CN117164652A - 化合物及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于天然产物分离技术领域，具体涉及一种化合物及其制备方法和用途。本发明公开的化合物的结构如式(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)和(Ⅳ)所示，本发明还公开了上述化合物的制备方法，具体包括：提供钩苞大丁草，经干燥和粉碎处理后，用乙醇水溶液回流提取得提取液，将所述提取液浓缩得到第一提取物；将第一提取物进行大孔树脂柱分离，得到第一浓缩物；将第一浓缩物经聚酰胺柱层析法、正相柱层析法、反相柱层析法或凝胶色谱法中的一种或多种进行分离。本发明公开的化合物可以用于抗宫颈癌、肝癌、结肠癌、乳腺癌的药品的制备。
Description
技术领域
本发明属于天然产物分离技术领域，具体涉及一种化合物及其制备方法和用途。
背景技术
钩苞大丁草(Gerbera delavayi Franch.)为菊科(Compositae)大丁草属(Gerbera)植物，收载于《云南省中药材标准·彝族药(Ⅲ)》(2005年版，第六册)中，在《全国中草药汇编》、《中药大辞典》、《中华本草》、《贵州中草药资源研究》、《贵州植物志》等专著中均有记载。又名钩苞灯草、火草等，具有清热解毒，利湿消肿，化瘀止血的功效，用于肺热咳嗽，热淋，下肢红肿疼痛，外伤出血等。
此前对大丁草属植物的植物化学研究表明，其化学成分丰富，含有较多的香豆素、少量的苯乙酮、苯骈吡喃、萜类、黄酮、甾醇、有机酸等化学成分。活性筛选实验表明该属植物具有良好的抗菌、抗肿瘤、镇咳、祛痰、平喘、免疫、降糖作用等生物活性。根据文献报道，Qiang Yin等从石上大丁草(G.saxatilis)中发现具有由简单香豆素框架、吡喃环、甲基取代环己烷环和环氧环组成的新型五环吡喃[3-2c]香豆素结构，具有一定的抗肿瘤活性。WuZhi-li等从大丁草(G.anandria)中发现新的罕见的由呋喃环组成的5-甲基香豆素单萜，对东莨菪碱诱导的PC12细胞损伤具有较强神经保护作用。Li Tuo等从毛大丁草(G.anandria)的乙酸乙酯部位中发现与α-葡萄糖苷酶和蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP-1B)抑制活性相关的一系列异戊二烯基和geranyl取代的香豆素衍生物，包括Diels-Alder环加成形成的二聚体香豆素衍生物。所以，对这类香豆素成分的化学成分和药理活性的研究也引起了广泛的关注。
目前在国内外对毛大丁草、大丁草，石上大丁草的研究比较多，主要集中在小极性部位的化学成分研究。而关于钩苞大丁草的研究较少，仅有少量的植物学、栽培特性方面的研究，其化学成分仅有一篇文献报道，共分离得到15个化合物，无药理活性的相关报道，其化学物质基础研究不明确。根据植物分类与化学成分的关系，同属植物的亲缘关系很相近，往往含有类似结构的化学成分。因此，以钩苞大丁草(G.delavayi)为研究对象，对其进行系统的化学成分及抗肿瘤活性研究，阐明其药效物质基础，以期寻找到结构新颖、潜在活性的化合物或候选药物分子，为后续活性成分的结构改造、创新药物的研发、药材及其制剂的质量控制标准提升、资源的合理开发等提供理论依据和实验基础。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术不足之处而提供一种化合物及其制备方法和用途。
为实现上述目的，本发明提供了一种化合物，所述化合物的结构如式(I)所示，
进一步的，本发明还提供了一种化合物，所述化合物的结构如式(II)所示，
进一步的，本发明还提供了一种化合物，所述化合物的结构如式(Ⅲ)所示，
进一步的，本发明还提供了一种化合物，所述化合物的结构如式(IV)所示，
进一步的，本发明还提供了一种上述化合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)提供钩苞大丁草，经干燥和粉碎处理后，用乙醇水溶液回流提取得提取液，将所述提取液浓缩得到第一提取物；
(2)将第一提取物按照如下步骤进行大孔树脂柱分离：
