CN102727653B - 防治急性冠脉综合征的药物组合物的制备方法及其活性部位 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种从中药组合物中提取活性部位的方法，包括将原料药金银花、玄参、当归、甘草按照重量比2.5～4∶2.5～4∶1.5～2.5∶0.5～1.5的比例混匀后乙醇提取，得到提取液和残渣；所得提取液浓缩后上大孔树脂，分别采用水、30％乙醇、60％乙醇和95％乙醇作为洗脱液进行连续淋洗，分别得到第1～4提取物；残渣用水提取后得到第5提取物；第5提取物上大孔树脂，采用水、55％乙醇和95％乙醇作为洗脱液进行连续淋洗，分别得到第6提取物、第7提取物和第8提取物。本发明所提供的制备方法得到的提取物1～8，经实验验证对急性冠脉综合征均具有预防或治疗作用。此外，还提供了在上述制备过程中得到的一组有效部位。

Description

防治急性冠脉综合征的药物组合物的制备方法及其活性部位

技术领域

本发明涉及一种预防和治疗急性冠脉综合征的药物组合物，尤其是涉及这种组合物的现代剂型的制备方法和制备过程中得到的一组活性部位。

背景技术

急性冠脉综合征(ACS)是一组由急性心肌缺血引起的临床综合征，包括急性心肌梗死(AMI)及不稳定型心绞痛(UA)，是严重危害人类健康的重大、常见疾病。凝血功能激活和易损斑块炎症反应在ACS的发生中起着重要作用，是两个核心病理环节。目前抗凝和抗血小板治疗研究较为深入，临床应用广泛；而在控制炎症反应、稳定易损斑块的治疗上缺乏有效手段。

中医药在急性冠脉综合征的治疗上，特别是抑制动脉粥样硬化炎症反应、稳定斑块、减少严重心脑血管事件方面，显示了巨大潜力。

四妙勇安汤由金银花、玄参、当归、生甘草组成，具有显著解毒活血定痛的作用，传统用于下肢动脉闭塞症和脉管炎的治疗。目前，关于该方在冠心病治疗方面的临床疗效及其抑制炎症反应、稳定动脉粥样硬化易损斑块的药理作用方面的报道已有一些。但因为原方用药量过大，煎煮麻烦，给临床用药和新药开发带来难度。

因此，需要发现“四妙勇安汤”新剂型的制备方法和药效学物质基础，发现该经典名方的活性靶点所在，研制出药效物质清楚、作用环节明确、安全高效、质量可控的治疗急性冠脉综合征的现代中药。

发明内容

本发明的目的在于提供一种药效物质清楚、作用环节明确、安全高效、质量可控的对急性冠脉综合征具有预防或治疗作用的药物组合物的制备方法。

进一步地，本发明还提供了在该制备过程中所得到的、具有显著抑制动脉粥样斑块炎症反应作用的一组有效部位。

为了实现上述至少一个发明目的，本发明首先提供了一种对急性冠脉综合征具有预防或治疗作用的药物组合物的制备方法，包括如下步骤：

a)将原料药金银花、玄参、当归、甘草按照重量比2.5～4∶2.5～4∶1.5～2.5∶0.5～1.5的比例混匀；b)将所述原料药中加入40～60％的乙醇作为提取溶剂，所述原料药与所述提取溶剂的固液比为1∶5～10，提取2次以上，每次1.5～4.5小时，过滤后合并滤液，得到提取液和残渣；c)将所述提取液浓缩至干，后加水混悬，上大孔树脂，分别采用水、30％乙醇、60％乙醇和95％乙醇作为洗脱液进行连续淋洗，分别得到第1提取物、第2提取物、第3提取物和第4提取物；d)将所述残渣用水提取2～3次，每次1～2小时，得到第5提取物；以及，e)将所述第5提取物浓缩至干，后加水混悬，上大孔树脂，采用水、55％乙醇和95％乙醇作为洗脱液进行连续淋洗，分别得到第6提取物、第7提取物和第8提取物。

