CN110078619B - 从青竹标中提取及分离纯化的环丁四醇酯类化合物及其方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及从青竹标中提取及分离纯化的环丁四醇酯类化合物及其方法。具有如式I所示的结构，

其中，R₁选自

或

R₂选自

或氢基；R₃选自羟基或

R₄选自氢基或羟基。具有较好的抗氧化活性，具有良好的药用前景。

Description

从青竹标中提取及分离纯化的环丁四醇酯类化合物及其方法

技术领域

本发明属于环丁四醇酯类化合物及其制备方法技术领域，具体涉及从青竹标中提取及分离纯化的环丁四醇酯类化合物及其方法。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

青竹标(Scindapsus officinalis Schott)别名密腺崖角藤、水蜈蚣、爬树龙、金竹标，天南星科岩角藤的全株，主要分布于云南、贵州、广西，是一种在当地应用广泛的珍稀民族药。《云南中草药选》记载其具有祛瘀镇痛、润肺止咳的功效，可治跌打损伤、骨折、风湿麻木、支气管炎、百日咳；《广西药植名录》记载其“消肿，止痛，治跌打，风湿，痈疮”；《贵州药植目录》记载其“去瘀生新，镇痛”。青竹标具有较好的研究前景。环丁四醇酯类化合物并没有报道从其它植物种类中提取出来。现有技术中，从青竹标中提取出色原酮苷类化合物和生物碱类化合物，现有技术中将青竹标用于清肺药物、烫伤药物、鼻炎、脊髓损伤、骨折、健脾和胃的保健品中等。

发明内容

针对上述现有技术中存在的问题，本发明的一个目的是提供从青竹标中提取及分离纯化的环丁四醇酯类化合物及其方法。

为了解决以上技术问题，本发明的技术方案为：

第一方面，从青竹标中提取及分离纯化的环丁四醇酯类化合物，具有如式I所示的结构，

其中，R₁选自

R₂选自

或氢基；R₃选自羟基或

R₄选自氢基或羟基。

在一些实施例中，上述的环丁四醇酯类化合物，具有如式Ⅱ和式Ⅲ所示的结构，

其中，n₁取自0或1；n₂取自0或1；R₅选自羟基或

R₇选自

或羟基；R₆选自

R₈选自氢基或羟基。在又一些实施例中，所述式Ⅱ所示化合物，当n₁为0时，n₂为1，R₅为

得到所述式(Ⅳ)所示化合物，

在又一些实施例中，所述式Ⅱ所示化合物，当n₁为1时，n₂为0，R₅为羟基，得到式(Ⅴ)所示化合物，

在又一些实施例中，所述式Ⅲ所示化合物，当R₇为羟基时，R₈为羟基时，R₆选自

得到式(Ⅵ)或式(Ⅶ)所示化合物，

在又一些实施例中，所述式Ⅲ所示化合物，当R₇为羟基时，R₈为氢基时，R₆为

得到式(Ⅷ)所示化合物，

在又一些实施例中，所述式Ⅲ所示化合物，当R₄为

时，R₅为

得到式(Ⅸ)所示化合物，

第二方面，上述环丁四醇酯类化合物的提取方法，具体步骤为：

将青竹标进行粗提取，将粗提取物依次采用石油醚、乙酸乙酯萃取，将萃取后的乙酸乙酯有机相去除溶剂获得乙酸乙酯萃取物；

乙酸乙酯萃取物溶解于CH₂Cl₂-MeOH中，用硅胶色谱柱进行梯度洗脱，梯度洗脱CH₂Cl₂-MeOH的体积比依次为100:1→50:1→25:1→15:1→10:1→5:1，将每个梯度的洗脱液分为大于8份的接收液；

按照接收顺序将设定段的接收液合并后浓缩，将浓缩物通过C18吸附树脂色谱柱进行洗脱分离，C18吸附树脂色谱柱的梯度洗脱液依次为12±1％MeOH、30±1％MeOH、45±1％MeOH、60±1％MeOH，将每个梯度的洗脱液分为大于8份的接收液；

按照接收顺序取设定段的接收液，用CH₃CN与H₂O的混合溶液进行洗脱分离得到式(Ⅰ)所示化合物。

依次采用石油醚、乙酸乙酯萃取，得到特定极性范围的萃取物，再用二氯甲烷-甲醇的混合物进行洗脱，二氯甲烷-甲醇的比值为特定的值，使其它不同极性的成分的含量大大降低，发明人发现，将梯度洗脱的洗脱液进行分离并且接收体积的数量在一定范围的时候，能够使其它不同极性的成分被分开的几率大大提高，然后再用CH₃CN与H₂O的混合溶液进行洗脱，CH₃CN与H₂O的混合溶液具有较大的极性，但是极性又小于水的极性，会使化合物从洗脱液中分离出来，得到最终的目标物。

CH₂Cl₂-MeOH进行洗脱是因为两者混合物的极性适合乙酸乙酯萃取物的分离。

在一些实施例中，每个梯度的洗脱液分为8、9或10份的接收液；在又一些实施例中，每个梯度的洗脱液的体积为4000-10000mL，每400-1000mL为一个接收体积；进一步的，每个梯度洗脱的体积为5000mL，每500mL为一个接收体积。

这里可以理解为，当每个梯度的洗脱液的体积为5000mL时，一个接收体积为500mL时，那么一份接收液的体积即为500mL，本领域技术人员能够根据检测到的化合物，进行选择分为几个接收体积。

在一些实施例中，第一次硅胶色谱柱进行梯度洗脱中，将15:1梯度的前5个接收液合并、浓缩，得浓缩物A，溶解于CH₂Cl₂-MeOH的体积比为15:1的溶液中，通过硅胶色谱柱进行梯度洗脱，梯度洗脱以CH₂Cl₂-MeOH体积比为100:1→50:1→25:1→15:1进行，将每个梯度的洗脱液分为大于8份的接收液，得到的15:1梯度的各个接收液合并得到洗脱部分B；

洗脱部分B通过C₁₈吸附树脂色谱柱依次用12±1％MeOH、30±1％MeOH、45±1％MeOH、60±1％MeOH进行洗脱，将每个梯度的洗脱液分为大于8份的接收液；

将30±1％MeOH梯度的洗脱部分的第5个接收液用CH₃CN与H₂O的混合溶液作为流动相进行洗脱分离，得到式(Ⅵ)所示化合物。

经高效液相色谱(HPLC)分析发现式(Ⅵ)所示化合物主要存在第5个接收体积的洗脱液中。

优选的，CH₃CN与H₂O的混合溶液中，CH₃CN与H₂O的体积比为15：80-90。

优选的，用MeOH进行洗脱，MeOH的流速为45-55mL/min。

优选的，用CH₃CN与H₂O的混合溶液作为流动相进行洗脱分离，流动相的流速为2-4mL/min。

利用萃取剂进行萃取时，环丁四醇酯类化合物中各个化合物的极性和化学键的组成不同，不同的梯度得到的洗脱部分、不同的洗脱部位、不同的接收体积、CH₃CN与H₂O的比例，直接影响得到的化合物的种类，由于分离后的各个接收体积内得到的成分含量和组成也是不同的，发明人发现操作参数对得到的接收体积内的成分和组成具有很大的影响。