将所述第一提取物加入到大孔树脂柱内，其中，所述大孔树脂选择D101、D-201、AB-8或HP-20型非极性大孔吸附树脂中的一种；大孔树脂柱内所述的大孔吸附树脂的体积与钩苞大丁草的重量之比为0.5-5:1；
采用水为洗脱剂对大孔树脂柱进行洗脱，除杂；
采用浓度为30-70％v/v的乙醇水溶液为洗脱剂对大孔树脂柱进行洗脱，收集洗脱液，浓缩得到第一浓缩物；
(3)将所述第一浓缩物经聚酰胺柱层析法、正相柱层析法、反相柱层析法或凝胶色谱法中的一种或多种进行分离。
在本发明的一个实施方式中，所述步骤(3)具体为：
将所述第一浓缩物经聚酰胺柱层析，以浓度为30-70％v/v的乙醇水溶液为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，浓缩得到第二浓缩物；
将所述第二浓缩物经正相柱层析，以二氯甲烷-甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱液，用薄层色谱对各个洗脱液进行检测，根据检测结果按照洗脱顺序，依次得到8个馏分，分别命名为Fr.1-Fr.8。
在本发明的一个实施方式中，取馏分Fr.6，减压浓缩，浓缩液经正相柱层析，以乙酸乙酯-甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱液，用薄层色谱对各个洗脱液进行检测，根据检测结果按照洗脱顺序，依次得到7个馏分，分别命名为Fr.6.1-Fr.6.7。
在本发明的一个实施方式中，取馏分Fr.6.4，减压浓缩，浓缩液经反相柱层析，以甲醇-水为洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱液，用薄层色谱对各个洗脱液进行检测，根据检测结果按照洗脱顺序，依次得到11个馏分，分别命名为Fr.6.4.1-Fr.6.4.11。
在本发明的一个实施方式中，取馏分Fr.6.4.6，减压浓缩，浓缩液经正相柱层析，以二氯甲烷-甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱液，用薄层色谱对各个洗脱液进行检测，根据检测结果按照洗脱顺序，依次得到3个馏分，分别命名为Fr.6.4.6.1-Fr.6.4.6.3。
在本发明的一个实施方式中，取馏分Fr.6.4.6.2，减压浓缩，浓缩液经反相柱层析，以浓度为10％-80％v/v的甲醇-水为洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，浓缩液经正相柱层析，以二氯甲烷-甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱液，用薄层色谱对各个洗脱液进行检测，合并含有目标成分的洗脱液，减压浓缩后，干燥，得到化合物Ⅰ。
在本发明的一个实施方式中，取馏分Fr.6.4.9，静置析出沉淀，洗涤，过滤得化合物Ⅱ。
在本发明的一个实施方式中，取馏分Fr.6.4.8，减压浓缩，浓缩液经反相柱层析，以甲醇-水为洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱液，用薄层色谱对各个洗脱液进行检测，根据检测结果按照洗脱顺序，依次得到6个馏分，分别命名为Fr.6.4.8.1-Fr.6.4.8.6，取馏分Fr.6.4.8.5，静置析出沉淀，洗涤，过滤得化合物Ⅲ。
在本发明的一个实施方式中，取馏分Fr.6.4.5，减压浓缩，浓缩液经正相柱层析，以二氯甲烷-甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱液，用薄层色谱对各个洗脱液进行检测，根据检测结果按照洗脱顺序，依次得到2个馏分，分别命名为Fr.6.4.5.1-Fr.6.4.5.2。
在本发明的一个实施方式中，取馏分Fr.6.4.5.2，减压浓缩，浓缩液依次经凝胶柱层析和反相柱层析，洗脱，收集洗脱液，减压浓缩后，以甲醇-水为流动相，经制备液相色谱对浓缩液进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩后，干燥，得到化合物Ⅳ。
进一步的，本发明还提供了一种上述化合物在制备治疗抗宫颈癌、肝癌、结肠癌或乳腺癌的药物中的应用。
本发明具有如下的有益效果：