根据本发明的实施方式之一，原料药中金银花、玄参、当归、甘草的优选重量比为3∶3∶2∶1。这既是临床经验的总结，同时又是经过实验验证的有效配比。

根据本发明的另一实施方式，提取的步骤b)中乙醇的浓度为55％。

根据本发明的实施方式之一，步骤b)中固液比为优选为1∶6～8。

根据本发明的实施方式之一，步骤b)中的提取次数为4次。

根据本发明的实施方式之一，步骤b)中的提取时间为2～4小时。

根据本发明的实施方式之一，本制备方法中所采用的大孔树脂为苯乙烯型弱极性共聚物，优选为AB-8大孔树脂。

优选地，本发明所提供的一种对急性冠脉综合征具有预防或治疗作用的药物组合物的制备方法，包括如下步骤：a)将原料药金银花、玄参、当归、甘草按照重量比3∶3∶2∶1的比例混匀；b)将所述原料药中加入55％的乙醇作为提取溶剂，所述原料药与所述提取溶剂的固液比为1∶8，提取4次，每次2小时，过滤后合并滤液，得到提取液和残渣；c)将所述提取液浓缩至干，后加水混悬，上AB-8大孔树脂，分别采用水、30％乙醇、60％乙醇和95％乙醇作为洗脱液进行连续淋洗，分别得到第1提取物、第2提取物、第3提取物和第4提取物；d)将所述残渣用水提取2次，每次1.5小时，得到第5提取物；以及，e)将所述第5提取物浓缩至干，后加水混悬，上AB-8大孔树脂，分别采用水、55％乙醇和95％乙醇作为洗脱液进行连续淋洗，分别得到第6提取物、第7提取物和第8提取物。

以上所述本发明所提供的制备方法及其优选方案，是发明人在多年医疗实践的基础上摸索而成，并经过实验验证的、针对传统名方四妙勇安汤的新剂型的提取加工工艺。

采用本发明所提供的制备方法得到的提取物1～8，经分子水平实验验证对急性冠脉综合征的病理靶点均具有预防或治疗作用。经发明人在实验中，采用NF-κB反应原件结合抑制剂筛选模型和过氧化物酶增殖剂受体(PPARγ)激动剂筛选模型，对这些提取物的抑制炎症反应的作用进行验证，证实它们均有不同程度的抑制动脉粥样斑块炎症反应的作用。

NF-κB过度活化可引起多种病理反应，特别是和多种炎症反应相关，其中激活动脉粥样斑块炎症反应也是其中之一。NF-κB多以p50或p52结合p65亚基的形式存在，活化后p65亚基与IκB解离，由胞浆转位进入胞核，与靶基因上的反应原件(RE)结合，调节目的基因的表达。因此，NF-κB转位后早期基因表达的阻断策略为抑制其病理信号通路的关键靶点。发明人利用分子克隆技术，以人脐静脉内皮细胞cDNA为模板，扩增NF-κB-RE基因，克隆至pGL4.32真核表达载体中，经转染，导入293A细胞内，经Hygromycin筛选、传代，建立了稳定表达NF-κB-RE的细胞系(pGL4.32[luc2P/NF-kappaB-RE]293A)。该模型可直接通过荧光素酶检测试剂检测荧光素酶光化学值的变化，用于进行NF-κB抑制剂的高通量筛选。经验证，确定第1、2、3、5、6、7提取物对NF-κB通路具有阻断作用，能够通过抑制早期基因表达而抑制该病理信号通路。

