CN103304609B - 鱼腥草素杂合黄酮体及其制备方法和用途 - Google Patents
鱼腥草素杂合黄酮体及其制备方法和用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一类鱼腥草素杂合黄酮体及其制备方法和用途。所述的鱼腥草素杂合黄酮体,其结构式如式(I)所示:其中R1为式(II)、式(III)、式(IV)、式(V)、式(VI)、式(VII)、式(VIII)、式(IX)或式(X)所示,R2为氢、式(XI)、式(XII)、式(XIII)或式(XIV)所示。本发明从三白草科植物蕺菜属植物鱼腥草(Houttuynia?cordata?Thunb.)中分离得到12个鱼腥草素杂合黄酮体,其都为结构新颖的呋喃黄酮;运用体外抗单纯疱疹病毒活性筛选体系进行活性评价,发现本发明的鱼腥草素杂合黄酮体能有效地抑制单纯疱疹病毒,表明本发明鱼腥草素杂合黄酮体具有预防和治疗单纯疱疹病毒感染的作用,可以在制备抗单纯疱疹病毒药物中应用,具有良好的研究开发前景。
Description
技术领域:
本发明属于天然产物化学领域,具体涉及一类鱼腥草素杂合黄酮体及其制备方法和用途。
背景技术:
单纯疱疹病毒(HerpesSimplexVirus,简称HSV)是人类最常见的病原体。HSV呈球形,完整病毒由核心、衣壳、被膜及囊膜组成。核心含双股DNA,缠绕成纤丝卷轴。衣壳呈二十面体对称,由162个壳微粒组成,直径为100nm。衣壳外一层被膜覆盖,厚薄不匀,最外层为典型的脂质双层囊膜,上有突起。有囊膜的病毒直径为150~200nm。囊膜表面含gB、gC、gD、gE、gG、gH糖蛋白。HSV基因组为一线性DNA分子,由共价连接的长片段(L)和短片段(S)组成。每片段均含有单一序列和反转重复序列。基因组中有72个基因,共编码70多种各异的蛋白质,其中除24种蛋白的特性还不清楚外,有18种编码蛋白组成病毒DNA结合蛋白及各种酶类,参与病毒DNA合成,包装及核苷酸的代谢等。
单纯疱疹病毒(HSV)主要有两个血清型:HSV-1和HSV-2。HSV-1主要侵犯躯体腰以上部位,可引起口腔、唇、眼、脑及腰以上部位感染,多为隐性感染,并不表现出症状;HSV-2侵犯躯体腰以下部位,主要是生殖器,它是引起性病的主要病原体之一。人类是HSV唯一的自然宿主,该病毒存在于病人、恢复者或者是健康带菌者的水疱疤液、唾液及粪便中,传播方式主要是通过直接接触传染,亦可通过被唾液污染的餐具而间接传染。HSV感染现已成为世界上最常见的通过接触传播侵犯外胚层来源的组织(包括皮肤、黏膜和神经组织)的传染病。
HSV感染是人类的一种常见传染病,其感染部位广泛,常发于癌症或其他慢性病,应用各种免疫抑制剂的病人中。现已证实,HSV感染与先天畸形、流产、宫颈癌、脑炎、新生儿疾病、性病等10多种疾病有关。虽然HSV感染多呈隐形,在过去的10年里,在免疫缺陷病人中感染率越来越高,造成了严重的危害。
从上世纪以来,人们一直在寻找具有抗单纯疱疹病毒感染的药物。抗疱疹病毒药物研究经历了50余年的发展。以碘苷(idoxuridine,IDU)为代表的早期抗疱疹病毒药物,选择性低,对正常细胞毒性大,目前临床上极少用于疱疹感染的治疗。80年代,核苷类药物的出现开创了抗疱疹病毒药物的新时代,阿昔洛韦(Acyclovir,ACV)的研制成功,开辟了抗疱疹病毒治疗的新里程。该药在感染细胞内被疱疹病毒特异性胸苷激酶磷酸化为单磷酸盐,再进一步被细胞核苷激酶转化为二磷酸、三磷酸化合物,模拟核苷酸,对病毒DNA聚合酶产生较强抑制作用。它选择性高,对正常细胞毒性小,是抗单纯疱疹病毒的首选药。但阿昔洛韦口服生物利用度仅为15%~30%,长期使用有一定副作用,可引起接触性皮炎,并可造成病毒胸苷激酶突变,产生耐药株。虽然核苷类药物产生耐药性,但其对单纯疱疹病毒的抑制活性强,停药后不容易复发,且尚未有安全有效的抗单纯疱疹病毒感染的药物问世,目前仍然是临床上抗单纯疱疹病毒感染的主要用药。