通过对分离得到的化合物进行抗肿瘤活性研究，发现钩苞大丁草含有多种抗肿瘤活性化合物，存在作用靶点多和作用途径多等特点，其可以用于制备抗宫颈癌、肝癌、结肠癌或乳腺癌的药物。本发明提供的新化合物或衍生物可以作为其他化合物合成的先导物，以及新药开发和药理活性研究的原料。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据附图获得其他的附图。
图1a为化合物I的HR-ESI-MS图，m/z:523.1405[M+Na]+；
图1b为化合物I的HR-ESI-MS图，m/z:499.1444[M-H]-；
图2为化合物Ⅱ的HR-ESI-MS图，m/z:563.1364[M+Na]+；
图3a为化合物Ⅲ的HR-ESI-MS图，m/z:533.1260[M+Na]+；
图3b为化合物Ⅲ的HR-ESI-MS图，m/z:555.1356[M+HCOO]-；
图4a为化合物Ⅳ的HR-ESI-MS图，m/z:473.1649[M-H]-；
图4b为化合物Ⅳ的HR-ESI-MS图，m/z:497.1610[M+Na]+；
图5为化合物I的1H-NMR图；
图6为化合物Ⅱ的1H-NMR图；
图7为化合物Ⅲ的1H-NMR图；
图8为化合物Ⅳ的1H-NMR图；
图9为化合物I的13C-NMR图；
图10为化合物Ⅱ的13C-NMR图；
图11为化合物Ⅲ的13C-NMR图；
图12为化合物Ⅳ的13C-NMR图；
图13为化合物I的HMQC图；
图14为化合物Ⅱ的HMQC图；
图15为化合物Ⅲ的HMQC图；
图16为化合物Ⅳ的HMQC图；
图17为化合物I的HMBC图；
图18为化合物Ⅱ的HMBC图；
图19为化合物Ⅲ的HMBC图；
图20为化合物Ⅳ的HMBC图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
根据本发明的一个方面，本发明提供了如下4种结构式的化合物，分别为：
根据本发明的一个方面，本发明提供了上述化合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)提供钩苞大丁草，经干燥和粉碎处理后，用乙醇水溶液回流提取得提取液，将所述提取液浓缩得到第一提取物；
在本发明的一个实施例内，首先对钩苞大丁草进行称重，然后用乙醇水溶液进行回流提取3次，每次提取1.5h，第一次用8倍量乙醇水溶液，第二次和第三次分别用6倍量乙醇水溶液，过滤，合并得到提取液，减压浓缩，得到第一提取物；
在本发明的一个实施例内，上述乙醇水溶液的浓度为50％v/v；
(2)将第一提取物按照如下步骤进行大孔树脂柱分离：
将所述第一提取物加入到大孔树脂柱内，其中，所述大孔树脂选择D101、D-201、AB-8或HP-20型非极性大孔吸附树脂中的一种；大孔树脂柱内所述的大孔吸附树脂的体积与钩苞大丁草的重量之比为1:1；
采用水为洗脱剂对大孔树脂柱进行洗脱，除杂；
采用浓度为30-70％v/v的乙醇水溶液为洗脱剂对大孔树脂柱进行洗脱，收集洗脱液，浓缩得到第一浓缩物；
(3)将所述第一浓缩物经聚酰胺柱层析法、正相柱层析法、反相柱层析法或凝胶色谱法中的一种或多种进行分离。
在本发明的一个实施例内，柱层析法还包括使用Sephadex LH-20或ToyopearlHW-40F柱色谱进行分离纯化。
在本发明的一个实施例内，经正相柱层析时，选用100-300目的硅胶作为填料；
在本发明的一个实施例内，经正相柱层析时，选用二氯甲烷-甲醇、石油醚-乙酸乙酯、石油醚-二氯甲烷、二氯甲烷、甲醇、乙酸乙酯-甲醇作为洗脱剂。
在本发明的一个实施例内，将所述第一浓缩物经聚酰胺柱层析，以浓度为30-70％v/v的乙醇水溶液为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，浓缩得到第二浓缩物；
将所述第二浓缩物经正相柱层析，以体积比为49:1-1:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱液，用薄层色谱对各个洗脱液进行检测，根据检测结果按照洗脱顺序，依次得到8个馏分，分别命名为Fr.1-Fr.8。
