CN112014481B

CN112014481B - 一种生白口服液指纹图谱的检测方法

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Publication number: CN112014481B
Application number: CN201910455316.2A
Authority: CN
Inventors: 张敏
Original assignee: Hubei Monyan Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Hubei Monyan Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2019-05-29
Filing date: 2019-05-29
Publication date: 2022-10-25
Anticipated expiration: 2039-05-29
Also published as: CN112014481A

Abstract

本发明公开了一种生白口服液的对照指纹图谱的建立方法，包括如下步骤：步骤1、供试品溶液的制备：多批次合格的生白口服液置于容量瓶，定容，即可；步骤2、参照物溶液的制备：取对照品淫羊藿苷，定容，即可；步骤3、色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以甲酸水为B；流动相梯度洗脱；检测波长为200～300nm；柱温为25～35℃；流速为0.9ml/min～1.1ml/min；理论板数按淫羊藿苷峰计算应不低于10000；步骤4、测定方法：分别吸取参照物溶液及供试品溶液，注入超高效液相色谱仪测定，得到色谱图；步骤5、共有峰确认：上述多批次合格药物的色谱图经过计算机模型处理，形成统一一致的色谱图，选择其中峰面积占总峰面积≥0.8％且峰型好、分离度高的色谱峰为共有峰。

Description

一种生白口服液指纹图谱的检测方法

技术领域

本发明涉及一种医药质量控制领域，特别涉及一种生白口服液指纹图谱的检测方法。

背景技术

中药生白口服液是一种治疗癌症放化疗引起的白细胞减少的中药成方制剂，其主要是由淫羊藿、补骨脂、附子(制)、枸杞子、黄芪、鸡血藤、茜草、当归、芦根、麦冬和甘草制成，具有温肾健脾，补益气血的作用。药品转正标准(标准编号： WS3-016(Z-002)-2000(Z))公开了补骨脂、茜草、黄芪、甘草的薄层色谱鉴别、乌头碱限量和淫羊藿苷的高效液相色谱测定。CN200410078100.2公开了生白泡腾颗粒的质量控制方法，包括枸杞的薄层鉴别、当归的薄层鉴别、淫羊藿苷、阿魏酸和总黄酮的含量测定。上述无论是国家标准还是专利中都仅仅公开了部分有效成分的理化鉴别和含量测定，现有技术的方法都不足以解决中药制剂的多组分复杂体系这一问题，因此建立生白口服液指纹图谱将能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述、控制和评价。

LC-MS技术是目前应用较广的一种快速高效的分析方法，它结合了高效液相对复杂体系的高分离能力与质谱对结构的快速鉴定能力，即使在没有标准品的情况下，通过多极质谱给出的信息碎片，也可以对结构进行推测。而且，对于紫外吸收不强的微量或痕量成分也能很好地检测。目前已有大量文献报道用液质联用来分析黄酮类、生物碱类、氨基酸类等成分，因此采用LC-MS技术对生白口服液中的化学成分进行分析研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生白口服液的指纹图谱的检测方法，采用超高效液相色谱法测定生白口服液中的有效成分的含量成分，从而得到不同种类有效成分之间的比例关系，同时采用HPLC-UV-ESI-MS的方法，对生白口服液HPLC图谱中所含的化学成分进行定性分析，以实现生白口服液质量全面、准确的控制和评价。

为实现上述目的，本发明是通过下述技术方案实现的：

一种生白口服液的对照标准指纹图谱的建立方法，包括如下步骤：

步骤1、供试品溶液的制备：多批次合格的生白口服液置于容量瓶，定容，即可；

步骤2、参照物溶液的制备：取对照品淫羊藿苷，定容，即可；

步骤3、色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以甲酸水为B；流动相梯度洗脱；检测波长为200～300nm；柱温为25～35℃；流速为0.9ml/min～1.1ml/min；理论板数按淫羊藿苷峰计算应不低于10000；

步骤4、测定方法：分别吸取参照物溶液及供试品溶液，注入超高效液相色谱仪测定，得到色谱图；

步骤5、共有峰确认：上述多批次合格药物的色谱图经过计算机模型处理，形成统一一致的色谱图，选择其中峰面积占总峰面积≥0.8％且峰型好、分离度高的色谱峰为共有峰。

进一步优选，本发明一种生白口服液的对照标准指纹图谱建立方法，包括如下步骤：

步骤1、供试品溶液的制备：多批次的生白口服液精密量取2ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

步骤2、参照物溶液的制备：取淫羊藿苷对照品适量，精密称定，制成每1ml含100 μg的溶液，摇匀，即得；

步骤3、色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.05-0.2％甲酸水溶液为流动相B，按表1进行梯度洗脱；检测波长为270nm；柱温为30℃；流速为1.0ml/min；理论板数按淫羊藿苷峰计算应不低于10000。

表1生白口服液指纹图谱检测梯度洗脱表

步骤4、测定方法：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入超高效液相色谱仪，测定，记录70分钟的色谱图，即得色谱图；

步骤5、共有峰确认：上述多批次合格生白口服液的色谱图经过计算机模型处理，形成统一一致的色谱图，其中峰面积占总峰面积≥0.8％且峰型好、分离度高的色谱峰共14 个，相对峰面积及相对保留时间如下表2。

本发明进一步提供了一种生白口服液的指纹图谱检测方法，包括如下步骤：

(1)将供试品溶液的制备、参照物溶液的制备，注入超高效液相色谱仪测定，得到供试品溶液色谱图；

(2)将得到的色谱图与对标准照指纹图谱比对，供试品指纹图谱中应呈现与淫羊藿苷对照品色谱峰保留时间一致的色谱峰，并应出现14个共有峰。按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算0～70分钟的色谱峰，供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度不得低于 0.85，优选不低于0.90。