过氧化物酶增殖剂受体(PPAR)是配体激活的转录因子核受体超家族成员之一。目前已知其三个亚型：PPARα，-β/δ和-γ。过氧化物酶增殖剂受体γ(PPAR γ)能影响NF-κB、信号转录子、激活蛋白-1介导的信号通路，通过抑制这些途径的激活达到抑制靶基因启动子激活和转录的目的。PPARγ的N端功能区含有一个能被有丝分裂原激活的蛋白激酶磷酸化位点，若该区域突变或在磷蛋白磷酸酶共同作用下则不能产生磷酸化而使其活化。配体与PPARγ结合并使之激活后，与视黄醛X受体α(retinoid X receptorα，RXRα)形成异二聚体，再结合于特异性DNA序列而使靶基因活化，此序列称为PPAR特异性反应元件(peroxisomeproliferator responsive element，PPRE)。含有PPRE结构的基因包括已酰辅酶A合成酶、脂蛋白脂肪酶(LPL)、胰岛素受体底物-2(IRS-2)、瘦素以及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等。PPARγ通过调节相关基因的表达，在脂肪形成、糖脂代谢，以及在免疫系统中发挥重要作用，并与多种疾病如糖尿病、肥胖、高血压、癌症等的发生、发展有关。尤其是PPARγ是脂肪细胞分化过程中的关键因子，近年来备受关注。PPARγ成为了肥胖，高血压，动脉粥样硬化的治疗靶点。发明人以PPARγ为靶位筛选其激动剂，发现第3、4、7、8提取物均有明显的PPARγ激动剂效果，其中第3提取物和第7提取物在0.1mg/ml时的有效率分别为100％与32％，第4提取物和第8提取物在0.01mg/ml时的有效率分别为90％与38％；而第1、2、6提取物的有效率均低于60％；第5提取物未发现PPARγ激动活性。

根据实验结果，可见利用本发明所提供的制备方法得到的第1～8提取物，均有不同程度的促进活化的过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)表达和/或抑制核转录因子κB(NF-κB)表达。其中，以促进PPAR-γ表达的作用最为显著，例如第4提取物，小剂量即可引起高达90％的有效率。因而，根据临床实际的用药需要，将这些提取物进行有选择地、任意比例的组合，即可以得到安全高效、质量可控的对急性冠脉综合征具有预防或治疗作用的药物组合物。例如分别选择第2、3、4提取物69g、13.5g和25.8g进行混合；或者分别选择第1、2、3、4提取物10g、10g、12.8g和6g进行混合；还可以选择第4、5、6、7提取物8g、18g、22g、45g进行混合。

根据本发明的另一方面，本发明还提供了在上述制备过程中得到的一组对急性冠脉综合征具有预防或治疗作用的中药组合物活性成分，即有效(活性)部位。

本发明提供的有效部位之一，其制备方法为：a’)将原料药金银花、玄参、当归、甘草按照3∶3∶2∶1的比例混匀；b’)将原料药中加入55％的乙醇作为提取溶剂，所述原料药与所述提取溶剂的固液比为1∶8，提取4次，每次2小时，过滤后合并滤液，得到提取液；以及c’)将所述提取液浓缩至干，后加水混悬，上AB-8大孔树脂，采用30％乙醇作为洗脱液，得到30％乙醇淋洗物，即为所述有效部位。经过实验验证，该提取物对NF-κB信号通路具有阻断作用，IC₅₀为31.61μg/ml。

本发明提供的另一有效部位，其制备方法为：a”)将原料药金银花、玄参、当归、甘草按照3∶3∶2∶1的比例混匀；b”)将原料药中加入55％的乙醇作为提取溶剂，所述原料药与所述提取溶剂的固液比为1∶8，每次2小时，提取4次，过滤后合并滤液，得到提取液；以及c”)将所述提取液浓缩至干，后加水混悬，上AB-8大孔树脂，采用60％乙醇作为洗脱液，得到60％乙醇淋洗物，即为所述有效部位。经过实验验证，该提取物对NF-κB信号通路具有阻断作用，IC₅₀为32.49μg/ml；并有明显的PPARγ激动剂效果，0.1mg/ml时的有效率为100％。