在本发明的一个实施例内，取馏分Fr.6，减压浓缩，浓缩液经正相柱层析，以体积比为49:1-1:49的乙酸乙酯-甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱液，用薄层色谱对各个洗脱液进行检测，根据检测结果按照洗脱顺序，依次得到7个馏分，分别命名为Fr.6.1-Fr.6.7。
在本发明的一个实施例内，取馏分Fr.6.4，减压浓缩，浓缩液经反相柱层析，以浓度为10％-80％v/v的甲醇-水为洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱液，用薄层色谱对各个洗脱液进行检测，根据检测结果按照洗脱顺序，依次得到11个馏分，分别命名为Fr.6.4.1-Fr.6.4.11，其中，所述反相柱为MCI反相柱。
在本发明的一个实施例内，取馏分Fr.6.4.6，减压浓缩，浓缩液经正相柱层析，以体积比为9:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱液，用薄层色谱对各个洗脱液进行检测，根据检测结果按照洗脱顺序，依次得到3个馏分，分别命名为Fr.6.4.6.1-Fr.6.4.6.3。
在本发明的一个实施例内，取馏分Fr.6.4.6.2，减压浓缩，浓缩液经反相柱层析，以浓度为10％-80％v/v的甲醇-水为洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，浓缩液经正相柱层析，以体积比为9:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱液，用薄层色谱对各个洗脱液进行检测，合并含有目标成分的洗脱液，减压浓缩后，干燥，得到化合物Ⅰ，其中，所述反相柱为ODS反相柱。
在本发明的一个实施例内，取馏分Fr.6.4.9，静置析出沉淀，洗涤，过滤得化合物Ⅱ，其中，洗涤选用甲醇、二氯甲烷或乙酸乙酯，优选用甲醇。
在本发明的一个实施例内，取馏分Fr.6.4.8，减压浓缩，浓缩液经反相柱层析，以浓度为5％-80％v/v的甲醇-水为洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱液，用薄层色谱对各个洗脱液进行检测，根据检测结果按照洗脱顺序，依次得到6个馏分，分别命名为Fr.6.4.8.1-Fr.6.4.8.6，取馏分Fr.6.4.8.5，静置析出沉淀，洗涤，过滤得化合物Ⅲ，其中，所述反相柱为ODS反相柱。
在本发明的一个实施例内，取馏分Fr.6.4.5，减压浓缩，浓缩液经正相柱层析，以体积比为9:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱液，用薄层色谱对各个洗脱液进行检测，根据检测结果按照洗脱顺序，依次得到2个馏分，分别命名为Fr.6.4.5.1-Fr.6.4.5.2。
在本发明的一个实施例内，取馏分Fr.6.4.5.2，减压浓缩，浓缩液依次经凝胶柱层析和反相柱层析，洗脱，收集洗脱液，减压浓缩后，以浓度为30％v/v的甲醇-水为流动相，浓缩液经制备液相色谱对浓缩液进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩后，干燥，得到化合物Ⅳ，其中，所述反相柱为MCI反相柱。
在本发明的一个实施例内，取取馏分Fr.6.4.5.2，减压浓缩，首先浓缩液经Toyopearl HW-40F凝胶柱层析，以甲醇进行梯度洗脱，收集洗脱液，用薄层色谱对各个洗脱液进行检测，合并含有目标成分的洗脱液，减压浓缩，其次浓缩液经Sephadex LH-20凝胶柱层析，以浓度为50％v/v的丙酮-水进行梯度洗脱，收集洗脱液，用薄层色谱对各个洗脱液进行检测，合并含有目标成分的洗脱液，减压浓缩，然后浓缩液经MCI反相柱层析，以浓度为10％-80％v/v的甲醇-水进行梯度洗脱，收集洗脱液，减压浓缩后，以浓度为30％v/v的甲醇-水为流动相，浓缩液经制备液相色谱对浓缩液进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩后，干燥，得到化合物Ⅳ，其中，液相色谱的色谱柱为MegresC18色谱柱。
在本发明的一个实施例内，薄层色谱的条件为：
显色剂a：紫外灯(254nm，365nm)下观察荧光；显色剂b：碘显色；显色剂c：10％硫酸乙醇。