据文献报道,目前已研发出非核苷类抗疱疹病毒药物(如膦甲酸钠和多可沙诺等)和抗生素类抗疱疹病毒(如fattiviracins和17997)等抗疱疹病毒药物。膦甲酸钠可用于对核苷类药物耐药或过敏的疱疹病毒感染者,也可用于AIDS患者的疱疹病毒感染,但停药后病情会反跳,且不能清除潜伏感染的病毒,在临床上使用较少;fattiviracins是经抗疱疹病毒模型筛选出的广谱抗病毒抗生素,但其体内抗病毒效能尚未得到证实,临床上尚未得到使用。目前临床上仍未有安全有效的抗单纯疱疹病毒的药物,筛选有效的抗单纯疱疹病毒药物势在必行。
尽管国内外研究的抗病毒药物较多,但过渡到临床治疗全身性感染的药物有限,耐药现象严重。开发利用丰富的中草药资源,从中草药寻求更新更好的抗HSV药物已成为当前抗单纯疱疹病毒研究的热点之一。人们对中药的抗病毒作用认识已久,迄今已发现100多种具有抗病毒作用的中草药。目前,在以中医药理论为依据的指导下已经筛选出一批具有较好抗HSV作用的中药。如鸡血藤、大黄、虎杖、黄芪、芍药等中药的提取物或成分均具有良好的抗HSV活性,但其多为中药提取物,其抗病毒机制不清,机理不明,有效成分的分析仍未取得突破性进展,有效成分的确定、结构与功效的关系,有效成分间相互作用尚有待深入研究。因此,采用现代科学手段,以活性追踪为指导,从具有抗单纯疱疹病毒活性的中药寻找具有抗单纯疱疹病毒活性的先导化合物具有深远的研究意义。
鱼腥草(HouttuyniacordataThunb.)为三白草科蕺菜的一种多年生草本植物,又名侧耳根、紫蕺、猪鼻孔、九节莲等,其新鲜植株破碎后有刺鼻的腥臭味,广泛分布于我国中部、东南及西南各省区,为传统的药食两用植物,具有清热解毒、消肿排脓、利尿通淋及止咳化痰等功效,并对多种细菌有抑制作用,为许多治疗流感药物的主药。近年发现其具有抗单纯疱疹病毒的活性。
国内外对鱼腥草的化学成分已有较多研究,但主要集中在对其挥发油成分的研究,非挥发油成分也有报道,主要为黄酮类成分和生物碱类成分。国外学者通过体外细胞实验证实了鱼腥草中黄酮类成分的抗单纯疱疹病毒作用。
发明内容:
本发明的第一个目的是提供一类新的鱼腥草素杂合黄酮体。
本发明的一类鱼腥草素杂合黄酮体,其结构式如式(I)所示:
式(I)
其中R1为式(II)、式(III)、式(IV)、式(V)、式(VI)、式(VII)、式(VIII)、式(IX)或式(X)所示,R2为氢、式(XI)、式(XII)、式(XIII)或式(XIV)所示;
式(II)式(III)
式(IV)式(V)
式(VI)
式(VII)
式(VIII)
式(IX)式(X)
式(XI)式(XII)
式(XIII)式(XIV)。
所述的鱼腥草素杂合黄酮体优选为houttuynoidA,其结构如式1所示、houttuynoidF,其结构如式2所示、houttuynoidB,其结构如式3所示、houttuynoidC,其结构如式4所示、houttuynoidG,其结构如式5所示、houttuynoidH,其结构如式6所示、houttuynoidI,其结构如式7所示、houttuynoidJ,其结构如式8所示、houttuynoidD,其结构如式9所示、houttuynoidE,其结构如式10所示、houttuynoidK,其结构如式11所示或houttuynoidL,其结构如式12所示;
式1式2
式3式4
式5式6
式7式8
式9式10
式11式12。
本发明通过实验发现,本发明的鱼腥草素杂合黄酮体具有良好的抗单纯疱疹病毒体外活性,可用于制备抗单纯疱疹病毒的药物。
因此本发明的第二个目的是提供上述鱼腥草素杂合黄酮体在制备抗单纯疱疹病毒药物中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种抗单纯疱疹病毒药物,其特征在于,该药物以鱼腥草素杂合黄酮体作为活性成份。