本发明一种生白口服液的指纹图谱检测方法中所述的供试品溶液的制备，参照物溶液的制备，色谱条件与对照标准指纹图谱设定的参数相同。

本发明进一步提供了一种生白口服液化学成分的HPLC-ESI-MS分析方法，包括如下步骤：

步骤1、供试品溶液的制备：将生白口服液置于容量瓶，定容，即可；

步骤2、参照物的制备：取对照品淫羊藿苷，定容，即可；

步骤3、色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以甲酸水为B；流动相梯度洗脱；检测波长为200～300nm；柱温为25～35℃；流速为0.9ml/min～1.1ml/min；理论板数按淫羊藿苷峰计算应不低于10000。

表3梯度洗脱表

步骤4、质谱条件：大气压电喷雾离子源(ESI)，正负离子扫描，Full MS-ddms2扫描模式；扫描范围：100-1500m/z：分辨率：Full MS：70,000；MS/MS：17,500；毛细管电压：正离子扫描模式为3.0kv，负离子扫描模式为2.5kv；鞘气压力：30bar，辅助气压力：10bar；离子传输管温度：320℃，雾化气温度：350℃；化合物稳定性：100％； NCE：30。

步骤5、化学成分分析：在液相-质谱联用分析检测下，液相色谱图，质谱正、负模式总离子流图，供试品出现了明显的[M+H]⁺或[M-H]^-信号，生成ESI-MS数据，经质谱数据库比对分析化学成分，即可。

本发明的一种生白口服液经过上述供试品、色谱条件及质谱条件的限定，共分离并限定出38种化学物质。包括谷氨酸、脯氨酸、5-羟甲基糠醛、烟酸、亮氨酸、腺苷、鸟苷、洋川芎内酯A、宋果灵、附子灵、对羟基苯甲醛、补骨脂苷、异补骨脂苷、香兰素、对羟基肉桂酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷、阿魏酸、儿茶素、苯甲酰新乌头原碱、淫羊藿苷A、芒柄花苷、1，3-二羟基-2-羟甲基蒽醌、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、 1，3，6-三羟基-2-甲基蒽醌、补骨脂素、异补骨脂素、甘草酸、蒿本内脂、淫羊藿次苷I、宝霍苷I、新补骨脂异黄酮、补骨脂二氢黄酮、补骨脂二氢黄酮甲醚、异补骨脂查耳酮。

本发明所述的指纹图谱检测方法及HPLC-ESI-MS分析方法同样适用于以淫羊藿、补骨脂、附子(制)、枸杞子、黄芪、鸡血藤、茜草、当归、芦根、麦冬和甘草为原药材的任一制剂，包括但不限于生白口服液，生白颗粒等。

本发明所述的一种生白口服液的制备方法，包括如下步骤：

步骤(1)取重量份淫羊藿200-300份、补骨脂100-160份、附子(制)60-120份、枸杞子200-300份、黄芪200-300份、鸡血藤200-300份、茜草200-300份、当归100-160 份、芦根200-300份、麦冬100-160份和甘草100-160份，备用；

步骤(2)先投入处方量中的十味饮片(不含淫羊藿)，加水加热煎煮至沸腾，然后投入处方量的淫羊藿，继续加热煮至沸腾，计时提取，滤过，得一次提取滤液，药渣加水再提取一次，滤过得第二次提取滤液，合并两次滤液，浓缩的浸膏I；

步骤(3)浸膏I醇沉，静置，滤过，收醇，得生白浸膏即可；

步骤(4)取生白浸膏加纯化水、甜菊素，搅拌，调节PH至5.0-6.0，加热煮沸30-50min，冷藏，取上清液，调节PH值至6.5-7.5，定容，滤过，灌装，灭菌。

进一步优选，本发明步骤(3)将浸膏I∶乙醇＝1∶1-2(mg/ml)的85-95％乙醇缓慢加入浸膏I中，边加边搅拌，使浸膏I分散均匀，然后再向其加85-95％乙醇至含醇量60-80％，边加边搅拌，静置，收醇，得生白浸膏即可.

上述步骤(2)中通过改变淫羊藿加入的顺序，可以提交淫羊藿苷的含量。

上述步骤(3)通过调节醇沉的比例及加入方式，能够提高化学物质的整体含量的提升。

进一步优选，本发明所述的药物是由下述制备方法得到的；

步骤(2)先投入处方量中的十味饮片(不含淫羊藿)，加水、加热煎煮至沸腾，然后投入处方量的淫羊藿，继续加热煮至沸腾，提取0.5-1.5h，滤过，得一次提取滤液，药渣加水再提取一次，滤过得第二次提取滤液，合并两次滤液，滤液浓缩至相对密度1.24-1.27(25±5℃)的浸膏I；

步骤(3)按照浸膏I∶乙醇＝1∶1-1.2的90％乙醇缓慢加入浸膏I中，边加边搅拌，使浸膏分散均匀，然后再向其加90％乙醇至含醇量70％，边加边搅拌，醇沉静置72h后，滤过，收醇，浓缩至相对密度1.24-1.27(25±5℃)得生白浸膏即可。

步骤(4)取生白浸膏加纯化水、甜菊素，搅拌，调节PH至5.0-5.5，加热煮沸30min，冷藏48h，取上清液，调节PH值至7.0-7.3，定容，滤过，灌装，灭菌。

所述的PH调节剂选用氢氧化钠溶液或碳酸氢钠溶液。

本发明中除另有明确外，溶质为固体的百分含量均为重量体积百分比，单位分别为 g/ml％，kg/L％，溶质为液体的百分含量均为体积百分比(v/v)，单位分别为ml/ml％，L/L％。本发明所述的多批次，应为10个批次及以上，例如10-30批次。

本发明是通过大量实验筛选得到的，以下通过实验数据证明本发明的有益效果：

试验例1色谱条件选择

1.1检测波长的选择

采用PDA检测器对供试品溶液进行了全波长检测，见图1，结果表明，大多数成分在200～300nm处有较好的紫外吸收，同时分别考察了250，270，280nm的波长(图2)，发现270nm的信息较全面，且分离效果好，因此优选270nm作为检测波长。