根据本发明的一个方面，本发明还公开了一种上述化合物在制备治疗抗宫颈癌、肝癌、结肠癌或乳腺癌的药物中的应用。
实例1
称取20kg钩苞大丁草药材，用浓度为50％v/v的乙醇水溶液进行回流提取，重复提取3次，每次1.5小时，第一次用8倍量乙醇水溶液，第二次和第三次分别加入6倍量乙醇水溶液，过滤，合并滤液后减压回收乙醇，直接加热浓缩不断加水挥发乙醇直到无明显乙醇味，得到第一提取物；
将第一提取物3000g拌样后，经D101大孔树脂柱分离，首先采用水为洗脱剂对大孔树脂柱进行洗脱，除杂，得到水段洗脱液；然后采用浓度为50％v/v的乙醇水溶液为洗脱剂对大孔树脂柱进行洗脱，得到乙醇段洗脱液，将乙醇段洗脱液进行浓缩，得到第一浓缩物；
将第一浓缩物经聚酰胺柱层析，以浓度为50％v/v的乙醇水溶液为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，浓缩得到第二浓缩物；
将第二浓缩物经正相柱层析，选用100-200目的硅胶作为填料，其中硅胶来源信息为：青岛海洋化工有限公司，批号：0180046，然后依次以体积比为50:1、25:1、10:1、7:1、5:1、3:1和1:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱液，用薄层色谱对各个洗脱液进行检测，根据检测结果按照洗脱顺序，依次得到8个馏分，分别命名为Fr.1-Fr.8；
取馏分Fr.6，减压浓缩，浓缩液经正相柱层析，选用200-300目的硅胶作为填料，其中硅胶来源信息为：青岛海洋化工有限公司，批号：020116，然后依次以体积比为50:1、25:1、10:1、7:1、5:1、3:1、1:1、1:5、1:10和1:50的乙酸乙酯-甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱液，用薄层色谱对各个洗脱液进行检测，根据检测结果按照洗脱顺序，依次得到7个馏分，分别命名为Fr.6.1-Fr.6.7；
取馏分Fr.6.4，减压浓缩，浓缩液经反相柱层析，以浓度为10％v/v的甲醇水溶液为洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱液，用薄层色谱对各个洗脱液进行检测，根据检测结果按照洗脱顺序，依次得到11个馏分，分别命名为Fr.6.4.1-Fr.6.4.11，其中，所述反相柱为MCI反相柱；
取馏分Fr.6.4.6，减压浓缩，浓缩液经正相柱层析，选用200-300目的硅胶作为填料，其中硅胶的来源信息为：青岛海洋化工有限公司，批号：020116，然后以体积比为9:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱液，用薄层色谱对各个洗脱液进行检测，根据检测结果按照洗脱顺序，依次得到3个馏分，分别命名为Fr.6.4.6.1-Fr.6.4.6.3；
取馏分Fr.6.4.6.2，减压浓缩，浓缩液经ODS反相柱层析，然后依次以浓度为10％v/v、30％v/v、45％v/v、65％v/v和80％v/v的甲醇-水为洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，浓缩液经正相柱层析，选用300目的硅胶作为填料，以体积比为9:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱液，用薄层色谱对各个洗脱液进行检测，合并含有目标成分的洗脱液，减压浓缩后，干燥，得到化合物Ⅰ；
取馏分Fr.6.4.9，静置析出沉淀，甲醇洗涤，过滤得化合物Ⅱ；
取馏分Fr.6.4.8，减压浓缩，浓缩液经ODS反相柱层析，然后依次以浓度为5％v/v、25％v/v、55％v/v、65％v/v和80％v/v的甲醇水溶液为洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱液，用薄层色谱对各个洗脱液进行检测，根据检测结果按照洗脱顺序，依次得到6个馏分，分别命名为Fr.6.4.8.1-Fr.6.4.8.6，取馏分Fr.6.4.8.5，静置析出沉淀，甲醇洗涤，过滤得化合物Ⅲ；