本发明提供的再一有效部位，其制备方法为：a”’)将原料药金银花、玄参、当归、甘草按照3∶3∶2∶1的比例混匀；b”’)将原料药中加入55％的乙醇作为提取溶剂，所述原料药与所述提取溶剂的固液比为1∶8，提取4次，每次2小时，过滤后合并滤液，得到提取液；以及c”’)将所述提取液浓缩至干，后加水混悬，上AB-8大孔树脂，采用95％乙醇作为洗脱液，得到95％乙醇淋洗物，即为所述有效部位。经过实验验证，该提取物有非常明显的PPARγ激动剂效果，0.01mg/ml时的有效率为90％。

以上三组有效部位，均是在本发明所提供的制备工艺的过程中所得到的、对动脉粥样斑块炎症反应具有显著抑制作用的物质。发明人经药理实验证实，它们作用的机理均为不同程度地促进活化的过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)表达和/或抑制核转录因子κB(NF-κB)表达。

本发明附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从下面结合附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1为根据本发明实施方式之一所提供的制备方法工艺流程图；

图2-10为本发明所提供的不同提取条件下、所得药物组合物的HPLC图谱，图2-10分别对应实验例一中的“试验号”1-9；

图11-13为本发明所提供的药物组合物用于PPARγ激动模型的初筛结果；

图14-15为本发明所提供的药物组合物用于PPARγ激动模型的复筛结果。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能解释为对本发明的限制。

实验例一提取工艺优化研究

1、试验方法

(1)提取方法：称取原料药四味共10.8g左右，其重量比例为金银花∶玄参∶当归∶甘草＝3∶3∶2∶1，按照正交试验表选定的因素和水平进行提取。

(2)提取条件的选择：根据中药中化合物的存在特点，选择水和乙醇为提取溶剂，对乙醇浓度、用量、提取时间、提取次数四个因素进行考察，每个因素限定三个水平，具体内容见表1。

表1因素水平表

水平	A乙醇浓度(％)	B提取时间(h)	C固液比	D提取次数
					1	0	2	1∶6	2
2	55	3	1∶8	3
					3	95	4	1∶10	4

(3)分离步骤和检测指标：

分离的步骤见附图1。如图所示，在采用特定浓度的乙醇提取之后得到提取液和残渣，分别对两者进行大孔树脂分离的步骤，得到不同部位的提取物1～8，合并提取物之后，计算出总的提取率。并对总提取物进行HPLC检测。

HPLC检测方法：Hypersil ODS2色谱柱(250mm 4.6mm i.d.，5m，大连依利特分析仪器有限公司)；流动相：A为乙腈，B为去离子水；流动相梯度：0～50min(0％～100％A)，50～60min(100％A)；流速：1.0mL·min-1；检测波长：254nm；进样量：20μL。

以总提取率及HPLC检测图谱的出峰率为指标，验证不同提取条件的效果。

2、结论

实验结果见表2，各试验经HPLC后得到的图谱如附图2-10所示。

(1)最佳条件的测定：由表2中可以看出，在提取率指标方面，各因素的最优组合确定为A₂B₁C₂D₃即为8倍量55％乙醇，提取次数为4次，每次提取时间为2小时。通过图谱分析也可以看到，试验号1所对应的HPLC图谱，即因素A₂B₁C₂D₃组合提取的样品中有效峰的数量最多(参见附图2)。所以本实验确定四妙勇安汤的提取最优条件是8倍量55％乙醇，提取次数为4次，每次提取时间为2小时。

表2正交试验结果表

(2)其他条件下的测定：参见表2及附图3-10，综合两者来看，当提取乙醇浓度被选择为95％时(试验号5、6、8)，其提取率相对较低，并且各自对应的HPLC图谱(参见附图6、7、9)中有效峰的数量也较少，因此提取时乙醇的浓度过高不利于有效成分的保留。从表2中的数据还可以看出，提取次数(因素D)被确定为2次时(试验号7、8、9)，提取率会明显低于其他，因此提取次数最好在2次以上，才能有利于有效成分的充分溶出。