1.2流动相考察

分别考察了乙腈-水、乙腈-甲酸水溶液、乙腈-醋酸水溶液三种流动相系统。结果表明，流动相中不加酸，部分色谱峰无法检出，0.2％甲酸水-乙腈系统在22mim～25mim和44min～47min的色谱峰的分离效果优于0.2％乙酸水-乙腈系统，所以选择乙腈-甲酸水系统；再考虑到色谱柱的耐酸碱性，考察了不同浓度的甲酸水-乙腈系统，结果显示0.1％甲酸水-乙腈的色谱峰分离效果优于0.05％甲酸水-乙腈、0.2％甲酸水-乙腈，因此最终选择0.1％甲酸水-乙腈作为流动相系统，考察结果见图3。

1.3色谱柱考察

在已定的色谱条件下，分别考察了三种型号的色谱柱：①Kromasil 100-5-C18 5μm 4.6×250mm②Aglient Zorbax SB-C18 5μm 4.6×250mm③Waters SYMMETRY C18 5μm4.6×250mm；考察图谱见图4；图谱分析：三根色谱柱中，三根色谱柱分离效果虽然略有差异，但标准中标注的14个共有峰在这三根色谱柱中很容易找到，因此，可以确定该方法色谱柱耐用性良好。

1.4柱温柱流速考察

分别考察了不同的柱温柱流速对供试品溶液的分离效果，分别考察了不同的柱温柱流速对供试品溶液的分离效果。结果表明：流速0.9ml/min-1.1ml/min对色谱图峰分离影响不大，但柱温变化(30-35℃)主要对28-32min的色谱峰分离有影响。综合考虑，流速1.0ml/min，柱温30℃的图谱中各色谱峰分离度最佳，考察结果见图5。

1.5指纹图谱色谱条件140分钟图谱考察

供试品溶液进样后(批号180304)，记录140分钟时间(60分钟后均为80％有机相流动相)的色谱图，考察是否出峰完全。结果表明，在此色谱条件下，70分钟以后基线平稳，无色谱峰检出，初步确定色谱采集时间为70分钟，考察结果见图6。

1.6流动相空白及溶剂空白考察

照供试品溶液制备方法下，样品溶剂为纯水，因此，取同批次水溶液，照拟定的指纹图谱方法检测，同时采集空白流动相图谱，见图7，结果表明，在溶剂空白图谱中于63分钟左右有一小峰检出，与样品图谱对比不影响样品测定。

1.7梯度洗脱的条件的考察

考察了流动相不同梯度变化下对供试品溶液的分离效果的影响，洗脱条件如下表。结果表明：表1的梯度洗脱条件各色谱峰分离效果优于表4和表5的方法，因此选择表1梯度洗脱条件，考察结果见图8。

表4

表5

通过上述1.1-1.7实验方法研究，【指纹图谱】色谱条件与系统适用性试验最终确定为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以乙腈为流动相A，以0.1％甲酸水为流动相B，按下表1中的规定进行梯度洗脱；检测波长为270nm；柱温为30℃；流速为1.0ml/min；理论板数按淫羊藿苷峰计算应不低于10000。

试验例2方法学考察

按照指纹图谱相关技术要求，对生白口服液指纹图谱检测方法进行精密度、稳定性和重复性考察，并采用指纹图谱相似度评价软件计算相关结果，其结果均符合要求。

2.1精密度试验精密量取本品2ml(批号180304)，按“供试品溶液制备方法”制备1份供试品溶液，连续进样6次进行检测，计算相似度，结果表明，相似度均为1.000，仪器精密度良好。结果见表6。

表6仪器精密度相似度结果表

2.2稳定性试验精密量取本品2ml(批号180304)，按“供试品溶液制备方法”制备1份供试品溶液，分别在约0，2，4，8，16，24小时检测，计算相似度，结果表明，供试品在24小时检测，相似度在0.999～1.000之间，因此表明供试品在24小时内检测，样品稳定性良好。结果见表7。

表7供试品溶液24小时稳定性相似度结果表

2.3重复性试验精密量取本品2ml(批号180304)，按“供试品溶液制备方法”平行制备6份供试品溶液，分别在上述色谱条件下进行检测，计算相似度，结果表明，相似度在0.999～1.000之间，重复性良好。结果见表8。

表8重复性考察相似度结果表

2.4不同仪器考察

精密量取本品2ml(批号180304)，按“供试品溶液制备方法”平行制备3份供试品溶液，分别在Waters 2695型超高效液相色谱仪、Agilent 1260型超高效液相色谱仪、SHIMADZU LC-20A型超高效液相色谱仪上相同色谱条件下检测，对三种仪器下指纹图谱进行相似度评价，见表9，以Waters图谱为为参照，可知Waters仪器图谱与Agilent相似度亦达0.996，色谱图基本一致，Waters仪器图谱与SHIMADZU相似度高达0.995，色谱峰检出基本一致，保留时间有差异。三种仪器见相似度均大于0.9，该方法不同仪器耐用性较好。

表9不同仪器考察相似度结果表

试验例3供试品溶液的制备：考察甲醇稀释生白口服液，发现甲醇稀释后会有大量的沉淀物，故用水作为供试品制备溶剂。

附图说明

图1是根据本发明的检测波长的选择范围的色谱图；

图2是根据本发明的不同检测波长的比较的色谱图；

图3是根据本发明的不同流动相的色谱图；

图4是根据本发明的不同色谱柱的考察色谱图；

图5是根据本发明的柱温柱流速考察色谱图；

图6是根据本发明的指纹图谱2倍时间考察色谱图；

图7是根据本发明的流动相空白及溶剂空白影响考察色谱图；

图8是根据本发明的不同梯度洗脱条件的考察色谱图；

图9是根据本发明的不同批次生白口服液样品检测色谱图；

图10是根据本发明的15批20ml生白口服液对照指纹图谱共有模式图谱；

图11是根据本发明的15批10ml生白口服液对照指纹图谱共有模式图谱；

图12是根据本发明的生白口服液与阳性对照药材溶液相关性考察色谱图

图13是根据本发明的生白口服液的色图谱；

图14是根据本发明的生白口服液的HPLC-ESI-MS中HPLC图谱；

图15是根据本发明的生白口服液的HPLC-ESI-MS总离子流图谱(正离子模式)；

图16是根据本发明的生白口服液的HPLC-ESI-MS总离子流图谱(负离子模式)