本发明的第四个目的是提供鱼腥草(HouttuyniacordataThunb.)用于制备上述鱼腥草素杂合黄酮体的应用。
本发明的第五个目的是提供一种上述鱼腥草素杂合黄酮体的制备方法,其特征在于,上述鱼腥草素杂合黄酮体是从鱼腥草(HouttuyniacordataThunb.)中分离得到的。
本发明人相信,本领域所属的普通技术人员在本发明提示下,用常规的提取、分离手段可以从三白草科植物蕺菜属植物鱼腥草(HouttuyniacordataThunb.)中分离得到。比如采用醇或醇水混合提取,再用层析分离得到化合物。优选,是通过以下方法从鱼腥草(HouttuyniacordataThunb.)中分离得到的上述鱼腥草素杂合黄酮体,具体步骤如下:
取鱼腥草(HouttuyniacordataThunb.)用乙醇水溶液加热回流提取,提取液浓缩得浸膏,浸膏用水或乙醇水溶液悬浮,离心取上清,经大孔吸附树脂柱层析分离,以乙醇-水按体积比从0∶100、20∶80、40∶60、60∶40、80∶20和95∶5作为洗脱剂梯度洗脱,分别收集乙醇-水体积比60∶40洗脱的馏分ZD和体积比80∶20洗脱的馏分ZE,取馏分ZD进行ODS中低压柱层析分离,以甲醇-水按体积比从10∶90、30∶70、50∶50、70∶30、90∶10和100∶0作为洗脱剂梯度洗脱,分别收集甲醇-水体积比70∶30洗脱的馏分ZD-D和体积比90∶10洗脱的馏分ZD-E,馏分ZD-D经凝胶柱层析得粗品,再经高效液相色谱纯化得到化合物1、2、4、5、7、8、9和10;馏分ZD-E经凝胶柱层析得粗品,再经高效液相色谱纯化得到化合物3;馏分ZE经硅胶柱层析分离,以氯仿-甲醇按体积比从100∶0、98∶2、95∶5、93∶7、9∶1、8∶2、7∶3和6∶4作为洗脱剂梯度洗脱,收集氯仿-甲醇体积比为7∶3洗脱下来的馏分ZE-G,再经凝胶柱层析得粗品,再经高效液相色谱纯化得到化合物6、11和12;
所述的化合物1为houttuynoidA,化合物2为houttuynoidF,化合物3为houttuynoidB,化合物4为houttuynoidC,化合物5为houttuynoidG,化合物6为houttuynoidH,化合物7为houttuynoidI,化合物8为houttuynoidJ,化合物9为houttuynoidD,化合物10为houttuynoidE,化合物11为houttuynoidK,化合物12为houttuynoidL。
所述的取鱼腥草(HouttuyniacordataThunb.)用乙醇水溶液加热回流提取,其乙醇水溶液优选为体积分数50%的乙醇水溶液,回流温度优选为20~100℃,提取次数为2~3次,每次提取时间为2小时。
所述的浸膏用水或乙醇水溶液悬浮,其乙醇水溶液体积分数为95%以下的乙醇水溶液。
本发明从三白草科植物蕺菜属植物鱼腥草(HouttuyniacordataThunb.)中分离得到12个鱼腥草素杂合黄酮体,其都为结构新颖的呋喃黄酮;运用体外抗单纯疱疹病毒活性筛选体系进行活性评价,发现本发明的鱼腥草素杂合黄酮体能有效地抑制单纯疱疹病毒,表明本发明鱼腥草素杂合黄酮体具有预防和治疗单纯疱疹病毒感染的作用,可以在制备抗单纯疱疹病毒药物中应用,具有良好的研究开发前景。
附图说明:
图1是鱼腥草素杂合黄酮体的抗单纯疱疹病毒活性检测图,图中未特别标注的化合物的实验浓度都为50uM。
具体实施方式:
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述,但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中,质谱仪为美国Finnigan公司生产的LCQ-Advantage质谱仪。超导核磁共振仪为BrukerAV-400。薄层色谱用硅胶GF254为青岛海洋化工厂产品。反相ODS填料(40-63μm)为美国Merck公司产品。SephadexLH20为Pharmacia公司产品。液相色谱用甲醇为色谱纯,水为双重蒸馏水,其他试剂均为分析纯。超级酶标仪为美国Bio-Tek公司产品。β-Gal活性检测底物chlorophenolred-b-D-galactopyranoside(CPRG)为BoehringerMannheim公司产品。阿昔洛韦(Acyclovir)为美国Sigma公司产品。