在一些实施例中，第一次硅胶色谱柱进行梯度洗脱中，将15:1梯度的前5个接收液合并、浓缩，得浓缩物C，将浓缩物C溶解于CH₂Cl₂-MeOH的体积比为15:1的溶液中，通过硅胶色谱柱进行梯度洗脱，梯度洗脱以CH₂Cl₂-MeOH体积比为100:1→50:1→25:1→15:1进行，将每个梯度液分为大于8份的接收液，将15:1梯度的接收液合并得到洗脱部分D；

洗脱部分D通过C₁₈吸附树脂色谱柱依次用12±1％MeOH、30±1％MeOH、45±1％MeOH、60±1％MeOH进行洗脱，将每个梯度的洗脱液为大于8份的接收液；

将45±1％MeOH梯度的洗脱部分的第3个接收液用CH₃CN与H₂O的混合溶液作为流动相进行洗脱分离，得到式(Ⅶ)所示化合物。

优选的，CH₃CN与H₂O的混合溶液中，CH₃CN与H₂O的体积比为20：75-95。

优选的，用MeOH进行洗脱，MeOH的流速为45-55mL/min。

优选的，用CH₃CN与H₂O的混合溶液作为流动相进行洗脱分离，流动相的流速为2-4mL/min。

在一些实施例中，第一次硅胶色谱柱进行梯度洗脱中，将15:1梯度的后5个接收液、浓缩，得浓缩物E，将浓缩物E溶解于CH₂Cl₂-MeOH的体积比为15:1的溶液中，通过硅胶色谱柱进行梯度洗脱，梯度洗脱以CH₂Cl₂-MeOH体积比为100:1→50:1→25:1→15:1进行，将每个梯度的洗脱液分为大于8份的接收液，将15:1梯度的接收液合并得到洗脱部分F；

洗脱部分F通过C₁₈吸附树脂色谱柱依次用12±1％MeOH、30±1％MeOH、45±1％MeOH、60±1％MeOH进行洗脱，将每个梯度的洗脱液分为大于8份的接收液；

将30±1％MeOH梯度的洗脱部分的第2个接收液用CH₃CN与H₂O的混合溶液作为流动相进行洗脱分离，得到式(Ⅴ)所示化合物。

优选的，CH₃CN与H₂O的混合溶液中，CH₃CN与H₂O的体积比为14：80-90。

优选的，用MeOH进行洗脱，MeOH的流速为45-55mL/min。

优选的，用CH₃CN与H₂O的混合溶液作为流动相进行洗脱分离，流动相的流速为2-4mL/min。

在一些实施例中，第一次硅胶色谱柱进行梯度洗脱中，将10:1梯度的后五个接收液合并、浓缩得到浓缩物G；将缩物G通过C₁₈吸附树脂色谱柱依次用12±1％MeOH、30±1％MeOH、45±1％MeOH、60±1％MeOH进行洗脱，将每个梯度的洗脱液分为大于8份的接收液；将45±1％MeOH梯度的洗脱部分的后2个接收液通过SepadexLH-20凝胶树脂色谱柱，用MeOH进行洗脱，洗脱液分为大于8份的接收液；

用MeOH洗脱部分的第3个洗脱部位用CH₃CN与H₂O的混合溶液作为流动相进行洗脱分离，得到式(Ⅷ)所示化合物。

MeOH为无水甲醇。

优选的，CH₃CN与H₂O的混合溶液中，CH₃CN与H₂O的体积比为20：75-85。

优选的，用MeOH进行洗脱，MeOH的流速为45-55mL/min。

优选的，用CH₃CN与H₂O的混合溶液作为流动相进行洗脱分离，流动相的流速为2-4mL/min。

在一些实施例中，第一次硅胶色谱柱进行梯度洗脱中，将5:1梯度的前2个接收液合并、浓缩得到浓缩物H；将浓缩物H通过C₁₈吸附树脂色谱柱依次用12±1％MeOH、30±1％MeOH、45±1％MeOH、60±1％MeOH进行洗脱，将每个梯度的洗脱液分为大于8份的接收液；将45±1％MeOH梯度的洗脱部分的后2个接收液通过SepadexLH-20凝胶树脂色谱柱，用MeOH进行洗脱，洗脱液分为大于8份的接收液；

用MeOH洗脱部分的第6个洗脱部位用CH₃CN与H₂O的混合溶液作为流动相进行洗脱分离，得到式(Ⅳ)所示化合物。

第6个洗脱部位对应的是第6份接收液。

优选的，CH₃CN与H₂O的混合溶液中，CH₃CN与H₂O的体积比为28：70-75。

优选的，用MeOH进行洗脱，MeOH的流速为45-55mL/min。

优选的，用CH₃CN与H₂O的混合溶液作为流动相进行洗脱分离，流动相的流速为2-4mL/min。

在一些实施例中，第一次硅胶色谱柱进行梯度洗脱中，将5:1梯度的前2个接收液合并、浓缩得到浓缩物K；依次用12±1％MeOH、30±1％MeOH、45±1％MeOH、60±1％MeOHC₁₈吸附树脂色谱柱进行洗脱，将每个梯度的洗脱液分为大于8份的接收液；将45±1％MeOH梯度的洗脱部分的后前1个接收体积通过SepadexLH-20凝胶树脂色谱柱，用MeOH进行洗脱，洗脱液分为大于8份的接收液；

用MeOH洗脱部分的第8个洗脱部位用CH₃CN与H₂O的混合溶液作为流动相进行洗脱分离，得到式(Ⅸ)所示化合物。

优选的，CH₃CN与H₂O的混合溶液中，CH₃CN与H₂O的体积比为28：70-75。

优选的，用MeOH进行洗脱，MeOH的流速为45-55mL/min。

优选的，用CH₃CN与H₂O的混合溶液作为流动相进行洗脱分离，流动相的流速为2-4mL/min。

第三方面，上述环丁四醇酯类化合物在制备防氧化药物中的应用。

本发明的有益效果：

上述从青竹标中分离纯化的新环丁四醇酯类化合物及其制备方法，以青竹标为原料，来源广泛，制备工艺简单，经济、安全，得率高，所得的6个新化合物中的化合物都具有一定的抗氧化活性，其中，化合物Ⅵ具有较好的抗氧化活性，具有良好的药用前景。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为化合物式(Ⅳ)的¹H NMR；

图2为化合物式(Ⅳ)的¹³C NMR；

图3为化合物式(Ⅸ)的¹H NMR；

图4为化合物式(Ⅸ)的¹³C NMR；

图5为化合物式(Ⅴ)的¹H NMR；

图6为化合物式(Ⅴ)的¹³C NMR；

图7为化合物式(Ⅵ)的¹H NMR；

图8为化合物式(Ⅵ)的¹³C NMR；

图9为化合物式(Ⅶ)的¹H NMR；

图10为化合物式(Ⅶ)的¹³C NMR；

图11为化合物式(Ⅷ)的¹H NMR；

图12为化合物式(Ⅷ)的¹³C NMR。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

化合物Ⅳ的结构式为

命名为(2E,2'E)-(1R,2R,3S,4S)-3,4-dihydroxy-3-(3-methoxy-3-oxopropyl)cyclobutane-1,2-diylbis[3-(3,4-dihydroxyphenyl)acrylate]；