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。

实施例1生白口服液的制备

步骤(1)由重量份淫羊藿240g、补骨脂120g、附子(制)80g、枸杞子240g、黄芪240g、鸡血藤240g、茜草240g、当归120g、芦根240g、麦冬120g和甘草120g 备用；

步骤(2)先投入处方量中的十味饮片(不含淫羊藿)，加水、加热煎煮至沸腾，然后投入处方量的淫羊藿，继续加热煮至沸腾，提取1h，滤过，得一次提取滤液，药渣加水再提取一次，滤过得第二次提取滤液，合并两次滤液，滤液浓缩至相对密度1.24-1.27(25 ±5℃)的浸膏I；

步骤(3)按照浸膏I∶乙醇＝1∶1～1.2的90％乙醇缓慢加入浸膏I中，边加边搅拌，使浸膏分散均匀，然后再向其加90％乙醇至含醇量70％，边加边搅拌，醇沉静置72h后，滤过，收醇，浓缩至相对密度1.24-1.27(25±5℃)得生白浸膏即得药物。

步骤(4)取生白浸膏100g(浸膏密度1.26)，按照工艺加纯化水、甜菊素，搅拌，用氢氧化钠调节PH至5.3，加热煮沸30min，冷藏48h，取上清液，氢氧化钠调节PH值至 7.0，定容，滤过，灌装，灭菌。

实施例2生白口服液的制备

步骤(1)淫羊藿200g、补骨脂100g、附子(制)60g、枸杞子200g、黄芪200g、鸡血藤200g、茜草200g份、当归100g、芦根200g、麦冬100g和甘草100g备用；

步骤(3)按照浸膏I∶乙醇＝1∶1～1.2的90％乙醇缓慢加入浸膏I中，边加边搅拌，使浸膏分散均匀，然后再向其加90％乙醇至含醇量70％，边加边搅拌，醇沉静置72h后，滤过，收醇，浓缩至相对密度1.24-1.27(25±5℃)得生白浸膏即得；

步骤(4)取生白浸膏100g(浸膏密度1.26)，按照工艺加纯化水、甜菊素，搅拌，氢氧化钠调节PH至5.3，加热煮沸30min，冷藏48h，取上清液，氢氧化钠调节PH值至 7.0，定容，滤过，灌装，灭菌。

实施例3生白口服液的制备

步骤(1)取淫羊藿300g、补骨脂160g、附子(制)120g、枸杞子300g、黄芪300g、鸡血藤300g、茜草300g、当归160g、芦根300g、麦冬160g和甘草160g备用；

步骤(4)取生白浸膏100g(浸膏密度1.26)，按照工艺加纯化水、甜菊素，搅拌，调节PH至5.3，加热煮沸30min，冷藏48h，取上清液，调节PH值至7.0，定容，滤过，灌装，灭菌。

实施例4生白口服液对照标准指纹图谱的建立

1仪器与材料

色谱仪：美国Waters e2695液相色谱系统(Waters PDA检测器，Empower 3工作站)；

色谱柱：Kromasil 100-5 C₁₈柱(250mm×4.6mm，5μm)；

试剂：乙醇，北京化工厂，分析纯；

乙腈，天津富宇精细化工有限公司，色谱纯；

甲酸，天津科密欧化学试剂有限公司；

纯净水，杭州娃哈哈集团有限公司；

腺苷，成都克洛玛生物科技有限公司，批号CHB170802；

毛蕊异黄酮葡萄糖苷，中国食品药品检定研究院，批号111920-201505；

甘草苷，中国药品生物制品检定所，批号11160-201106；

甘草酸，中国药品生物制品检定所，批号110731-201418；

朝藿定A，成都曼斯特生物技术有限公司，批号MUST-16072304；

朝藿定B，成都曼斯特生物技术有限公司，批号MUST-15121410；

朝藿定C，中国药品生物制品检定所，批号111780-201503；

淫羊藿苷，中国药品生物制品检定所，批号110737-201516；

补骨脂素，成都克洛玛生物科技有限公司，批号MUST-17092820；

异补骨脂素，成都克洛玛生物科技有限公司，批号MUST-18062910；

补骨脂苷，成都德思特生物技术有限公司，批号DST180723-923；

异补骨脂苷，成都德思特生物技术有限公司，批号DST180723-924。

供试品：均由湖北梦阳药业有限公司提供，详见表10。

表10生白口服液指纹图谱研究用供试品

参照物溶液的制备取淫羊藿苷对照品适量，精密称定，制成每1ml含100μg的溶液，摇匀，即得。

供试品溶液的制备分别精密量15批20ml生白口服液样品和15批10ml生白口服液样品2ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

【指纹图谱】照超高效液相色谱法(中国药典2015年版四部通则0512)测定。

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以乙腈为流动相A，以0.1％甲酸水为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为270nm；柱温为30℃；流速为1.0ml/min；理论板数按淫羊藿苷峰计算应不低于10000。

生白口服液指纹图谱检测梯度洗脱表

测定法分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录70分钟的色谱图，即得。并采用指纹图谱相似度评价软件计算相关结果，生成对照指纹图谱。结果表明，15批20ml生白口服液样品相似度在0.991～0.999之间，15批10ml 生白口服液样品相似度在0.987～0.999之间，各批次重复性良好，口服液的工艺较稳定。

表11 15批20ml生白口服液样品相似度结果表

表12 15批10ml生白口服液样品相似度结果表

共有峰的标注：色谱图选择积分时间为0～70min，积分参数为：峰宽为30，最小峰面积为1，最小峰高为1；选择15批20ml生白口服液样品和15批10ml生白口服液样品指纹图谱中峰面积占总峰面积≥0.8％且峰型好、分离度高的色谱峰进行标注。