实施例1:鱼腥草中鱼腥草素杂合黄酮体的提取分离
取三白草科植物蕺菜属植物鱼腥草(HouttuyniacordataThunb.)5kg,用体积分数50%的乙醇水加热(100℃)回流提取3次,每次2小时,合并提取液,减压浓缩至浸膏状,得到总提取物。对总提取物用8倍量(质量/体积,g/ml)的水溶液进行悬浮,3000rpm离心,取上清液进行大孔吸附树脂(AB-8)柱层析分离,以乙醇-水体积比从0∶100、20∶80、40∶60、60∶40、80∶20和95∶5作为洗脱剂梯度洗脱,分别得到6个馏分ZA至ZF,对馏分ZD(乙醇-水体积比60∶40洗脱的馏分)进行ODS中低压柱色谱分离(5×30cm,Eyela),以甲醇-水体积比从10∶90、30∶70、50∶50、70∶30、90∶10和100∶0作为洗脱剂梯度洗脱,分别得到6个亚馏分ZD-A至ZD-F。亚馏分ZD-D(甲醇-水体积比70∶30洗脱的馏分)经凝胶SephadexLH-20柱层析,以甲醇作为洗脱剂洗脱,再经高效液相色谱制备(仪器:VarianProStar210,色谱柱:WelchUtimateXB-C18(21.2×250mm,5μm)),以体积分数75%甲醇水溶液为流动相,流速为8ml/min,分别得到化合物1(tR=22.5min)、2(tR=8.6min)、4(tR=15.8min)、5(tR=17.7min)、7(tR=37.6min)、8(tR=42.5min)、9(tR=34.9min)和10(tR=39.8min)。
亚馏分ZD-E(甲醇-水体积比90∶10洗脱的馏分)先经凝胶SephadexLH-20柱层析,以甲醇作为洗脱剂洗脱,再经高效液相色谱制备(仪器:VarianProStar210,色谱柱WelchUtimateXB-C18(21.2×250mm,5μm)),以体积分数80%甲醇水为流动相,流速为8ml/min,得到化合物3(tR=42.5min)。
馏分ZE(乙醇-水体积比为80∶20洗脱下来的馏分)先经硅胶(200~300目)柱层析,以氯仿-甲醇按体积比从100∶0、98∶2、93∶7、95∶5、9∶1、8∶2、7∶3和6∶4作为洗脱剂梯度洗脱,得到8个亚馏分ZE-A至ZE-H,亚馏分ZE-G(氯仿-甲醇体积比为7∶3洗脱下来的馏分)先经SephadexLH-20凝胶柱层析,以甲醇作为洗脱剂,再经高效液相色谱制备(仪器:VarianProStar210,色谱柱WelchUtimateXB-C18(21.2×250mm,5μm)),以体积分数85%甲醇水为流动相,流速为8ml/min,得到化合物6(tR=61.4min),化合物11(tR=55.7min)和化合物12(tR=38.5min)。
对化合物1-12进行结构分析,化合物1-12的物理化学常数如下:
HouttuynoidA(化合物1):棕色无定形粉末,盐酸-镁粉反应阳性。UV(MeOH)λmax252.6,346.2nm;IR(KBr)vmax3409,2925,2855,1656,1612,1506,1455,1361,1304,1195,1023,987cm-1;ESI-MS:m/z1307[2M+Na]+,665[M+Na]+,m/z641[M-H]-,1283[2M-H]-.HR-ESI-MS:m/z665.2197[M+Na]+(cacldforC33H38O13Na,665.2205),确定化合物1分子式为C33H38O13;13C和1HNMR数据见表2,其结构式如式1所示。