实验例二提取物对NF-κB反应原件的结合抑制作用

1、实验步骤

(1)实验材料：NF-κB-RE细胞(pGL4.32[luc2P/NF-kappaB-RE]293A，中国医学科学院药物研究所)，MEM-α培养基(Gibco)，胎牛血清(Gibco)，96孔培养板(Costar，3599)，Bright-Glo Luciferase荧光素酶检测试剂(Promaga)，水套式CO2细胞培养箱(Sanyo，日本)，Safire2高速多通道连续波长酶标仪(TECAN，奥地利)，EnSpire^TM 2300MultilabelReader(PerkinElmer公司)。

(2)检测样品：

采用实施例1所述方法所得提取物8个，由北京中医药大学提供。

(3)实验步骤：

将培养瓶内对数生长的NF-κB-RE细胞消化并计数，以100ul体系、5×10³/well的密度接种于96孔白色培养板中，孵育18-24h。对照组换以无血清MEM-α培养基；待筛样品于18h后以100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、10μg/ml、5μg/ml的浓度同时加入，然后与细胞共同孵育12h。样品作用结束后，于室温放置30min，吸弃原培养基，每孔加入50μl Bright-GloLuciferase荧光素酶检测试剂，室温避光震荡5min，置于光化学检测仪中，选择ONE-Glo程序进行检测。

该模型以荧光素酶光化学值的变化直接指示样品对NF-κB-RE是否有阻断作用。因此，通过计算抑制率，可确定样品在NF-κB信号通路中对早期基因表达阻断作用的强弱。

2、实验结果

详细结果见表3所示。第1、2、3、5、6、7提取物对NF-κB信号通路具有阻断作用，能够通过抑制早期基因表达而抑制该病理信号通路。第1、2、3、5、6、7提取物的IC₅₀分别为35.38μg/ml、31.61μg/ml、32.49μg/ml、66.53μg/ml、46.14μg/ml、42.06μg/ml。(注：8号提取物在100μg/m和50μg/ml时出现细胞毒性作用，故计算浓度未高于50μg/ml。)

表3提取物对NF-κB反应原件结合抑制剂筛选模型的作用

(数据以mean±SEM表示，n＝3)

3、分析

核转录因子κB(NF-κB)的活化是不稳定型心绞痛易损斑块炎症反应的核心病理环节，其多以p50或p52结合p65亚基的形式存在，活化后p65亚基与IκB解离，由胞浆转位进入胞核，与靶基因上的反应原件(RE)结合，调节目的基因的表达，如细胞因子、趋化因子、粘附因子、基质金属蛋白酶、一氧化氮合酶等，产生的大量炎症因子造成对血管的损伤，加重粥样斑块的形成、促使斑块破裂。因此，抑制NF-κB基因表达是有效保护血管损伤的关键。

本实验研究表明，本发明提供的药物组合物的抑制NF-κB信号通路的有效部位，分别为部位1、2、3、5、6、7；且有效部位1(35.38μg/ml)、2(31.61μg/ml)、3(32.49μg/ml)的IC50值较低，表明抑制效果最好。

实验例三提取物对过氧化物酶增殖剂受体(PPARγ)的激动作用

1材料

1.1试剂：

非洲绿猿猴肾细胞(CV-1)，PPRE质粒，PPAR质粒，RXRα质粒，MEM-α培养基(Gibco)，胎牛血清(Gibco公司)，Bright-Glo Luciferase荧光素酶检测试剂(Promega公司)，罗格列酮。