2..生白口服液指纹图谱色谱峰的指认研究

在已确定的色谱条件下，分别进样腺苷(0.03463mg/ml)、毛蕊异黄酮葡萄糖苷(0.04520mg/ml)、甘草苷(0.3061mg/ml)、阿魏酸(0.07148mg/ml)、朝藿定A(0.2513mg/ml)、朝藿定B(0.1507mg/ml)、朝藿定C(0.1456mg/ml)、淫羊藿苷(0.25184mg/ml)、甘草酸(0.2383mg/ml)、补骨脂苷(0.08137mg/ml)、异补骨脂苷(0.04371mg/ml)、补骨脂素(0.04118mg/ml)、异补骨脂素(0.02745mg/ml)对照品溶液溶液和供试品溶液，对生白口服液指纹图谱的色谱峰进行指认。经指认后其中峰1-亮氨酸(枸杞子、茜草、当归)、峰2-鸟苷(黄芪、当归)、峰3-补骨脂苷(补骨脂)、峰4-异补骨脂苷(补骨脂)、峰5- 毛蕊异黄酮葡萄糖苷(黄芪)、峰6-甘草苷(甘草)、峰7-淫羊藿苷A(淫羊藿)、峰8-1，3- 二羟基-2-羟甲基蒽醌、峰9-朝藿定A、(淫羊藿)、峰10-朝藿定B(淫羊藿)、峰11-朝藿定C(淫羊藿)、峰12-淫羊藿苷(淫羊藿)、峰13-1，3，6-三羟基-2-甲基蒽醌(茜草)、峰14-甘草酸(甘草)。

3.生白口服液指纹图谱色谱峰的归属研究

按照“生白口服液制备工艺”，分别制备淫羊藿、补骨脂、附子(制)、枸杞子、黄芪、鸡血藤、茜草、当归、芦根、麦冬和甘草11味药材的阳性对照煎液，然后按照“供试品溶液的制备方法”分别制成各药材阳性对照供试品溶液，在已确定的色谱条件下，分别进样各药材阳性对照供试品溶液和成品供试品溶液，确定对照指纹图谱中各峰的归属。

结果：选择与对照图谱相似度为0.998的批号为20180304批生白口服液的指纹图谱，积分时间0～70min，积分参数为：峰宽为30，最小峰面积为1，最小峰高为1，选择15批注射剂指纹图谱中峰面积占总峰面积≥0.8％的色谱峰进行编号标注如图11、12，共标注27个色谱峰，其中专属于淫羊藿药材的色谱峰有6个，占22.2％，专属于补骨脂药材的色谱峰有4个，占14.8％，专属于黄芪药材的色谱峰有1个，占3.7％，专属于茜草的色谱峰有1个，占3.7％，专属于甘草药材的色谱峰3个，占11.1％，其余色谱峰均非专属色谱峰，详见表12。

表13生白口服液指纹图谱色谱峰归属结果

4.指纹图谱相似度研究

指纹图谱相似度标准的制定15批20ml生白口服液指纹图谱与共有模式的相似度在 0.991～0.999之间，15批10ml生白口服液样品相似度在0.987～0.999之间，平均值达到0.993，综合分析，暂定生白口服液的指纹图谱相似度值应不低于0.85。

表14 15批10ml生白口服液指纹图谱共有峰保留时间及峰面积

表15 15批20ml生白口服液指纹图谱共有峰保留时间及峰面积

实施例5.生白口服液指纹图谱的化学成分分析

1.仪器

色谱仪：Dionex Ultimate 3000 RSLC(HPG)超高效液相系统(自动进样器，双三元泵，柱温箱，在线脱气装置和DAD检测器)；

色谱柱：kromasil 100-5-C18柱(250mm×4.6mm，5μm)。

质谱仪：Thermo Scientific Q Exactive Series质谱系统(进样系统，HESI-II离子源，质量分析器，TraceFinder数据处理系统)

2.试剂

乙腈：色谱纯，Fisher Chemical产品；

甲醇：色谱纯，天津市科密欧试剂厂产品；

水：屈臣氏蒸馏水。

3.色谱条件

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以乙腈为流动相A，以0.1％甲酸水为流动相B，按下表进行梯度洗脱；流速1.0mL/min；柱温30℃；检测波长为270nm；进样量10μL；样品盘温度25℃。

梯度洗脱表

4.质谱条件

大气压电喷雾离子源(ESI)，正负离子扫描，Full MS-ddms2扫描模式；扫描范围：100-1500m/z：分辨率：Full MS：70,000；MS/MS：17,500；毛细管电压：正离子扫描模式为3.0kv，负离子扫描模式为2.5kv；鞘气压力：30bar，辅助气压力：10bar；离子传输管温度：320℃，雾化气温度：350℃；化合物稳定性：100％；NCE：30。

5.结果与讨论

5.1生白口服液的HPLC-ESI-MS分析

在液相-质谱联用分析检测下，液相色谱图，质谱正、负模式总离子流图，供试品出现了明显的[M+H]⁺或[M-H]^-信号，ESI-MS数据见表16，图14-16。

表16生白口服液的ESI-MS数据

5.1.1谷氨酸的HPLC-ESI-MS分析

峰D1(t_R＝2.58min)分子离子峰为m/z 148[M+H]⁺。经质谱数据库比对，得到的质谱裂解碎片有m/z 130[M+H-18]⁺为脱H2O形成的碎片离子峰，m/z 102[M+H-H₂O-28]⁺为脱羰基形成的碎片离子峰，m/z 84[M+H-H₂O-CO-18]⁺为脱水重排后形成的碎片离子峰，综上所述为谷氨酸。