HouttuynoidF(化合物2):棕色无定形粉末,盐酸-镁粉反应阳性。UV(MeOH)λmax252.2,345.6nm;IR(KBr)vmax3422,2925,2855,1655,1613,1507,1455,1358,1304,1193,1071cm-1;ESI-MS:m/z1399[2M+Na]+,711[M+Na]+,m/z687[M-H]-,1375[2M-H]-.HR-ESI-MS:m/z711.2621[M+Na]+(cacldforC35H44O14Na,711.2629),确定化合物2分子式为C35H44O14;13C和1HNMR数据见表2,其结构式如式2所示。
HouttuynoidB(化合物3):棕色无定形粉末,盐酸-镁粉反应阳性。UV(MeOH)λmax252.2,346.0nm;IR(KBr)vmax3396,2925,2854,1722,1656,1600,1507,1361,1290,1255,1171,1069,1022,929cm-1;ESI-MS:m/z1251[2M+Na]+,637[M+Na]+,613[M-H]-,1227[2M-H]-.HR-ESI-MS:m/z637.2253[M+Na]+(cacldforC32H38O12Na,637.2255),确定化合物3分子式为C32H38O12;13C和1HNMR数据见表3,其结构式如式3所示。
HouttuynoidC(化合物4):棕色无定形粉末,盐酸-镁粉反应阳性。UV(MeOH)λmax254.4,345.8nm;IR(KBr)vmax3423,2924,2855,1650,1600,1506,1455,1363,1304,1195,1066cm-1;ESI-MS:m/z1307[2M+Na]+,665[M+Na]+,m/z641[M-H]-,1283[2M-H]-.HR-ESI-MS:m/z665.2199[M+Na]+(cacldforC33H38O13Na,665.2205),确定化合物4分子式为C33H38O13;13C和1HNMR数据见表3,其结构式如式4所示。
HouttuynoidG(化合物5):棕色无定形粉末,盐酸-镁粉反应阳性。UV(MeOH)λmax238.4,289.6和381.4nm;IR(KBr)vmax3386,2925,2854,1722,1656,1599,1507,1455,1358,1304,1193,1071cm-1;ESI-MS:m/z1315[2M+Na]+,669[M+Na]+,m/z645[M-H]-,1291[2M-H]-.HR-ESI-MS:m/z669.2148[M+Na]+(cacldforC32H38O14Na,669.2154),确定化合物5分子式为C32H38O14;13C和1HNMR数据见表4,其结构式如式5所示。
HouttuynoidH(化合物6):棕色无定形粉末,盐酸-镁粉反应阳性。UV(MeOH)λmax237.6,287.0和376.0nm;IR(KBr)vmax3386,2925,2854,1722,1656,1599,1507,1455,1358,1304,1193,1071cm-1;ESI-MS:m/z1623[2M+Na]+,823[M+Na]+,m/z799[M-H]-,1599[2M-H]-.HR-ESI-MS:m/z823.3503[M+Na]+(cacldforC42H56O15Na,823.3511),确定化合物6分子式为C42H56O15;13C和1HNMR数据见表4,其结构式如式6所示。
HouttuynoidI(化合物7):棕色无定形粉末,盐酸-镁粉反应阳性。UV(MeOH)λmax234.2,289.6和365.8nm;IR(KBr)vmax3386,2925,2854,1722,1656,1599,1507,1455,1358,1304,1193,1071cm-1;ESI-MS:m/z1607[2M+Na]+,815[M+Na]+,m/z791[M-H]-,1583[2M-H]-.HR-ESI-MS:m/z815.2724[M+Na]+(cacldforC38H48O18Na,815.2733),确定化合物7分子式为C38H48O18;13C和1HNMR数据见表5,其结构式如式7所示。