化合物Ⅸ的结构式为

命名为(2E,2'E)-(1S,2S,3R,4R)-2,4-dihydroxy-2-(3-methoxy-3-oxopropyl)cyclobutane-1,3-diylbis[3-(3,4-dihydroxyphenyl)acrylate]；

化合物Ⅴ的结构式为

命名为(E)-(1R,2R,3S,4S)-2,3,4-trihydroxy-3-(3-methoxy-3-oxopropyl)cyclobutyl-3-(3,4-dihydroxyphenyl)acrylate；

化合物Ⅵ的结构式为，

命名为(E)-(1S,2S,3R,4R)-2,3,4-trihydroxy-2-(3-methoxy-3-oxopropyl)cyclobutyl3-(3,4-dihydroxyphenyl)acrylate；

化合物Ⅶ的结构式为

命名为(E)-(1S,2R,3R,4S)-2-(3-ethoxy-3-oxopropyl)-2,3,4-trihydroxycyclobutyl 3-(3,4-dihydroxyphenyl)acrylate；

化合物Ⅷ的结构式为

命名为(E)-(1S,2R,3R,4S)-2,3,4-trihydroxy-2-(3-methoxy-3-oxopropyl)cyclobutyl 3-(4-hydroxyphenyl)acrylate。下面结合实施例对本发明进一步说明

下述实施例使用的设备为半制备高效液相色谱仪。

实施例1

式(Ⅵ)所示化合物的制备方法。

(1)取青竹标药材5kg，粉碎，95％乙醇加热回流提取，固液比为1:3，提取三次，时间分别为2h，1h，1h，合并滤液，减压旋蒸，冷冻干燥，得青竹标粗提物1kg；

(2)将总粗提物加入适量水超声打散，分别用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇萃取，萃取液过滤，减压浓缩分别得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取部位；

(3)将所得的乙酸乙酯部位180g溶解于甲醇中，加入200～300目硅胶300g拌样，挥干溶剂，以体积比CH₂Cl₂-MeOH(100:1→50:1→25:1→15:1→10:1→5:1→1:1→0:1)进行梯度洗脱，得到各洗脱部位，浓缩，每个梯度冲洗5000mL，每500mL为一个接收液的接收体积。

(4)将CH₂Cl₂-MeOH(15:1)梯度洗脱部位的前5个接收液合浓缩，浓缩物溶解于CH₂Cl₂-MeOH(15:1)中，加硅胶填料拌样挥干溶剂后，通过硅胶色谱柱进行梯度洗脱，梯度洗脱以CH₂Cl₂-MeOH体积比为100:1→50:1→25:1→15:1进行，梯度洗脱2500mL，每250ml为1个接收液的接收体积；将第二次硅胶柱色谱CH₂Cl₂-MeOH(15:1)洗脱比例的洗脱部分通过C₁₈吸附树脂色谱柱，依次用12％MeOH、30％MeOH、45％MeOH、60％MeOH进行洗脱，每个梯度洗脱2500ml，每500ml为1个接收液的接收体积，流速为50mL/min；将C₁₈柱色谱30％MeOH洗脱部位的第5个接收液用CH₃CN与H₂O的体积比为15:85的流动相进行制备，流速为3mL/min，检测波长为310nm，每次进样50μL，得到化合物Ⅵ10mg。

实施例2

式(Ⅶ)所示化合物的制备方法。

(1)取青竹标药材5kg，粉碎，95％乙醇加热回流提取，固液比为1:3，提取三次，时间分别为2h，1h，1h，合并滤液，减压旋蒸，冷冻干燥，得青竹标粗提物1kg；

(2)将总粗提物加入适量水超声打散，分别用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇萃取，萃取液过滤，减压浓缩分别得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取部位；

(3)将所得的乙酸乙酯部位180g溶解于甲醇中，加入200～300目硅胶300g拌样，挥干溶剂，以体积比CH₂Cl₂-MeOH(100:1→50:1→25:1→15:1→10:1→5:1→1:1→0:1)进行梯度洗脱，得到各洗脱部位，浓缩，每个梯度冲洗5000mL，每500mL为接收液的一个接收体积。

(4)将CH₂Cl₂-MeOH(15:1)梯度洗脱部位的前5个接收液合浓缩，浓缩物溶解于CH₂Cl₂-MeOH(15:1)中，加硅胶填料拌样挥干溶剂后，通过硅胶色谱柱进行梯度洗脱，梯度洗脱以CH₂Cl₂-MeOH体积比为100:1→50:1→25:1→15:1进行，梯度洗脱2500ml，每250ml为1个接收液的接收体积；将第二次硅胶柱色谱CH₂Cl₂-MeOH(15:1)洗脱比例的洗脱部分通过C₁₈吸附树脂色谱柱，依次用12％MeOH、30％MeOH、45％MeOH、60％MeOH进行洗脱，每个梯度洗脱2500ml，每500ml为1个接收液的接收体积，流速为50mL/min；将C₁₈柱色谱45％MeOH洗脱部位的第3个接收液用CH₃CN与H₂O的体积比为20:80的流动相进行制备，流速为3mL/min，检测波长为310nm，每次进样50μL，得到化合物Ⅶ7mg；

实施例3

式(Ⅴ)所示化合物的制备方法。

(1)取青竹标药材5kg，粉碎，95％乙醇加热回流提取，固液比为1:3，提取三次，时间分别为2h，1h，1h，合并滤液，减压旋蒸，冷冻干燥，得青竹标粗提物1kg；

(2)将总粗提物加入适量水超声打散，分别用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇萃取，萃取液过滤，减压浓缩分别得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取部位；

(3)将所得的乙酸乙酯部位180g溶解于甲醇中，加入200～300目硅胶300g拌样，挥干溶剂，以体积比CH₂Cl₂-MeOH(100:1→50:1→25:1→15:1→10:1→5:1→1:1→0:1)进行梯度洗脱，得到各洗脱部位，浓缩，每个梯度冲洗5000mL，每500mL为接收液的一个接收体积。

(4)将第一次硅胶柱色谱CH₂Cl₂-MeOH(15:1)梯度洗脱部位的后5个接收液合浓缩，浓缩物溶解于CH₂Cl₂-MeOH(15:1)中，加硅胶填料拌样挥干溶剂后，通过硅胶色谱柱进行梯度洗脱，梯度洗脱以CH₂Cl₂-MeOH体积比为100:1→50:1→25:1→15:1进行，梯度洗脱2500ml，每250ml为1个接收液的接收体积；将第二次硅胶柱色谱CH₂Cl₂-MeOH(15:1)洗脱比例的洗脱部分通过C₁₈吸附树脂色谱柱，依次用12％MeOH、30％MeOH、45％MeOH、60％MeOH进行洗脱，每个梯度洗脱2500mL，每500mL为1个接收液，流速为50mL/min；将C₁₈柱色谱30％MeOH洗脱部位的第2个接收液用CH₃CN与H₂O的体积比为14:86的流动相进行制备，流速为3mL/min，检测波长为310nm，每次进样50μL，得到化合物Ⅴ11mg。

实施例4

式(Ⅷ)所示化合物的制备方法。

(1)取青竹标药材5kg，粉碎，95％乙醇加热回流提取，固液比为1:3，提取三次，时间分别为2h，1h，1h，合并滤液，减压旋蒸，冷冻干燥，得青竹标粗提物1kg；