5.1.2脯氨酸的HPLC-ESI-MS分析

峰D2(t_R＝2.87min)分子离子峰为m/z 116[M+H]⁺。经质谱数据库比对，得到的质谱裂解碎片有m/z 70[M+H-46]⁺为脱HCOOH形成，综上所述为脯氨酸。

5.1.3 5-羟甲基糠醛的HPLC-ESI-MS分析

峰D3(t_R＝3.04min)分子离子峰为m/z 127[M+H]⁺。经质谱数据库比对，得到的质谱裂解碎片有m/z 109[M+H-18]⁺为脱H₂O的碎片，综上所述为5-羟甲基糠醛。

6.1.4烟酸的HPLC-ESI-MS分析

峰D4(t_R＝4.70min)分子离子峰为m/z 123[M+H]⁺。经质谱数据库比对，得到的质谱裂解碎片有m/z 79[M+H-44]⁺为脱羧基所得，综上所述为烟酸。

5.1.5亮氨酸的HPLC-ESI-MS分析

峰D5(t_R＝6.96min)分子离子峰为m/z 132[M+H]⁺。经质谱数据库比对，得到的质谱裂解碎片有m/z 86[M+H-46]⁺为脱甲酸所得，综上所述为亮氨酸。

5.1.6腺苷的HPLC-ESI-MS分析

峰D6(t_R＝9.50min)给出分子离子峰为m/z 268[M+H]⁺。经质谱数据库比对，得到的质谱裂解碎片m/z 136[M+H-132]⁺为脱木糖基形成，综上所为腺苷。

5.1.7鸟苷的HPLC-ESI-MS分析

峰D7(tR＝9.76min)给出分子离子峰为m/z 284[M+H]+。经质谱数据库比对，得到的质谱裂解碎片m/z 152[M+H-132]+为脱C5H8O4形成，综上所为鸟苷。

5.1.8洋川芎内酯A的HPLC-ESI-MS分析

峰D8(t_R＝21.84min)分子离子峰为m/z 193[M+H]⁺。经质谱数据库比对，得到的质谱裂解碎片m/z 91[M+H-102]⁺为内酯环经裂解脱去C₆H₁₀O₂碎片所形成，综上所述为洋川芎内酯A。

5.1.9宋果灵的HPLC-ESI-MS分析

峰D9(tR＝22.44min)分子离子峰为m/z 358[M+H]⁺。经质谱数据库比对，得到的质谱裂解碎片m/z 340[M+H-18]⁺为脱H₂O所形成，综上所述为宋果灵。

5.1.10附子灵的HPLC-ESI-MS分析

峰D10(tR＝24.54min)分子离子峰为m/z 454[M+H]⁺。经质谱数据库比对，得到的质谱裂解碎片m/z 436[M+H-18]⁺为脱H₂O所形成，综上所述为附子灵。

5.1.11对羟基苯甲醛的HPLC-ESI-MS分析

峰D11(tR＝27.72min)分子离子峰为m/z 123[M+H]⁺。经质谱数据库比对，得到的质谱裂解碎片m/z 95[M+H-28]⁺为脱羰基形成，综上所述为对羟基苯甲醛。

5.1.12补骨脂苷的HPLC-ESI-MS分析

峰D12(tR＝29.12min)分子离子峰为m/z 365[M-H]^-。经质谱数据库比对，得到的质谱裂解碎片m/z 203[M+H-162]⁺为脱去葡萄糖基形成，综上所述为补骨脂苷。

5.1.13异补骨脂苷的HPLC-ESI-MS分析

峰D13(tR＝29.86min)分子离子峰为m/z 365[M-H]^-。得到的质谱裂解碎片m/z203[M+H-162]⁺为脱去葡萄糖基形成，综上所述为异补骨脂苷。5.1.12香兰素的 HPLC-ESI-MS分析

5.1.14香兰素的HPLC-ESI-MS分析峰D14(tR＝30.92min)分子离子峰为m/z 153[M+H]⁺。经质谱数据库比对，得到的质谱裂解碎片m/z 125[M+H-28]⁺为脱羰基形成，综上所述为香兰素。

5.1.15对羟基肉桂酸的HPLC-ESI-MS分析

峰D15(tR＝31.32min)分子离子峰为m/z 165[M+H]⁺。经质谱数据库比对，得到的质谱裂解碎片m/z 147[M+H-18]⁺为脱H₂O形成，综上所述为对羟基肉桂酸。

5.1.16毛蕊异黄酮葡萄糖苷的HPLC-ESI-MS分析

峰D16(tR＝31.95min)分子离子峰为m/z 447[M+H]⁺。经质谱数据库比对，得到的质谱裂解碎片m/z 285[M+H-162]⁺为脱葡萄糖基形成，综上所述为毛蕊异黄酮葡萄糖苷。

5.1.17甘草苷的HPLC-ESI-MS分析

峰D17(tR＝33.20min)分子离子峰为m/z 417[M-H]^-。经质谱数据库比对，得到的质谱裂解碎片m/z 255[M-H-162]^-为脱葡萄糖基形成，综上所述为甘草苷。5.1.18阿魏酸的 HPLC-ESI-MS分析

5.1.18阿魏酸的HPLC-ESI-MS分析

峰D18(tR＝33.59min)分子离子峰为m/z 195[M+H]⁺。经质谱数据库比对，得到的质谱裂解碎片m/z 177[M+H-18]⁺为脱H₂O形成，综上所述为阿魏酸。

5.1.19儿茶素的HPLC-ESI-MS分析

峰D19(tR＝34.24min)分子离子峰为m/z 291[M+H]⁺。经质谱数据库比对，得到的质谱裂解碎片m/z 245[M+H-46]⁺为脱CO和羟基所形成，综上所述为儿茶素。

5.1.20苯甲酰新乌头碱的HPLC-ESI-MS分析

峰D20(tR＝39.01min)分子离子峰为m/z 590[M+H]⁺。经质谱数据库比对，得到的质谱裂解碎片m/z 540[M+H-H₂O-CH₃OH]⁺为脱去1分子H₂O和1分子CH₃OH形成，综上所述为苯甲酰新乌头碱。