取馏分Fr.6.4.5，减压浓缩，浓缩液经正相柱层析，选用200-300目的硅胶作为填料，其中硅胶的来源信息为：青岛海洋化工有限公司，批号：020116，然后以体积比为9:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱液，用薄层色谱对各个洗脱液进行检测，根据检测结果按照洗脱顺序，依次得到2个馏分，分别命名为Fr.6.4.5.1-Fr.6.4.5.2；
取取馏分Fr.6.4.5.2，减压浓缩，首先浓缩液经Toyopearl HW-40F凝胶柱层析，以甲醇进行梯度洗脱，收集洗脱液，用薄层色谱对各个洗脱液进行检测，合并含有目标成分的洗脱液，减压浓缩，其次浓缩液经Sephadex LH-20凝胶柱层析，以浓度为50％v/v的丙酮水溶液进行梯度洗脱，收集洗脱液，用薄层色谱对各个洗脱液进行检测，合并含有目标成分的洗脱液，减压浓缩，然后浓缩液经MCI反相柱层析，以浓度为10％v/v的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集洗脱液，减压浓缩后，以浓度为30％v/v的甲醇水溶液为流动相，浓缩液经制备液相色谱对浓缩液进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩后，干燥，得到化合物Ⅳ，其中，液相色谱的色谱柱为MegresC18色谱柱。
薄层色谱的条件为：
显色剂a：紫外灯(254nm，365nm)下观察荧光；显色剂b：碘显色；显色剂c：10％硫酸乙醇。
结构鉴定：采用1H NMR、13C NMR核磁谱、二维核磁谱、高分辨质谱对分离得到的上述4种化合物进行结构鉴定，具体结果为：
化合物Ⅰ为白色粉末，分子式为：C22H28O13；HR-ESI-MS m/z:499.1444[M-H]-，calcd499.1446，523.1405[M+Na]+；calcd 523.1422；通过光谱技术确定化合物为Gerbelavinside A，其核磁数据见表1，表2。
化合物Ⅱ为白色固体,分子式为：C24H28O14；旋光度为：-331.9(c 1.88,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)222(3.37),266(3.22),308(3.06)nm；IR(KBr)νmax 3424,2924,1721,1705,1688,1622,1593,1476,1425,1379,1344,1319,1211,1134,1096,1060cm-1；HR-ESI-MSm/z：541.1549[M+H]+，calcd 541.1552,563.1364[M+Na]+,calcd 563.1371；通过光谱技术确定化合物为Gerbelavinside B，其核磁数据见表1，表2。
化合物Ⅲ为白色固体，分子式为：C23H26O13；旋光度为：-287.8(c 0.82,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)218(4.56),250(4.53),304(4.32)nm；IR(KBr)νmax 3426,2920,1722,1705,1690,1626,1582,1464,1148,1065cm-1；HR-ESI-MS m/z:555.1356[M+HCOO]-，calcd555.1345,533.1260[M+Na]+,calcd 533.1256；通过光谱技术确定化合物为Gerbelavinside C，其核磁数据见表1，表2。
化合物Ⅳ为淡黄色固体，分子式为：C21H30O12；旋光度为：-210.0(c 0.4,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)214(3.69),290(2.96)nm；IR(KBr)νmax 3399,2926,1686,1674,1659,1607,1564,1545,1524,1512,1464,1360,1290,1070,1047cm-1；HR-ESI-MS m/z:473.1649[M-H]-,calcd 473.1654,497.1610[M+Na]+,calcd 497.1630；通过光谱技术确定化合物为Gerbelavinside F，其核磁数据见表1，表2。
表1化合物Ⅰ-Ⅳ的1H NMR数据(in CD3OD ofⅠ,Ⅲ,Ⅳ,DMSO-d6ofⅡ)