(2)将总粗提物加入适量水超声打散，分别用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇萃取，萃取液过滤，减压浓缩分别得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取部位；

(3)将所得的乙酸乙酯部位180g溶解于甲醇中，加入200～300目硅胶300g拌样，挥干溶剂，以体积比CH₂Cl₂-MeOH(100:1→50:1→25:1→15:1→10:1→5:1→1:1→0:1)进行梯度洗脱，得到各洗脱部位，浓缩，每个梯度冲洗5000mL，每500mL为一个接收液的接收体积。

(4)将第一次硅胶柱色谱CH₂Cl₂-MeOH(10:1)梯度洗脱部位的后5个接收液合并浓缩，通过C₁₈吸附树脂色谱，依次用12％MeOH、30％MeOH、45％MeOH、60％MeOH进行洗脱，每个梯度洗脱2500mL，每500mL为1个接收液，流速为50mL/min；将C₁₈柱色谱45％MeOH洗脱部位的后2个接收体积通过SepadexLH-20凝胶树脂色谱柱，用MeOH进行洗脱，每10mL为1个接收液；将SepadexLH-20凝胶柱色谱中MeOH的洗脱部分的第3个洗脱部位用CH₃CN与H₂O的体积比为20:80的流动相进行制备，流速为3mL/min，检测波长为310nm，每次进样50μL，得到化合物Ⅷ10mg。

实施例5

式(Ⅳ)所示化合物的制备方法。

(1)取青竹标药材5kg，粉碎，95％乙醇加热回流提取，固液比为1:3，提取三次，时间分别为2h，1h，1h，合并滤液，减压旋蒸，冷冻干燥，得青竹标粗提物1kg；

(2)将总粗提物加入适量水超声打散，分别用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇萃取，萃取液过滤，减压浓缩分别得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取部位；

(3)将所得的乙酸乙酯部位180g溶解于甲醇中，加入200～300目硅胶300g拌样，挥干溶剂，以体积比CH₂Cl₂-MeOH(100:1→50:1→25:1→15:1→10:1→5:1→1:1→0:1)进行梯度洗脱，得到各洗脱部位，浓缩，每个梯度冲洗5000mL，每500mL为一个接收液的接收体积。

(4)将第一次硅胶柱色谱CH₂Cl₂-MeOH(5:1)梯度洗脱部位的前2个接收液合并浓缩，通过C₁₈吸附树脂色谱，依次用12％MeOH、30％MeOH、45％MeOH、60％MeOH进行洗脱，每个梯度洗脱2500mL，每500mL为1个接收液，流速为50mL/min；将C₁₈柱色谱45％MeOH洗脱部位的后2个接收体积通过SepadexLH-20凝胶树脂色谱柱，用MeOH进行洗脱，每10ml为1个接收液；将SepadexLH-20凝胶柱色谱中MeOH的洗脱部分的第6个洗脱部位用CH₃CN与H₂O的体积比为28:72的流动相进行制备，流速为3mL/min，检测波长为310nm，每次进样50μL，得到化合物Ⅳ35mg。

实施例6

式(Ⅸ)所示化合物的制备方法。

(1)取青竹标药材5kg，粉碎，95％乙醇加热回流提取，固液比为1:3，提取三次，时间分别为2h，1h，1h，合并滤液，减压旋蒸，冷冻干燥，得青竹标粗提物1kg；

(2)将总粗提物加入适量水超声打散，分别用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇萃取，萃取液过滤，减压浓缩分别得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取部位；

(3)将所得的乙酸乙酯部位180g溶解于甲醇中，加入200～300目硅胶300g拌样，挥干溶剂，以体积比CH₂Cl₂-MeOH(100:1→50:1→25:1→15:1→10:1→5:1→1:1→0:1)进行梯度洗脱，得到各洗脱部位，浓缩，每个梯度冲洗5000mL，每500mL为接收液的一个接收体积。

将第一次硅胶柱色谱CH₂Cl₂-MeOH(5:1)梯度洗脱部位的前2个接收体积合并浓缩，通过C₁₈吸附树脂色谱，依次用12％MeOH、30％MeOH、45％MeOH、60％MeOH进行洗脱，每个梯度洗脱2500mL，每500mL为1个接收体积，流速为50mL/min；将C₁₈柱色谱45％MeOH洗脱部位的前1个接收液通过SepadexLH-20凝胶树脂色谱柱，用MeOH进行洗脱，每10mL为1个接收液的接收体积；将SepadexLH-20凝胶柱色谱中MeOH的洗脱部分的第8个洗脱部位用CH₃CN与H₂O的体积比为28:72的流动相进行制备，流速为3mL/min，检测波长为310nm，每次进样50μL，得到化合物Ⅸ30mg。

结构鉴定：对分离得到的单体成分应用Agilent 5973N质谱仪和Burker 400MHz核磁共振波谱仪分别进行MS，NMR谱的测定，所得核磁数据见表1-2，鉴定6个新环丁四醇酯类化合物Ⅳ、Ⅸ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ的结构。

化合物Ⅳ：(2E,2'E)-(1R,2R,3S,4S)-3,4-dihydroxy-3-(3-methoxy-3-oxopropyl)cyclobutane-1,2-diyl bis[3-(3,4-dihydroxyphenyl)acrylate]，棕色膏状物，其化学结构表征如图1～2所示，HR-ESIMS给出分子离子峰m/z531.8671[M+H]⁺(calcdfor C₂₆H₂₆O₁₂，531.1452),结合¹H NMR和¹³C NMR谱推测化合物Ⅳ的分子式为C₂₆H₂₆O₁₂。¹³C和HSQC、HMBC谱显示化合物Ⅳ共有26个碳原子，包括1个甲氧基(δ_C52.5)，2个亚甲基，13个次甲基[包括6个苯环碳，化学位移分别为δ_C115.3(C-2),116.3(C-5),121.8(C-6),115.2(C-2”),116.3(C-5”),121.9(C-6”)；4个烯碳，化学位移分别为δ_C146.0(C-7),114.3(C-8),146.2(C-7”),113.8(C-8”)；3个连氧碳，化学位移分别为δ_C72.5(C-1'),68.2(C-2'),65.8(C-4')]和10个季碳[包括2个与双键共轭的酯羰基碳，化学位移分别为δ_C166.4(C-9)和δ_C165.7(C-9”)；1个非共轭酯羰基碳δ_C173.8(C-7')；6个苯环碳，化学位移分别为δ_C125.9(C-1),146.1(C-3),149.1(C-4),125.7(C-1”),146.1(C-3”),149.0(C-4”)；1个连氧碳δ_C73.6(C-2')]。¹H NMR谱显示2组咖啡酯信号：δ_H7.04(2H,overlapped,H-2,2”),6.76(2H,d,J＝8.0Hz,H-5,5”),6.99(2H,overlapped,H-6,6”),和4个trans烯氢信号δ_H7.51(1H,d,J＝15.6Hz,H-7),6.26(1H,d,J＝15.6Hz,H-8),7.42(1H,d,J＝15.6Hz,H-7”),6.14(1H,d,J＝15.6Hz,H-8”)，通过HMBC相关：H-7和H-8/166.4(C-9)；H-7”和H-8”/165.7(C-9”)进一步证明此基团。HMBC谱中发现两个酯羰基信号分别与两个连氧次甲基氢信号相关：δ_H4.97(1H,dd,J＝2.4,6.0Hz,H-1')和5.27(1H,d,J＝3.2Hz,H-2')。¹H ¹H-COSY谱中，H-1'/H-2'和H-1'/H-4'(δ_H4.15)两组相关信号表明存在caffeoyl-O-C-1'H-C-2'H(O-caffeoyl)-C-3'(R)₃和caffeoyl-O-C-1'H-C-4'H(OR)-C-3'(R)₃偶合方式，连同HMBC谱中相关信号：H-1'与C-2',C-3'和C-4'相关；H-2'与C-1',C-3'和C-4'相关；H-4'与C-1',C-2'和C-3'相关，证明存在一个环丁烷基团，且C-1'和C-2'分别与两个咖啡酯羰基相连。此外，¹H NMR谱还显示存在1个甲氧基δ_H 3.60(3H,s,OMe-7')，4个高场氢信号δ_H 2.25(2H,overlapped,H-5'a,H-6'a),2.00(1H,d,J＝11.6Hz,H-5'b),1.89(1H,dd,J＝9.2,12.4Hz,H-6'b)，通过进一步2D NMR解析：¹H ¹H-COSY相关信号H-5'a or H-6'a/H-5'b/H-6'b，HMBC相关信号H-5'a or H-6'a与C-5',C-6',C-7'相关,H-5'b与C-6',C-7'相关,H-6'b与C-5',C-7'相关,OMe-7'与C-7'相关，证明存在一个丙酸甲酯基团。通过H-5'a or H-6'a,H-5'b和H-6'b均与C-3'相关，证明该基团与环丁烷的C-3'位置相连。最后，环丁烷基团的C-3'和C-4'相连的基团通过2D NMR以及分子式解析确定为2个OH：HMBC相关信号：OH-3'(δ_H5.91)与C-3'和C-5'相关,OH-4'(δ_H5.17)与C-1'和C-4'相关；¹H ¹H-COSY相关信号：OH-4'(δ_H5.17)与H-4'相关。