1.2仪器：

水套式CO₂细胞培养箱(Sanyo，日本)，EnSpireTM 2300MultilabelReader(PerkinElmer公司)。

2方法

2.1供试品的提取

采用实施例1所述方法所得提取物8个，编号为1^#-8^#，由北京中医药大学提供。

2.2细胞培养

非洲绿猿猴肾细胞(CV-1)使用加有10％FBS和1％抗生素(青霉素/链霉素)的DMEM培养基在5％CO2培养箱37℃中培养。

2.3转染及荧光素酶基因表达水平检测

将含有PPAR靶序列反应元件的PPRE荧光素酶报告基因质粒与PPARγ以及RXRα质粒共转染入非洲绿猿猴肾细胞(CV-1)中，转染24小时后，以30000cells/well铺板，4小时后加入阳性药以及待测化合物，以罗格列酮(Rosiglitazone)为激动剂阳性对照物，在二氧化碳培养箱中培养24小时后检测荧光素酶基因表达水平。初筛：化合物均以1mg/ml作为初筛起始浓度，10倍稀释3-4个浓度。复筛：选取初筛有活性趋势的化合物做剂量依赖性曲线，计算EC₅₀值以及相对活性％。

3实验结果

初筛结果：见附图11-13。

复筛结果：见附图14-15。

结果汇总见表4，如表所示：以20μM罗格列酮(Rosiglitazone)所诱导的报告基因活性为100％；化合物在1mg/ml时的相对活性％以及EC₅₀(mg/ml)：

表4

NA：无活性(not active)

结果显示：

1.激动模型中，以1mg/ml作为起始浓度，化合物1^#，2^#，6^#未见细胞毒，Efficacy％(相对活性％)均＜60％；5^#无活性。

2.化合物3^#，7^#在1mg/ml均见明显细胞毒，0.1mg/ml时的Efficacy％分别为100％与32％。

3.化合物4^#，8^#在1，0.1mg/ml均见明显细胞毒，0.01mg/ml时的Efficacy％分别为90％与38％。

3讨论：

PPAR γ通过多种信号通路，可以抑制动脉粥样硬化(AS)斑块促炎因子的表达，减轻免疫和炎症反应，抑制单核细胞/巨噬细胞向泡沫细胞转化等，从而延缓AS发展，稳定斑块，防止破裂。PPARγ已经成为抗AS新药开发的新靶点。PPARγ是抑制炎症反应的关键环节。

实验研究发现阳性对照药物20μM罗格列酮(Rosiglitazone)所诱导的报告基因活性为100％，具有明显的激活作用。研究建立的激动模型中，本发明提供的第3提取物、在0.1mg/ml时的相对活性为100％，第4提取物在0.01mg/ml时相对活性的为90％。

实施例一

将原料药金银花3.6g、玄参3.6g、当归2.4g、甘草1.2g，粉碎后混合均匀，加入8倍量55％的乙醇，提取4次，每次2小时。提取完毕后合并滤液，得到55％乙醇提取液和残渣。

将55％乙醇提取液浓缩至干，后加水混悬，上AB-8大孔树脂，分别采用水、30％乙醇、60％乙醇和95％乙醇作为洗脱液进行连续淋洗，分别得到第1提取物、第2提取物、第3提取物和第4提取物。

将第一步所得残渣用水提取2次，每次1.5小时，得到第5提取物。

将第5提取物浓缩至干，后加水混悬，上AB-8大孔树脂，分别采用水、55％乙醇和95％乙醇作为洗脱液进行连续淋洗，分别得到第6提取物、第7提取物和第8提取物。

实施例二

将原料药金银花7.5g、玄参7.5g、当归4.5g、甘草1.5g，粉碎后混合均匀，加入5倍量的40％乙醇，提取3次，每次1.5小时。提取完毕后合并滤液，得到40％乙醇提取液和残渣。

将40％乙醇提取液浓缩至干，后加水混悬，上AB-8大孔树脂，分别采用水、30％乙醇、60％乙醇和95％乙醇作为洗脱液进行连续淋洗，分别得到第1提取物、第2提取物、第3提取物和第4提取物。

将第一步所得残渣用水提取3次，每次1小时，得到第5提取物。

将第5提取物浓缩至干，后加水混悬，上AB-8大孔树脂，分别采用水、55％乙醇和95％乙醇作为洗脱液进行连续淋洗，分别得到第6提取物、第7提取物和第8提取物。

实施例三

将原料药金银花12g、玄参12g、当归7.5g、甘草4.5g，粉碎后混合均匀，加入10倍量的60％乙醇，提取2次，每次4.5小时。提取完毕后合并滤液，得到60％乙醇提取液和残渣。