表2化合物Ⅰ-Ⅳ的13C NMR数据(in CD3OD ofⅠ,Ⅲ,Ⅳ,DMSO-d6ofⅡ)
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实例2
在本发明的一个实施例内，本发明进一步对从钩苞大丁草分离出的化合物进行研究，具体抗肿瘤实验如下：
抗肿瘤实验的实验原理为：Cell Counting Kit-8(简称CCK-8)试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。该试剂中含有WST-8[化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐]，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物(Formazandye)，在450nm波长下产生吸收峰，吸收值与细胞量成线性正相关。根据光密度OD值推测出活细胞的数目，因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析；
步骤1，A549、MCF-7、HCT-15、A2780细胞株培养于含10％胎牛血清和1％双抗(100U/mL青霉素、100mg/L链霉素)的DMEM培养液中，37℃，5％CO2培养箱中传代培养。用0.25％胰蛋白酶胰酶消化贴壁细胞进行传代，取对数生长期细胞进行试验；
步骤2，取对数生长期人肺癌细胞(A549)、人乳腺癌细胞(MCF-7)、人结直肠腺癌细胞(HCT-15)、人卵巢癌细胞(A2780)，用10％胎牛血清的DMEM培养液调整细胞数为1×104个/mL，接种于96孔细胞培养板，每孔100μL，待细胞贴壁70-80％时，吸弃旧培养液，分别加入含不同浓度化合物Ⅰ-Ⅳ(75μmol/L、50μmol/L、25μmol/L、12.5μmol/L、6.25μmol/L)的培养液0.2mL，每个浓度平行5个孔，实验重复3次。培养24h后，每孔加入10μL CCK-8溶液，继续培养2h，用酶标仪测定在450nm处的吸光度。按照以下公式计算各组细胞增殖抑制率：细胞抑制率(％)＝1-(OD值实验组/OD值空白组)×100％，用SPSS25.0软件计算半数抑制浓度(IC50)，具体数据如表3：
表3化合物Ⅰ-Ⅳ的细胞毒活性IC50(μM)(X±S,n＝3)
其中，IC50(μM)为增殖抑制率为50％时化合物的浓度，用于表示抗肿瘤活性；顺铂为阳性对照药。
如表3所示，化合物Ⅰ-Ⅳ对人肺癌细胞(A549)、人乳腺癌细胞(MCF-7)、人结直肠腺癌细胞(HCT-15)、人卵巢癌细胞(A2780)均具较一定的抑制活性，可以用于人肺癌A549细胞、人乳腺癌MCF-7细胞、人结直肠腺癌HCT-15细胞、人卵巢癌A2780细胞的抑制剂的参考使用，并用于相关药物的制备。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内，不应将权利要求中的任何标记视为限制所涉及的权利要求。
Claims (15)
1.一种化合物，其特征在于，所述化合物的结构如式(Ⅰ)所示，
2.一种化合物，其特征在于，所述化合物的结构如式(Ⅱ)所示，
3.一种化合物，其特征在于，所述化合物的结构如式(Ⅲ)所示，
4.一种化合物，其特征在于，所述化合物的结构如式(Ⅳ)所示，
5.权利要求1-4任一所述的化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提供钩苞大丁草，经干燥和粉碎处理后，用乙醇水溶液回流提取得提取液，将所述提取液浓缩得到第一提取物；
(2)将第一提取物按照如下步骤进行大孔树脂柱分离：
将所述第一提取物加入到大孔树脂柱内，其中，所述大孔树脂选择D101、D-201、AB-8或HP-20型非极性大孔吸附树脂中的一种；大孔树脂柱内所述的大孔吸附树脂的体积与钩苞大丁草的重量之比为0.5-5:1；
采用水为洗脱剂对大孔树脂柱进行洗脱，除杂；
采用浓度为30-70％v/v的乙醇水溶液为洗脱剂对大孔树脂柱进行洗脱，收集洗脱液，浓缩得到第一浓缩物；
(3)将所述第一浓缩物经聚酰胺柱层析法、正相柱层析法、反相柱层析法或凝胶色谱法中的一种或多种进行分离。