与环丁烷相连基团的相对构型通过NOESY相关信号确定：H-1'与H-2',H-4',H-5',H-6'相关,H-2'与H-1',H-5',H-6'相关,H-4'与H-1',H-5',H-6'相关，以及H-1'与H-2'和H-1'与H-4'较小的邻位耦合常数确定H-1',H-2',H-4',H-5'和H-6'均为β构型。化合物Ⅳ的绝对构型通过裂分的圆二色谱方法确定：比较化合物Ⅳ和Ⅴ的CD谱发现Ⅳ的CD曲线出现负的手征性，即345nm(Δε-41.77)和285nm(Δε+20.70)，故两个发色团为逆时针排列，从而确定化合物Ⅳ和Ⅴ的C-2'均为R构型，通过NOE相关进一步确定其它手性中心的构型。综上所述，化合物Ⅳ的结构确定为：(2E,2'E)-(1R,2R,3S,4S)-3,4-dihydroxy-3-(3-methoxy-3-oxopropyl)cyclobutane-1,2-diylbis[3-(3,4-dihydroxyphenyl)acrylate]。

化合物Ⅸ：(2E,2'E)-(1S,2S,3R,4R)-2,4-dihydroxy-2-(3-methoxy-3-oxopropyl)cyclobutane-1,3-diyl bis[3-(3,4-dihydroxyphenyl)acrylate]，棕色膏状物，其化学结构表征如图3～4所示，HR-ESIMS给出分子离子峰m/z529.0477[M-H]^-(calcdfor C₂₆H₂₆O₁₂,529.1341),结合¹H NMR和¹³C NMR谱推测化合物Ⅱ的分子式为C₂₆H₂₆O₁₂，与化合物Ⅳ的分子式一致。比较化合物Ⅸ和Ⅳ的¹H NMR和¹³C NMR谱数据，发现两者结构类似，主要的区别在于两者环丁烷基团的C-1'、C-2'、C-3'、C-4'的化学位移不同，表明化合物Ⅸ中环丁烷基团上取代基的位置与化合物Ⅳ中环丁烷基团上取代基的位置不同。HMBC谱中：H-1'(δ_H5.18)与C-9(δ_C166.5),C-2'(δ_C71.4),C-3'(δ_C72.9),C-4'(δ_C67.1),C-5'(δ_C34.9)相关；OH-2'(δ_H5.85)与C-2'和C-5'相关；H-3'(δ_H5.09)与C-9”(δ_C165.7),C-1'(δ_C70.4),C-2'(δ_C71.4)和C-4'(δ_C67.1)相关；H-4'(δ_H3.87)与C-1'(δ_C70.4),C-2'(δ_C71.4),C-3'(δ_C72.9),C-5'(δ_C34.9)和C-6'(δ_C35.2)相关；OH-4'(δ_H5.48)与C-1'和C-4'相关；H-5'a或H-6'a(δ_H2.20)与C-4'(δ_C67.1)相关；H-5'b或H-6'b(δ_H2.20)与C-2'(δ_C71.4)相关，以及¹H ¹H-COSY谱中：H-1'与H-4'相关；H-3'与H-4'相关；H-4'与H-3'相关；OH-4'与H-4'相关，表明两个咖啡酯基团分别与环丁烷的C-1'和C-3'相连，丙酸甲酯基团与C-2'相连，两个羟基分别与C-2'和C-4'相连。与环丁烷相连基团的相对构型通过NOESY相关信号确定：H-1'与H-2',H-4',H-5',H-6'相关,H-2'与H-1',H-5',H-6'相关,H-4'与H-1',H-5',H-6'相关，以及H-1'与H-2'和H-1'与H-4'较小的邻位耦合常数确定H-1',H-2',H-4',H-5'和H-6'均为β构型。化合物Ⅸ的绝对构型通过裂分的圆二色谱方法确定：比较化合物Ⅸ和IV的CD谱发现Ⅸ的CD曲线出现负的手征性，即344nm(Δε-7.02)和285nm(Δε+3.40)，故两个发色团为逆时针排列，从而确定化合物Ⅸ和IV的C-3'均为R构型，通过NOE相关进一步确定其它手性中心的构型。综上所述，化合物Ⅸ的结构确定为：(2E,2'E)-(1S,2S,3R,4R)-2,4-dihydroxy-2-(3-methoxy-3-oxopropyl)cyclobutane-1,3-diylbis[3-(3,4-dihydroxyphenyl)acrylate]。