HouttuynoidJ(化合物8):棕色无定形粉末,盐酸-镁粉反应阳性。UV(MeOH)λmax234.2,289.6和365.8nm;IR(KBr)vmax3386,2925,2854,1722,1656,1599,1507,1455,1358,1304,1193,1071cm-1;ESI-MS:m/z1607[2M+Na]+,815[M+Na]+,m/z791[M-H]-,1583[2M-H]-.HR-ESI-MS:m/z793.2919[M+H]+(cacldforC38H49O18,793.2913),确定化合物8分子式为C38H48O18;13C和1HNMR数据见表5,其结构式如式8所示。
HouttuynoidD(化合物9):棕色无定形粉末,盐酸-镁粉反应阳性。UV(MeOH)λmax252.2,345.6nm;IR(KBr)vmax3396,2925,2855,1655,1607,1503,1456,1362,1302,1023cm-1;ESI-MS:m/z1287[2M+Na]+,655[M+Na]+,m/z631[M-H]-,1263[2M-H]-.HR-ESI-MS:m/z655.2367[M+Na]+(cacldforC32H40O13Na,655.2361),确定化合物9分子式为C32H40O13;13C和1HNMR数据见表6,其结构式如式9所示。
HouttuynoidE(化合物10):棕色无定形粉末,盐酸-镁粉反应阳性。UV(MeOH)λmax258.2.2,343.0nm;IR(KBr)vmax3378,2926,2853,1655,1609,1503,1456,1304cm-1;ESI-MS:m/z1287[2M+Na]+,655[M+Na]+,m/z631[M-H]-,1263[2M-H]-.HR-ESI-MS:m/z655.2346[M+Na]+(cacldforC32H40O13Na,655.2361),确定化合物10分子式为C32H40O13;13C和1HNMR数据见表6,其结构式如式10所示。
HouttuynoidK(化合物11):棕色无定形粉末,盐酸-镁粉反应阳性。UV(MeOH)λmax252.6,346.2nm;IR(KBr)vmax3409,2925,2855,1722,1656,1612,1506,1453,1352,1305,1023cm-1;HR-ESI-MS:m/z833.3708[M+Na]+(cacldforC44H58O14Na,833.3719),确定化合物11分子式为C44H58O14;13C和1HNMR数据见表7,其结构式如式11所示。
HouttuynoidL(化合物12):棕色无定形粉末,盐酸-镁粉反应阳性。UV(MeOH)λmax252.2,345.6nm;IR(KBr)vmax3420,2925,2854,1722,1655,1613,1507,1455,1358,1304,1193,1071cm-1;HR-ESI-MS:m/z837.9024[M+Na]+(cacldforC35H44O14Na,837.9042),确定化合物12分子式为C43H58O15;13C和1HNMR数据见表7,其结构式如式12所示。
经SciFinder检索发现,化合物1-12均为未见文献报道的新化合物。
所获得的各化合物的结构如下表1所示。
表1:鱼腥草中分离得到的鱼腥草素杂合黄酮体结构
表2:化合物1-2的碳谱和氢谱数据inDMSO-d6(1Hfor400MHz,13Cfor100MHz)
注:o表示overlapped.