将60％乙醇提取液浓缩至干，后加水混悬，上AB-8大孔树脂，分别采用水、30％乙醇、60％乙醇和95％乙醇作为洗脱液进行连续淋洗，分别得到第1提取物、第2提取物、第3提取物和第4提取物。

将第一步所得残渣用水提取2次，每次2小时，得到第5提取物。

将第5提取物浓缩至干，后加水混悬，上AB-8大孔树脂，分别采用水、55％乙醇和95％乙醇作为洗脱液进行连续淋洗，分别得到第6提取物、第7提取物和第8提取物。

实施例四

将原料药金银花11.4g、玄参8.4g、当归5.7g、甘草3.9g，粉碎后混合均匀，加入7倍量的58％乙醇，提取4次，每次2小时。提取完毕后合并滤液，得到58％乙醇提取液和残渣。

将58％乙醇提取液浓缩至干，后加水混悬，上AB-8大孔树脂，分别采用水、30％乙醇、60％乙醇和95％乙醇作为洗脱液进行连续淋洗，分别得到第1提取物、第2提取物、第3提取物和第4提取物。

将第一步所得残渣用水提取2次，每次1.5小时，得到第5提取物。

将第5提取物浓缩至干，后加水混悬，上AB-8大孔树脂，分别采用水、55％乙醇和95％乙醇作为洗脱液进行连续淋洗，分别得到第6提取物、第7提取物和第8提取物。

实施例五

将原料药金银花8.1g、玄参10.8g、当归6.9g、甘草2.4g，粉碎后混合均匀，加入6倍量的50％乙醇，提取5次，每次2.5小时。提取完毕后合并滤液，得到50％乙醇提取液和残渣。

将50％乙醇提取液浓缩至干，后加水混悬，上AB-8大孔树脂，分别采用水、30％乙醇、60％乙醇和95％乙醇作为洗脱液进行连续淋洗，分别得到第1提取物、第2提取物、第3提取物和第4提取物。

将第一步所得残渣用水提取3次，每次1.5小时，得到第5提取物。

将第5提取物浓缩至干，后加水混悬，上AB-8大孔树脂，分别采用水、55％乙醇和95％乙醇作为洗脱液进行连续淋洗，分别得到第6提取物、第7提取物和第8提取物。

实施例六

将原料药金银花9.9g、玄参9.9g、当归6g、甘草3g，粉碎后混合均匀，加入8倍量的45％乙醇，提取4次，每次4小时。提取完毕后合并滤液，得到45％乙醇提取液和残渣。

将45％乙醇提取液浓缩至干，后加水混悬，上AB-8大孔树脂，分别采用水、30％乙醇、60％乙醇和95％乙醇作为洗脱液进行连续淋洗，分别得到第1提取物、第2提取物、第3提取物和第4提取物。

将第一步所得残渣用水提取2次，每次1小时，得到第5提取物。

将第5提取物浓缩至干，后加水混悬，上AB-8大孔树脂，分别采用水、55％乙醇和95％乙醇作为洗脱液进行连续淋洗，分别得到第6提取物、第7提取物和第8提取物。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (9)