化合物Ⅴ：(E)-(1R,2R,3S,4S)-2,3,4-trihydroxy-3-(3-methoxy-3-oxopropyl)cyclobutyl3-(3,4-dihydroxyphenyl)acrylate，棕色膏状物，其化学结构表征如图5～6所示，HR-ESIMS给出分子离子峰m/z367.0432[M-H]^-(calcd for C₁₇H₂₀O₉,367.1024),结合¹HNMR和¹³C NMR谱推测化合物Ⅴ的分子式为C₁₇H₂₀O₉。¹³CNMR和HSQC、HMBC谱显示化合物Ⅴ共有17个碳原子，包括1个甲氧基(δ_C52.1)，2个亚甲基，8个次甲基[包括3个苯环碳，化学位移分别为δ_C115.2(C-2),116.3(C-5),121.7(C-6)；2个烯碳，化学位移分别为δ_C145.3(C-7),115.0(C-8)；3个连氧碳，化学位移分别为δ_C76.1(C-1'),64.9(C-2'),65.9(C-4')]和6个季碳[包括1个与双键共轭的酯羰基碳，化学位移分别为δ_C166.7(C-9)；1个非共轭酯羰基碳δ_C174.3(C-7')；3个苯环碳，化学位移分别为δ_C126.1(C-1),146.1(C-3),148.8(C-4)；1个连氧碳δ_C74.0(C-3')]。比较化合物Ⅴ和Ⅳ的¹H NMR和¹³C NMR谱数据，发现两者结构类似，主要的区别在于化合物Ⅴ中仅含有一个咖啡酯基团，羟基取代了另一个咖啡酯基团。通过2DNMR解析进一步证明了这一推断，HMBC相关信号：H-1'(δ_H4.71)与C-9,C-2',C-3'(δ_C74.0),C-4'和C-5'(δ_C38.4)相关；H-2'(δ_H4.07)与C-1',C-3'和C-4'相关；OH-2'(δ_H4.90)与C-1'和C-2'相关；OH-3'(δ_H5.67)与C-3'相关；H-4'(δ_H3.95)与C-1',C-2'和C-3'相关；OH-4'(δ_H5.05)与C-1'和C-4'相关；H-5'a(δ_H2.08)和H-5'b(δ_H1.79)与C-2',C-4',C-6'(δ_C40.3),C-7'(δ_C174.3)相关；H-6'a(δ_H1.87)和H-6'b(δ_H1.85)与C-3',C-5'(δ_C38.4),C-7'相关；¹H ¹H-COSY相关信号：H-1'与H-4'相关；H-2'与H-4',H-5'相关；H-4'与H-1'相关；OH-2'与H-2'相关；OH-4'与H-4'相关。与环丁烷相连基团的相对构型通过NOESY相关信号确定：H-1'与H-2',H-4',H-5',H-6'相关,H-2'与H-1',H-5',H-6'相关,H-4'与H-1',H-5',H-6'相关，以及H-1'与H-2'和H-1'与H-4'较小的邻位耦合常数(J_H-1',2'＝2.8Hz和J_H-1',4'＝6.8Hz)确定H-1',H-2',H-4',H-5'和H-6'均为β构型。化合物Ⅴ的绝对构型通过裂分的圆二色谱方法确定化合物Ⅴ的C-2'为R构型，通过NOE相关进一步确定其它手性中心的构型。综上所述，化合物Ⅴ的结构确定为(E)-(1R,2R,3S,4S)-2,3,4-trihydroxy-3-(3-methoxy-3-oxopropyl)cyclobutyl 3-(3,4-dihydroxyphenyl)acrylate。

化合物Ⅵ：(E)-(1S,2R,3R,4S)-2,3,4-trihydroxy-3-(3-methoxy-3-oxopropyl)cyclobutyl3-(3,4-dihydroxyphenyl)acrylate，棕色膏状物，其化学结构表征如图7～8所示，HR-ESIMS给出分子离子峰m/z367.0440[M-H]^-(calcd for C₁₇H₂₀O₉,367.1024),结合¹HNMR和¹³C NMR谱推测化合物Ⅳ的分子式为C₁₇H₂₀O₉，与化合物Ⅴ的分子式一致。比较化合物Ⅵ和Ⅴ的¹H NMR和¹³C NMR谱数据，发现两者结构类似，主要的区别在于两者环丁烷基团的C-1'、C-2'、C-3'、C-4'的化学位移不同，表明化合物Ⅵ中环丁烷基团上取代基的位置与化合物Ⅴ中环丁烷基团上取代基的位置不同。HMBC谱中：H-1'(δ_H5.00)与C-9(δ_C165.8),C-2'(δ_C73.5),C-3'(δ_C67.4),C-4'(δ_C69.8),C-5'(δ_C35.6)相关；H-2'(δ_H3.87)与C-1'(δ_C71.5),C-3'，C-4'相关；H-4'(δ_H3.57)与C-1',C-2'，C-3'相关；H-5'a(δ_H2.10)和H-5'b(δ_H1.92)与C-2',C-4',C-6'(δ_C37.7),C-7'(δ_C174.1)相关；H-6'a(δ_H2.10)和H-6'b(δ_H1.75)与C-3',C-5',C-7'相关，以及¹H ¹H-COSY谱中：H-1'与H-4'相关；H-2'与H-4',H-5'相关；H-4'与H-1'相关；OH-2'(δ_H4.90)与H-2'相关；OH-4'(δ_H5.05)与H-4'相关，表明1个咖啡酯基团与环丁烷的C-1'相连，丙酸甲酯基团与C-2'相连，三个羟基分别与C-2'，C-3'和C-4'相连。由于与环丁烷相连基团的NOESY相关与化合物Ⅴ一致，故两者相对构型一致。化合物Ⅵ的绝对构型通过裂分的圆二色谱方法确定化合物Ⅳ的C-3'为R构型，通过NOE相关进一步确定其它手性中心的构型。综上所述，化合物Ⅵ的结构确定为(E)-(1S,2R,3R,4S)-2,3,4-trihydroxy-3-(3-methoxy-3-oxopropyl)cyclobutyl3-(3,4-dihydroxyphenyl)acrylate。

化合物Ⅶ：(E)-(1S,2R,3R,4S)-2-(3-ethoxy-3-oxopropyl)-2,3,4-trihydroxycyclobutyl3-(3,4-dihydroxyphenyl)acrylate，棕色膏状物，其化学结构表征如图9～10所示，HR-ESIMS给出分子离子峰m/z381.0570[M-H]⁺(calcd for C₁₈H₂₂O₉,381.1180),结合¹H NMR和¹³C NMR谱推测化合物Ⅶ的分子式为C₁₈H₂₂O₉，与化合物Ⅵ的分子式多一个CH₂。比较化合物Ⅶ和Ⅵ的¹H NMR和¹³C NMR谱数据，发现两者结构类似，主要的区别在于化合物Ⅵ中与C-2'相连的丙酸甲酯基团被丙酸乙酯基团所取代。HMBC谱中的相关信号：H-5'a或H-6'a和H-5'b与C-2'(δ_C73.4),C-4'(δ_C69.4),C-6'(δ_C37.6),C-7'(δ_C173.5)相关,H-6'b与C-3'(δ_C67.3),C-5'(δ_C35.5),C-7'相关,H₂-1”与C-7',Me-2”(δ_C14.2)相关,Me-2”与C-1”相关，连同COSY谱中的相关信号：H-5'a或H-6'a(δ_H2.09)与H-5'b(δ_H1.91)相关,H-5'a或H-6'a/H-6'b(δ_H1.75)和H₂-1”(δ_H3.94-4.07)与Me-2”(δ_H1.13)相关，一同证明了上述推断。由于与环丁烷相连基团的NOESY相关和CD谱与化合物Ⅵ一致，故两者绝对构型一致。综上所述，化合物Ⅶ的结构确定为(E)-(1S,2R,3R,4S)-2-(3-ethoxy-3-oxopropyl)-2,3,4-trihydroxycyclobutyl 3-(3,4-dihydroxyphenyl)acrylate。