5.1.21淫羊藿苷A的HPLC-ESI-MS分析

峰D21(tR＝39.60min)给出分子离子峰为m/z 663[M+H]+。经质谱数据库比对，得到的质谱裂解碎片m/z 355[M+H-308]+为脱鼠李糖基和葡萄糖基形成，综上所为淫羊藿苷A。

5.1.22芒柄花苷的HPLC-ESI-MS分析

峰D22(tR＝43.13min)分子离子峰为m/z 431[M+H]⁺。经质谱数据库比对，得到的质谱裂解碎片m/z 269[M+H-162]⁺为脱去一分子葡萄糖形成，综上所述为芒柄花苷。

5.1.23 1，3-二羟基-2-羟甲基蒽醌的HPLC-ESI-MS分析

峰D23(tR＝44.88min)分子离子峰为m/z 271[M+H]+。经质谱数据库比对，得到的质谱裂解碎片m/z 271[M+H-56]+为脱去两分子CO形成，综上所述为1，3-二羟基-2-羟甲基蒽醌。

5.1.24朝藿定A的HPLC-ESI-MS分析

峰D24(tR＝46.52min)分子离子峰为m/z 839[M+H]⁺。经质谱数据库比对，得到的质谱裂解碎片m/z 369为m/z 839[M+H-3Glu]⁺脱去3分子葡萄糖形成，综上所述为朝藿定A。

5.1.25朝藿定B的HPLC-ESI-MS分析

峰D25(tR＝46.94min)分子离子峰为m/z 809[M+H]⁺。经质谱数据库比对，得到的质谱裂解碎片m/z 369为m/z 809[M+H-3Glu]⁺脱掉3分子葡萄糖基形成的苷元结构，综上所述朝藿定B。

5.1.26朝藿定C的HPLC-ESI-MS分析

峰D26(tR＝47.33min)分子离子峰为m/z 823[M+H]⁺。经质谱数据库比对，得到的质谱裂解碎片m/z 369为m/z 823[M+H-Glu-2Rha]⁺脱去1分子葡萄糖和2分子鼠李糖结构后形成的苷元碎片，综上所述为朝藿定C。

5.1.27淫羊藿苷的HPLC-ESI-MS分析

峰D27(tR＝48.13min)分子离子峰为m/z 677[M+H]⁺。经质谱数据库比对，得到的质谱裂解碎片m/z 369为m/z 677[M+H-Glu-Rha]⁺脱一分子葡萄糖基和一分子鼠李糖基形成，综上所述为淫羊藿苷。

5.1.28 1，3，6-三羟基-2-甲基蒽醌的HPLC-ESI-MS分析

峰D28(tR＝50.24min)分子离子峰为m/z 271[M+H]+。经质谱数据库比对，得到的质谱裂解碎片m/z 255为m/z 271[M+H-56]+脱两分子CO形成，综上所述为1，3，6-三羟基-2- 甲基蒽醌。

5.1.29补骨脂素的HPLC-ESI-MS分析

峰D29(tR＝52.04min)分子离子峰为m/z 187[M+H]⁺。经质谱数据库比对，得到的质谱裂解碎片m/z 143[M+H-44]⁺为脱CO₂形成，综上所述为补骨脂素。

5.1.30异补骨脂素的HPLC-ESI-MS分析

峰D30(tR＝53.11min)分子离子峰为m/z 187[M+H]⁺。经质谱数据库比对，得到的质谱裂解碎片m/z 131为m/z 187[M+H-C₄H₈]⁺脱烷烃基形成，综上所述为异补骨脂素。

5.1.31甘草酸的HPLC-ESI-MS分析

峰D31(tR＝53.95min)分子离子峰为m/z 823[M+H]⁺。经质谱数据库比对，得到的质谱裂解碎片m/z 453为m/z 823[M+H-370]⁺脱去2个葡萄糖醛酸的碎片，综上所述为甘草酸。

5.1.32蒿本内酯的HPLC-ESI-MS分析

峰D32(tR＝56.38min)分子离子峰为m/z 191[M+H]⁺。经质谱数据库比对，得到的质谱裂解碎片m/z 135为m/z 191[M+H-C₄H₈]⁺脱去侧链烷烃结构后的碎片，综上所述为蒿本内酯。

5.1.33淫羊藿次苷I的HPLC-ESI-MS分析

峰D33(tR＝56.80min)分子离子峰为m/z 531[M+H]⁺。经质谱数据库比对，得到的质谱裂解碎片m/z 369为m/z 531[M+H-Glu]⁺脱1分子葡萄糖；碎片m/z 313为m/z 531[M+H-Glu-C₄H₈]⁺，综上所述为淫羊藿次苷I。

5.1.34宝霍苷I的HPLC-ESI-MS分析

峰D34(tR＝58.73min)分子离子峰为m/z 513[M-H]^-。经质谱数据库比对，得到的质谱裂解碎片m/z 366为m/z 513[M-H-Rha]^-脱去1分子鼠李糖碎片，综上所述为宝霍苷I。

5.1.35新补骨脂异黄酮的HPLC-ESI-MS分析

峰D35(tR＝59.92min)分子离子峰为m/z 323[M+H]⁺。经质谱数据库比对，得到的质谱裂解碎片m/z 267为m/z 323[M+H-C₄H₈]⁺所形成的碎片，m/z 255为m/z 323脱去烷烃侧链所形成的碎片，综上所述为新补骨脂异黄酮。

5.1.36补骨脂二氢黄酮的HPLC-ESI-MS分析

峰D36(tR＝60.73min)分子离子峰为m/z 325[M+H]⁺。经质谱数据库比对，得到的质谱裂解碎片m/z 269为m/z 325[M+H-C₄H₈]⁺，m/z 205为m/z325脱去对乙基苯酚结构所得碎片，综上所述为补骨脂二氢黄酮。