1.一种从中药组合物中提取活性部位的方法，包括如下步骤：

a)将原料药金银花、玄参、当归、甘草按照重量比2.5～4：2.5～4：1.5～2.5：0.5～1.5的比例混匀；

b)将所述原料药中加入55％的乙醇作为提取溶剂，所述原料药与所述提取溶剂的固液比为1：6～8，提取4次，每次2～4小时，过滤后合并滤液，得到提取液和残渣；

c)将所述提取液浓缩至干，后加水混悬，上大孔树脂，采用水、30％乙醇、60％乙醇和95％乙醇作为洗脱液进行连续淋洗，分别得到第1提取物、第2提取物、第3提取物和第4提取物；

d)将所述残渣用水提取2～3次，每次1～2小时，得到第5提取物；

e)将所述第5提取物浓缩至干，后加水混悬，上大孔树脂，分别采用水、55％乙醇和95％乙醇作为洗脱液进行连续淋洗，分别得到第6提取物、第7提取物和第8提取物。

2.如权利要求1所述的从中药组合物中提取活性部位的方法，其中所述原料药中金银花、玄参、当归、甘草的重量比为3：3：2：1。

3.如权利要求1所述的从中药组合物中提取活性部位的方法，其中所述大孔树脂为苯乙烯型弱极性共聚物。

4.如权利要求3所述的从中药组合物中提取活性部位的方法，其中所述大孔树脂为AB-8大孔树脂。

5.如权利要求1所述的从中药组合物中提取活性部位的方法，其中所述第1～8提取物对急性冠脉综合征均具有预防或治疗作用。

6.一种对急性冠脉综合征具有预防或治疗作用的中药组合物有效部位，其制备方法为：

a’)将原料药金银花、玄参、当归、甘草按照3：3：2：1的比例混匀；

b’)将原料药中加入55％的乙醇作为提取溶剂，所述原料药与所述提取溶剂的固液比为1：8，提取4次，每次2小时，过滤后合并滤液，得到提取液；以及

c’)将所述提取液浓缩至干，后加水混悬，上AB-8大孔树脂，分别采用水和30％乙醇作为洗脱液进行连续淋洗，得到30％乙醇淋洗物，即为所述有效部位。

7.一种对急性冠脉综合征具有预防或治疗作用的中药组合物有效部位，其制备方法为：

a”)将原料药金银花、玄参、当归、甘草按照3：3：2：1的比例混匀；

b”)将原料药中加入55％的乙醇作为提取溶剂，所述原料药与所述提取溶剂的固液比为1：8，每次2小时，提取4次，过滤后合并滤液，得到提取液；以及

c”)将所述提取液浓缩至干，后加水混悬，上AB-8大孔树脂，分别采用水、30％乙醇和60％乙醇作为洗脱液进行连续淋洗，得到60％乙醇淋洗物，即为所述有效部位。

8.一种对急性冠脉综合征具有预防或治疗作用的中药组合物有效部位，其制备方法为：

a”’)将原料药金银花、玄参、当归、甘草按照3：3：2：1的比例混匀；

b”’)将原料药中加入55％的乙醇作为提取溶剂，所述原料药与所述提取溶剂的固液比为1：8，提取4次，每次2小时，过滤后合并滤液，得到提取液；以及

c”’)将所述提取液浓缩至干，后加水混悬，上AB-8大孔树脂，分别采用水、30％乙醇、60％乙醇和95％乙醇作为洗脱液进行连续淋洗，得到95％乙醇淋洗物，即为所述有效部位。

9.一种从中药组合物中提取活性部位的方法，包括如下步骤：

a)将原料药金银花、玄参、当归、甘草按照重量比3：3：2：1的比例混匀；

b)将所述原料药中加入55％的乙醇作为提取溶剂，所述原料药与所述提取溶剂的固液比为1：8，提取4次，每次2小时，过滤后合并滤液，得到提取液和残渣；

c)将所述提取液浓缩至干，后加水混悬，上AB-8大孔树脂，分别采用水、30％乙醇、60％乙醇和95％乙醇作为洗脱液进行连续淋洗，分别得到第1提取物、第2提取物、第3提取物和第4提取物；

d)将所述残渣用水提取2次，每次1.5小时，得到第5提取物；以及

e)将所述第5提取物浓缩至干，后加水混悬，上AB-8大孔树脂，分别采用水、55％乙醇和95％乙醇作为洗脱液进行连续淋洗，分别得到第6提取物、第7提取物和第8提取物。