化合物Ⅷ：(E)-(1S,2R,3R,4S)-2,3,4-trihydroxy-2-(3-methoxy-3-oxopropyl)cyclobutyl3-(4-hydroxyphenyl)acrylate，棕色膏状物，其化学结构表征如图11～12所示，HR-ESIMS给出分子离子峰m/z351.0502[M-H]⁺(calcd for C₁₇H₂₀O₈,351.1074),结合¹HNMR和¹³C NMR谱推测化合物Ⅵ的分子式为C₁₇H₂₀O₈。¹³CNMR和HSQC、HMBC谱显示化合物Ⅷ共有17个碳原子，包括1个甲氧基(δ_C52.1)，2个亚甲基，9个次甲基[包括4个苯环碳，化学位移分别为δ_C130.7(C-2,C-6),116.3(C-3,C-5)；2个烯碳，化学位移分别为δ_C145.2(C-7),114.6(C-8)；3个连氧碳，化学位移分别为δ_C71.5(C-1'),67.5(C-3'),70.0(C-4')]和5个季碳[包括1个与双键共轭的酯羰基碳，化学位移分别为δ_C165.9(C-9)；1个非共轭酯羰基碳δ_C174.1(C-7')；2个苯环碳，化学位移分别为δ_C125.4(C-1),160.4(C-4)；1个连氧碳δ_C73.6(C-2')]。比较化合物Ⅷ和Ⅵ的¹H NMR和¹³C NMR谱数据，发现两者结构类似，主要的区别在于化合物Ⅵ中的咖啡酯基团被对羟基桂皮酸酯基团所取代。1D和2D NMR数据解析进一步证明以上推断：¹H NMR谱中存在一个AB耦合系统，氢信号分别为δ_H7.53(2H,d,J＝8.4Hz,H-2,H-6)，6.81(2H,d,J＝8.4Hz,H-3,H-5)；HMBC谱中的相关信号：H-2和H-6与C-1(δ_C125.4),C-3,C-5,C-4(δ_C160.4),C-7(δ_C145.2)相关,H-3和H-5与C-1,C-2,C-4,C-6相关，连同COSY谱中的相关信号：H-2和H-6与H-3和H-5相关。由于与环丁烷相连基团的NOESY相关和CD谱与化合物Ⅵ一致，故两者绝对构型一致。综上所述，化合物Ⅷ的结构确定为(E)-(1S,2R,3R,4S)-2,3,4-trihydroxy-2-(3-methoxy-3-oxopropyl)cyclobutyl3-(4-hydroxyphenyl)acrylate。

表1.化合物Ⅴ～Ⅸ的¹H NMR光谱数据(400MHz,DMSO-d₆,δppm,J,Hz)

表2.化合物Ⅴ～Ⅸ的¹³C NMR光谱数据(400MHz,DMSO-d₆,δppm)

药理学实验：

1、实验材料

试剂与仪器：化合物Ⅴ～Ⅸ均由本课题组从青竹标中分离得到；DPPH(美国Sigma公司)；多功能酶标仪(法国Tecan公司)。

2、试验方法

抗氧化活性测定：

DPPH自由基清除实验：将50μL样品加到96孔板中，加入100μL新鲜配置的DPPH甲醇溶液，混合均匀后，200r/min振摇1min，室温下避光孵育30min，样品设定5个浓度，分别为90,60,30,15,7.5ppm。同时设定DPPH空白组和甲醇空白组，其中DPPH空白组将50μL样品改为50μL甲醇，甲醇空白组则加入150μL甲醇。用酶标仪在波长517nm处测定各化合物的OD值，重复测定3次，计算相应的抑制率和IC₅₀值。自由基清除率计算公式为：IR(％)＝(A_DPPH-A_test)/(A_DPPH-A_MeOH)，其中A_DPPH为DPPH空白组OD值，A_test为样品组OD值，A_MeOH为甲醇空白组OD值。

3、实验结果

从上述实验结果可以看知，化合物Ⅳ具有较强的DPPH自由基清除活性，即抗氧化活性，浓度为100ppm时，对DPPH的自由基清除率为94.04％，化合物Ⅸ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ的抗氧化活性较弱，对DPPH的自由基清除率分别为24.1％，17.5％，14.6％，9.8％和8.9％。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (25)

1.一种环丁四醇酯类化合物的提取方法，其特征在于：具体步骤为：

将青竹标进行粗提取，将粗提取物依次采用石油醚、乙酸乙酯萃取，将萃取后的乙酸乙酯有机相去除溶剂获得乙酸乙酯萃取物；

乙酸乙酯萃取物溶解于CH₂Cl₂-MeOH中，用硅胶色谱柱进行梯度洗脱，梯度洗脱CH₂Cl₂-MeOH的体积比依次为100:1→50:1→25:1→15:1→10:1→5:1，将每个梯度的洗脱液分为10份的接收液；

按照接收顺序将不同段的接收液合并后浓缩，将浓缩物通过C₁₈吸附树脂色谱柱进行洗脱分离，C₁₈吸附树脂色谱柱的梯度洗脱液依次为12±1％MeOH、30±1％MeOH、45±1％MeOH、60±1％MeOH，将每个梯度的洗脱液分为5份的接收液；

按照接收顺序取不同段的接收液，用CH₃CN与H₂O的混合溶液进行洗脱分离得到式(Ⅰ)所示化合物；

式I所示化合物的结构为：

其中，R₁选自

R₂选自

或氢基；R₃选自羟基或

R₄选自氢基或羟基。

2.如权利要求1所述环丁四醇酯类化合物的提取方法，其特征在于：第一次硅胶色谱柱进行梯度洗脱中，将15:1梯度的前5个接收液合并、浓缩，得浓缩物A，溶解于CH₂Cl₂-MeOH的体积比为15:1的溶液中，通过硅胶色谱柱进行梯度洗脱，梯度洗脱以CH₂Cl₂-MeOH体积比为100:1→50:1→25:1→15:1进行，将每个梯度的洗脱液分为10份的接收液，得到的15:1梯度的各个接收液合并得到洗脱部分B；

洗脱部分B通过C₁₈吸附树脂色谱柱依次用12±1％MeOH、30±1％MeOH、45±1％MeOH、60±1％MeOH进行洗脱，将每个梯度的洗脱液分为5份的接收液；

将30±1％MeOH梯度的洗脱部分的第5个接收液用CH₃CN与H₂O的混合溶液作为流动相进行洗脱分离，得到式(Ⅵ)所示化合物；

式Ⅵ所示化合物的结构为：

3.如权利要求2所述环丁四醇酯类化合物的提取方法，其特征在于：CH₃CN与H₂O的混合溶液中，CH₃CN与H₂O的体积比为15：80-90。

4.如权利要求2所述环丁四醇酯类化合物的提取方法，其特征在于：用MeOH进行洗脱，MeOH的流速为45-55mL/min。

5.如权利要求2所述环丁四醇酯类化合物的提取方法，其特征在于：用CH₃CN与H₂O的混合溶液作为流动相进行洗脱分离，流动相的流速为2-4mL/min。

6.如权利要求1所述环丁四醇酯类化合物的提取方法，其特征在于：第一次硅胶色谱柱进行梯度洗脱中，将15:1梯度的前5个接收液合并、浓缩，得浓缩物C，将浓缩物C溶解于CH₂Cl₂-MeOH的体积比为15:1的溶液中，通过硅胶色谱柱进行梯度洗脱，梯度洗脱以CH₂Cl₂-MeOH体积比为100:1→50:1→25:1→15:1进行，将每个梯度液分为10份的接收液，将15:1梯度的接收液合并得到洗脱部分D；