5.1.37补骨脂二氢黄酮甲醚的HPLC-ESI-MS分析

峰D37(tR＝61.38min)分子离子峰为m/z 339[M+H]⁺。经质谱数据库比对，得到的质谱裂解碎片m/z 283为m/z 339[M+H-C₄H₈]⁺，综上所述为补骨脂二氢黄酮甲醚。

5.1.38异补骨脂查耳酮的HPLC-ESI-MS分析

峰D38(tR＝63.09min)分子离子峰为m/z 325[M+H]⁺。经质谱数据库比对，得到的质谱裂解碎片m/z 269为m/z 325[M+H-C₄H₈]⁺，综上所述为异补骨脂查耳酮。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims

1.一种生白口服液的对照标准指纹图谱的建立方法，包括如下步骤：

步骤1、供试品溶液的制备：多批次合格的生白口服液置于容量瓶，定容即可；

步骤2、参照物溶液的制备：取对照品淫羊藿苷，定容即可；

步骤3、色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.05-0.2％甲酸水溶液为流动相B；流动相梯度洗脱；检测波长为200～300nm；柱温为25～35℃；流速为0.9ml/min～1.1ml/min；理论板数按淫羊藿苷峰计算应不低于10000；

步骤5、共有峰确认：上述多批次合格生白口服液的色谱图经过计算机模型处理，形成统一一致的色谱图，选择其中峰面积占总峰面积≥0.8％且峰型好、分离度高的色谱峰为共有峰；所述梯度洗脱程序如下表

；

步骤5中所述共有峰共14个，其中峰1亮氨酸、峰2鸟苷、峰3补骨脂苷、峰4异补骨脂苷、峰5毛蕊异黄酮苷峰、峰6甘草苷、峰7淫羊藿苷A、峰8 1，3-二羟基-2-羟甲基蒽醌、峰9朝藿定A、峰10朝藿定B、峰11朝藿定C、峰12淫羊藿苷、峰13 1，3，6-三羟基-2-甲基蒽醌、峰14甘草酸。

2.如权利要求1所述的方法，包括如下步骤：

步骤2、参照物溶液的制备：取对照品淫羊藿苷适量，精密称定，制成每1ml含淫羊藿苷为100μg的对照品溶液，摇匀，即得；

步骤3、色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以含0.1％甲酸水溶液为流动相B，按表进行梯度洗脱；检测波长为270nm；柱温为30℃；流速为1.0ml/min；理论板数按淫羊藿苷峰计算应不低于10000；

步骤5、共有峰确认：上述多批次合格生白口服液的色谱图经过计算机模型处理，形成统一一致的色谱图，其中峰面积占总峰面积≥0.8％且峰型好、分离度高的色谱峰共14个，相对峰面积及相对保留时间如下表

峰号化合物相对峰面积相对保留时间 1 亮氨酸 0.13-0.27 0.120-0.124 2 鸟苷 0.04-0.11 0.163-0.167 3 补骨脂苷 0.11-0.34 0.576-0.582 4 异补骨脂苷 0.09-0.34 0.593-0.599 5 毛蕊异黄酮苷 0.05-0.11 0.638-0.644 6 甘草苷 0.16-0.26 0.661-0.667 7 淫羊藿苷A 0.09-0.12 0.788-0.792 8 1，3-二羟基-2-羟甲基蒽醌 0.17-0.35 0.887-0.894 9 朝藿定A 0.10-0.16 0.944-0.952 10 朝藿定B 0.17-0.26 0.964-0.968 11 朝藿定C 0.49-0.59 0.980-0.981 12 淫羊藿苷 1.00 1.000 13 1，3，6-三羟基-2-甲基蒽醌 0.16-0.24 1.055-1.058 14 甘草酸 0.08-0.14 1.138-1.144

。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生白口服液是由下述重量份原料制成：淫羊藿200-300份、补骨脂100-160份、制附子60-120份、枸杞子200-300份、黄芪200-300份、鸡血藤200-300份、茜草200-300份、当归100-160份、芦根200-300份、麦冬100-160份和甘草100-160份。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生白口服液是通过下述制备方法得到的：

步骤(1)取重量份淫羊藿200-300份、补骨脂100-160份、制附子60-120份、枸杞子200-300份、黄芪200-300份、鸡血藤200-300份、茜草200-300份、当归100-160份、芦根200-300份、麦冬100-160份和甘草100-160份，备用；

步骤(2)先投入处方量中的不含淫羊藿的十味饮片，加水加热煎煮至沸腾，然后投入处方量的淫羊藿，继续加热煮至沸腾，计时提取，滤过，得一次提取滤液，药渣加水再提取一次，滤过得第二次提取滤液，合并两次滤液，浓缩的浸膏I；

步骤(3)将浸膏I∶乙醇＝1∶1-2的85-95％乙醇缓慢加入浸膏I中，边加边搅拌，使浸膏I分散均匀，然后再向其加85-95％乙醇至含醇量60-80％，边加边搅拌，静置，收醇，得生白浸膏；

步骤(4)取药物加纯化水、甜菊素，搅拌，调节pH至5.0-6.0，加热煮沸30-50min，冷藏，取上清液，调节pH值至6.5-7.5，定容，滤过，灌装，灭菌。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(4)取药物加纯化水、甜菊素，搅拌，调节pH至5.0-5.5，加热煮沸30min，冷藏48h，取上清液，调节pH值至7.0-7.3，定容，滤过，灌装，灭菌即可。

6.一种生白口服液的指纹图谱检测方法，包括如下步骤：

(1)将待测品注入超高效液相色谱仪测定，得到待测品溶液色谱图；

(2)将得到的色谱图与对照标准指纹图谱比对，所述的对照标准指纹图谱采用权利要求1所述方法获得，待测品溶液色谱图中应呈现与淫羊藿苷对照品色谱峰保留时间一致的色谱峰，并应出现14个共有峰；按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算0～70分钟的色谱峰，待测品溶液色谱图与对照指纹图谱的相似度不得低于0.85。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述待测品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度不得低于0.9。