6.根据权利要求5所述的化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)具体为：
将所述第一浓缩物经聚酰胺柱层析，以浓度为30-70％v/v的乙醇水溶液为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，浓缩得到第二浓缩物；
将所述第二浓缩物经正相柱层析，以二氯甲烷-甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱液，用薄层色谱对各个洗脱液进行检测，根据检测结果按照洗脱顺序，依次得到8个馏分，分别命名为Fr.1-Fr.8。
7.根据权利要求6所述的化合物的制备方法，其特征在于，取馏分Fr.6，减压浓缩，浓缩液经正相柱层析，以乙酸乙酯-甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱液，用薄层色谱对各个洗脱液进行检测，根据检测结果按照洗脱顺序，依次得到7个馏分，分别命名为Fr.6.1-Fr.6.7。
8.根据权利要求7所述的化合物的制备方法，其特征在于，取馏分Fr.6.4，减压浓缩，浓缩液经反相柱层析，以甲醇-水为洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱液，用薄层色谱对各个洗脱液进行检测，根据检测结果按照洗脱顺序，依次得到11个馏分，分别命名为Fr.6.4.1-Fr.6.4.11。
9.根据权利要求8所述的化合物的制备方法，其特征在于，取馏分Fr.6.4.6，减压浓缩，浓缩液经正相柱层析，以二氯甲烷-甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱液，用薄层色谱对各个洗脱液进行检测，根据检测结果按照洗脱顺序，依次得到3个馏分，分别命名为Fr.6.4.6.1-Fr.6.4.6.3。
10.根据权利要求9所述的化合物的制备方法，其特征在于，取馏分Fr.6.4.6.2，减压浓缩，浓缩液经反相柱层析，以浓度为10％-80％v/v的甲醇-水为洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，浓缩液经正相柱层析，以二氯甲烷-甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱液，用薄层色谱对各个洗脱液进行检测，合并含有目标成分的洗脱液，减压浓缩后，干燥，得到化合物Ⅰ。
11.根据权利要求8所述的化合物的制备方法，其特征在于，取馏分Fr.6.4.9，静置析出沉淀，洗涤，过滤得化合物Ⅱ。
12.根据权利要求8所述的一种化合物的制备方法，其特征在于，取馏分Fr.6.4.8，减压浓缩，浓缩液经反相柱层析，以甲醇-水为洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱液，用薄层色谱对各个洗脱液进行检测，根据检测结果按照洗脱顺序，依次得到6个馏分，分别命名为Fr.6.4.8.1-Fr.6.4.8.6，取馏分Fr.6.4.8.5，静置析出沉淀，洗涤，过滤得化合物Ⅲ。
13.根据权利要求8所述的化合物的制备方法，其特征在于，取馏分Fr.6.4.5，减压浓缩，浓缩液经正相柱层析，以二氯甲烷-甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱液，用薄层色谱对各个洗脱液进行检测，根据检测结果按照洗脱顺序，依次得到2个馏分，分别命名为Fr.6.4.5.1-Fr.6.4.5.2。
14.根据权利要求13所述的化合物的制备方法，其特征在于，取馏分Fr.6.4.5.2，减压浓缩，浓缩液依次经凝胶柱层析和反相柱层析，洗脱，收集洗脱液，减压浓缩后，以甲醇-水为流动相，经制备液相色谱对浓缩液进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩后，干燥，得到化合物Ⅳ。
15.权利要求1-4任一所述的化合物在制备治疗抗宫颈癌、肝癌、结肠癌或乳腺癌的药物中的应用。
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