洗脱部分D通过C₁₈吸附树脂色谱柱依次用12±1％MeOH、30±1％MeOH、45±1％MeOH、60±1％MeOH进行洗脱，将每个梯度的洗脱液为5份的接收液；

将45±1％MeOH梯度的洗脱部分的第3个接收液用CH₃CN与H₂O的混合溶液作为流动相进行洗脱分离，得到式(Ⅶ)所示化合物；

式Ⅶ所示化合物的结构为：

7.如权利要求6所述环丁四醇酯类化合物的提取方法，其特征在于：CH₃CN与H₂O的混合溶液中，CH₃CN与H₂O的体积比为20：75-95。

8.如权利要求6所述环丁四醇酯类化合物的提取方法，其特征在于：用MeOH进行洗脱，MeOH的流速为45-55mL/min。

9.如权利要求6所述环丁四醇酯类化合物的提取方法，其特征在于：用CH₃CN与H₂O的混合溶液作为流动相进行洗脱分离，流动相的流速为2-4mL/min。

10.如权利要求1所述环丁四醇酯类化合物的提取方法，其特征在于：第一次硅胶色谱柱进行梯度洗脱中，将15:1梯度的后5个接收液、浓缩，得浓缩物E，将浓缩物E溶解于CH₂Cl₂-MeOH的体积比为15:1的溶液中，通过硅胶色谱柱进行梯度洗脱，梯度洗脱以CH₂Cl₂-MeOH体积比为100:1→50:1→25:1→15:1进行，将每个梯度的洗脱液分为10份的接收液，将15:1梯度的接收液合并得到洗脱部分F；

洗脱部分F通过C₁₈吸附树脂色谱柱依次用12±1％MeOH、30±1％MeOH、45±1％MeOH、60±1％MeOH进行洗脱，将每个梯度的洗脱液分为5份的接收液；

将30±1％MeOH梯度的洗脱部分的第2个接收液用CH₃CN与H₂O的混合溶液作为流动相进行洗脱分离，得到式(Ⅴ)所示化合物；

式Ⅴ所示化合物的结构为：

11.如权利要求10所述环丁四醇酯类化合物的提取方法，其特征在于：CH₃CN与H₂O的混合溶液中，CH₃CN与H₂O的体积比为14：80-90。

12.如权利要求10所述环丁四醇酯类化合物的提取方法，其特征在于：用MeOH进行洗脱，MeOH的流速为45-55mL/min。

13.如权利要求10所述环丁四醇酯类化合物的提取方法，其特征在于：用CH₃CN与H₂O的混合溶液作为流动相进行洗脱分离，流动相的流速为2-4mL/min。

14.如权利要求1所述环丁四醇酯类化合物的提取方法，其特征在于：第一次硅胶色谱柱进行梯度洗脱中，将10:1梯度的后五个接收液合并、浓缩得到浓缩物G；将缩物G通过C₁₈吸附树脂色谱柱依次用12±1％MeOH、30±1％MeOH、45±1％MeOH、60±1％MeOH进行洗脱，将每个梯度的洗脱液分为5份的接收液；将45±1％MeOH梯度的洗脱部分的后2个接收液通过SepadexLH-20凝胶树脂色谱柱，用MeOH进行洗脱，洗脱液分为大于8份的接收液；

用MeOH洗脱部分的第3个洗脱部位用CH₃CN与H₂O的混合溶液作为流动相进行洗脱分离，得到式(Ⅷ)所示化合物；

式Ⅷ所示化合物的结构为：

15.如权利要求14所述环丁四醇酯类化合物的提取方法，其特征在于：CH₃CN与H₂O的混合溶液中，CH₃CN与H₂O的体积比为20：75-85。

16.如权利要求14所述环丁四醇酯类化合物的提取方法，其特征在于：用MeOH进行洗脱，MeOH的流速为45-55mL/min。

17.如权利要求14所述环丁四醇酯类化合物的提取方法，其特征在于：用CH₃CN与H₂O的混合溶液作为流动相进行洗脱分离，流动相的流速为2-4mL/min。

18.如权利要求1所述环丁四醇酯类化合物的提取方法，其特征在于：第一次硅胶色谱柱进行梯度洗脱中，将5:1梯度的前2个接收液合并、浓缩得到浓缩物H；将浓缩物H通过C₁₈吸附树脂色谱柱依次用12±1％MeOH、30±1％MeOH、45±1％MeOH、60±1％MeOH进行洗脱，将每个梯度的洗脱液分为5份的接收液；将45±1％MeOH梯度的洗脱部分的后2个接收液通过SepadexLH-20凝胶树脂色谱柱，用MeOH进行洗脱，洗脱液分为大于8份的接收液；

用MeOH洗脱部分的第6个洗脱部位用CH₃CN与H₂O的混合溶液作为流动相进行洗脱分离，得到式(Ⅳ)所示化合物；

式Ⅳ所示化合物的结构为：

19.如权利要求18所述环丁四醇酯类化合物的提取方法，其特征在于：CH₃CN与H₂O的混合溶液中，CH₃CN与H₂O的体积比为28：70-75。

20.如权利要求18所述环丁四醇酯类化合物的提取方法，其特征在于：用MeOH进行洗脱，MeOH的流速为45-55mL/min。

21.如权利要求18所述环丁四醇酯类化合物的提取方法，其特征在于：用CH₃CN与H₂O的混合溶液作为流动相进行洗脱分离，流动相的流速为2-4mL/min。

22.权利要求1所述的环丁四醇酯类化合物的提取方法，其特征在于：第一次硅胶色谱柱进行梯度洗脱中，将5:1梯度的前2个接收液合并、浓缩得到浓缩物K；通过C₁₈吸附树脂色谱柱依次用12±1％MeOH、30±1％MeOH、45±1％MeOH、60±1％MeOH进行洗脱，将每个梯度的洗脱液分为10份的接收液；将45±1％MeOH梯度的洗脱部分的后前1个接收体积通过SepadexLH-20凝胶树脂色谱柱，用MeOH进行洗脱，洗脱液分为大于8份的接收液；

用MeOH洗脱部分的第8个洗脱部位用CH₃CN与H₂O的混合溶液作为流动相进行洗脱分离，得到式(Ⅸ)所示化合物；

式Ⅸ所示化合物的结构为：

23.权利要求22所述的环丁四醇酯类化合物的提取方法，其特征在于：CH₃CN与H₂O的混合溶液中，CH₃CN与H₂O的体积比为28：70-75。

24.权利要求22所述的环丁四醇酯类化合物的提取方法，其特征在于：用MeOH进行洗脱，MeOH的流速为45-55mL/min。

25.权利要求22所述的环丁四醇酯类化合物的提取方法，其特征在于：用CH₃CN与H₂O的混合溶液作为流动相进行洗脱分离，流动相的流速为2-4mL/min。

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