表3:化合物3-4的碳谱和氢谱数据inDMSO-d6(1Hfor400MHz,13Cfor100MHz)
表4:化合物5-6的碳谱和氢谱数据inDMSO-d6(1Hfor400MHz,13Cfor100MHz)
表5:化合物7-8的碳谱和氢谱数据inDMSO-d6(1Hfor400MHz,13Cfor100MHz)
表6:化合物9-10的碳谱和氢谱数据inDMSO-d6(1Hfor400MHz,13Cfor100MHz)
表7:化合物11-12的碳谱和氢谱数据inDMSO-d6(1Hfor400MHz,13Cfor100MHz)
实施例2:鱼腥草素杂合黄酮体抗单纯疱疹病毒活性分析
以下展示了本专利中公开的鱼腥草素杂合黄酮体houttuynoidA(化合物1)、B(化合物3)、C(化合物4)、D(化合物9)、E(化合物10)、F(化合物2)、G(化合物5)、H(化合物6)、I(化合物7)、J(化合物8)、K(化合物11)和L(化合物12)的抗单纯疱疹病毒体外活性,同时展示了黄酮类化合物金丝桃苷(Hyperin)以及芦丁(Rutin),以及阳性对照药物阿昔洛韦(Acyclovir)抗单纯疱疹病毒体外活性。
具体方法如下:在细胞培养板内长成单层的Vero细胞中同时加入50ul的0.5MOI的HSV/Blue(带有lacZ基因编码框的重组报告病毒)病毒液和50ul被DMSO稀释至50uM的样品液。同时设DMSO平衡浓度的溶剂对照,不加样品的对照及细胞空白对照。培养24h后,检测β-Gal活性。检测β-Gal活性的方法如下:吸弃样品与病毒的混合液,每孔加入100ul1%NonidetP-40细胞裂解液,放置5~10min后每孔吸取50ul裂解物加到96孔酶标板上,随后加入50ul的β-Gal活性检测底物CPRG缓冲液,轻轻振动混匀,在超级酶标仪上进行570nm动态光吸收的测定。测定条件为37℃,测570nm光吸收值,每2min读数一次,连续25次读数,中途振荡。根据β-Gal测量值,按照如下公式计算每个浓度样品对病毒的抑制率:抑制率=(溶剂对照孔测量值-样品孔测量值)/(溶剂对照孔测量值-细胞空白对照孔测量值)×100%。结果如图1所示,由图1可以看出,本发明的12种鱼腥草素杂合黄酮体都具有抗单纯疱疹病毒的体外活性,而黄酮类化合物金丝桃苷(Hyperin)及芦丁(Rutin)并没有显示出良好的抗单纯疱疹病毒的体外活性,因此本发明的12种鱼腥草素杂合黄酮体可应用制备抗单纯疱疹病毒药物。
目前,具有与本专利公开的新化合物相似结构的槲皮素及其糖苷,如金丝桃苷,异槲皮苷,芦丁等黄酮类的抗单纯疱疹病毒活性已有报道[(1)Suarez,B.;Alvarez,A.L.;etal.FoodChemistry,2010,120,339-342.(2)Mori,N.;Tadano,M.;etal.Bidensplantenzyme-treatedproductsasantiviralagentsagainstresistantHSV1.2011,A20111027.(3)Lyu,S.Y.;Rhim,J.Y.;etal.ArchivesofPharmacalResearch,2005,28(11),1293-1301.]。本专利中所采用的单纯疱疹病毒活性分析方法是一种基于重组报告病毒HSV/blue活性检测的方法(具体方法如上),该方法覆盖了化合物作用于单纯疱疹病毒感染的全过程,可以有效地检测化合物抗单纯疱疹病毒的活性,是一个全面的分析系统。具体可参考:[(4)Dicker,I.B.;Blasecki,J.W.;Seetharam,S.AntiviralResearch,1995,28(3),213-224.(5)Tao,P.VirologicaSinica,2010,25(4),281-293.(6)Zhu,Q.C.,Y.Wang,etal.JournalofBiomolecularScreening,2010,15(8),1016-1020.]。根据报道,该方法还可以用于单纯疱疹病毒感染早期吸附及进入阶段的分析,这对于判断化合物是否能够预防单纯疱疹病毒感染具有很好的指示作用[(6)Zhu,Q.C.,Y.Wang,etal.JournalofBiomolecularScreening,2010,15(8),1016-1020.(7)彭涛,朱钦昌。一种抗疱疹病毒药物作用机制的分析方法[P]。中国专利:200810198226.1,2009-04-15]。利用上述方法分析发现,在相同实验条件下,本专利公开的新化合物鱼腥草素杂合黄酮体抗单纯疱疹病毒的活性要显著地优于与其相似结构的黄酮类化合物:金丝桃苷及芦丁,从化合物开发的功能性角度来看,本专利公开的新化合物鱼腥草素杂合黄酮体更具有应用前景以及开发成为抗单纯疱疹病毒药物的价值。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一类鱼腥草素杂合黄酮体,其结构式如式(Ⅰ)所示:
其为houttuynoidA,其R1为式(Ⅱ),R2为式(Ⅺ);
或houttuynoidF,其R1为式(Ⅲ),R2为式(Ⅺ);
或houttuynoidB,其R1为式(Ⅳ),R2为式(Ⅺ);
或houttuynoidC,其R1为式(Ⅴ),R2为式(Ⅺ);
或houttuynoidG,其R1为式(Ⅵ),R2为式(Ⅺ);
或houttuynoidH,其R1为式(Ⅵ),R2为式(Ⅻ);
或houttuynoidI,其R1为式(Ⅵ),R2为式(ⅩⅢ);
或houttuynoidJ,其R1为式(Ⅵ),R2为式(ⅩⅣ);
或houttuynoidD,其R1为式(Ⅸ),R2为式(Ⅺ);
或houttuynoidE,其R1为式(Ⅹ),R2为式(Ⅺ);
或houttuynoidK,其R1为式(Ⅶ),R2为式(Ⅺ);
或houttuynoidL,其R1为式(Ⅷ),R2为式(Ⅺ);
2.权利要求1所述的鱼腥草素杂合黄酮体在制备抗单纯疱疹病毒药物中的应用。
3.一种抗单纯疱疹病毒药物,其特征在于,该药物以权利要求1所述的鱼腥草素杂合黄酮体作为活性成份。
4.鱼腥草(HouttuyniacordataThunb.)在制备权利要求1所述的鱼腥草素杂合黄酮体中的应用。
5.一种权利要求1所述的鱼腥草素杂合黄酮体的制备方法,其特征在于,是通过以下方法从鱼腥草(HouttuyniacordataThunb.)中分离得到的鱼腥草素杂合黄酮体,具体步骤如下:
取鱼腥草(HouttuyniacordataThunb.)用乙醇水溶液加热回流提取,提取液浓缩得浸膏,浸膏用水或乙醇水溶液悬浮,离心取上清,经大孔吸附树脂柱层析分离,以乙醇-水按体积比从0:100、20:80、40:60、60:40、80:20和95:5作为洗脱剂梯度洗脱,分别收集乙醇-水体积比60:40洗脱的馏分ZD和体积比80:20洗脱的馏分ZE,取馏分ZD进行ODS中低压柱层析分离,以甲醇-水按体积比从10:90、30:70、50:50、70:30、90:10和100:0作为洗脱剂梯度洗脱,分别收集甲醇-水体积比70:30洗脱的馏分ZD-D和体积比90:10洗脱的馏分ZD-E,馏分ZD-D经凝胶柱层析得粗品,再经高效液相色谱纯化得到化合物1、2、4、5、7、8、9和10;馏分ZD-E经凝胶柱层析得粗品,再经高效液相色谱纯化得到化合物3;馏分ZE经硅胶柱层析分离,以氯仿-甲醇按体积比从100:0、98:2、95:5、93:7、9:1、8:2、7:3和6:4作为洗脱剂梯度洗脱,收集氯仿-甲醇体积比为7:3洗脱下来的馏分ZE-G,再经凝胶柱层析得粗品,再经高效液相色谱纯化得到化合物6、11和12;
所述的化合物1为houttuynoidA,化合物2为houttuynoidF,化合物3为houttuynoidB,化合物4为houttuynoidC,化合物5为houttuynoidG,化合物6为houttuynoidH,化合物7为houttuynoidI,化合物8为houttuynoidJ,化合物9为houttuynoidD,化合物10为houttuynoidE,化合物11为houttuynoidK,化合物12为houttuynoidL。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,所述的取鱼腥草(HouttuyniacordataThunb.)用乙醇水溶液加热回流提取,其乙醇水溶液体积分数为50%的乙醇水溶液,回流温度为20~100℃,提取次数为2~3次,每次提取时间为2小时。
7.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,所述的浸膏用水或乙醇水溶液悬浮,其乙醇水溶液体积分数为95%以下的乙醇水溶液。
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