015-08-26 李玉山 一种甘草中有效成分的协同清洁化提取方法
CN105461765B (zh) 2015-11-25 2018-11-02 江苏康缘药业股份有限公司 一种苦杏仁苷的制备方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100350916C (zh) 2005-01-24 2007-11-28 王永钧 复方积雪草中药组合物有效成分的提取方法
CN101797307A (zh) 2010-04-09 2010-08-11 广州中医药大学 一种含苯乙醇苷的枇杷叶紫珠提取物及其制备方法
CN103800523A (zh) 2012-11-13 2014-05-21 河北以岭医药研究院有限公司 一种抗病毒中药组合物的制备方法及指纹图谱的测定方法

Also Published As

Publication number Publication date
SG11202001801PA (en) 2020-03-30
US20200398188A1 (en) 2020-12-24
CN109422780A (zh) 2019-03-05
EP3680248A1 (en) 2020-07-15
CN109422780B (zh) 2021-07-13
US11458417B2 (en) 2022-10-04
EP3680248A4 (en) 2021-06-16
KR20200040886A (ko) 2020-04-20
WO2019047848A1 (zh) 2019-03-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102404533B1 (ko) 전통 한약 조성물에서 18가지 성분을 분리하는 방법
CN109776635B (zh) 一种中药组合物中八种成分的分离方法
Ge et al. Novel caffeoylquinic acid derivatives from Lonicera japonica Thunb. flower buds exert pronounced anti-HBV activities
CN101220062A (zh) 一种同时制备甜菊苷和莱鲍迪苷a的方法
CN105503786B (zh) 裂木脂素类化合物—荨麻裂环木脂素苷e及其制备方法
CN108997296B (zh) 几种异戊烯基二氢茋和异戊烯基黄酮的结构和用途
CN107903291B (zh) 一种从防风中提取的色原酮苷类化合物及其方法和应用
CN111018877B (zh) 一种土木香中倍半萜类衍生物、其制备方法及应用
CN110357847B (zh) 一种异黄烷类化合物及其制备方法和用途
Osman et al. Identification of the volatile and nonvolatile constituents of Schinus molle (L.) fruit extracts and estimation of their activities as anticancer agents
Mishra et al. Phytochemical investigation and spectral studies of isolated flavonoid from ethanolic extract of whole plant Blumea lacera DC
CN110698444B (zh) 一种苯丙素类化合物及其制备方法
CN109180632B (zh) 一种从雷公藤中分离出的化合物的制备方法
CN108478619B (zh) 田旋花总树脂糖苷提取物及其制备方法和医药用途
Tsai et al. Lignan and flavonoid phytoestrogens from the seeds of Cuscuta chinensis
CN105777839B (zh) 一种抗肿瘤化合物、其提取方法及其应用
CN112608306B (zh) 皂角刺中黄酮类化合物皂角新酮a的制备方法及其应用
CN113698380B (zh) 木脂素类化合物及其制备方法和应用
CN109776633B (zh) 一种苯丙素类化合物及其制备方法与应用
RU2776898C1 (ru) Способ получения мирицитрина из коры ореха черного, обладающего нейротропной активностью
CN110078619B (zh) 从青竹标中提取及分离纯化的环丁四醇酯类化合物及其方法
CN108530505A (zh) 一种黄酮苷类化合物及其制备方法和应用
US20070148268A1 (en) Chemical compounds and their use as therapeutic agent and means of quality assessment of herbal medicines
Wu et al. UFLC-DAD-ESI-IT-TOFMSn Analysis on Biotransformation of Tongmai Formula Incubated with Human Intestinal Bacteria
CN110711189B (zh) 一种化合物在医药上的用途

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right