KR102532345B1 - 중약 조성물에서 8가지 성분을 분리하는 방법 - Google Patents

중약 조성물에서 8가지 성분을 분리하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 중약 조성물의 분리 방법을 제공하며, 복방의 약리 작용 메커니즘 및 복방약물 배오법칙의 과학적 내용을 밝히기 위하여, 그 물질적 기반에 대한 체계적인 연구가 매우 필요하다. 이를 바탕으로, 본 발명의 약학 조성물의 화학 성분에 대한 심도 있는 연구를 통하여, 8개의 화합물을 분리해 냈으며, 8개의 화합물은 각각 10-O-(p-하이드록시 신나모일)-아독스오시딕 산(10-O-(p-hydroxycinnamoyl)-adoxosidic acid), 알로에-에모딘-8-O-β-D-글루코피라노사이드, 퀘르세틴, 마타이레시놀-4'-O-β-D-글루코시드(matairesinol-4'-O-glucoside), 리퀴리틴 아피오사이드, 에피보겔로사이드(epi-vogeloside), 보겔로사이드(vogeloside), 카페인산 에틸에스테르이며, 본 발명의 약학 조성물의 품질 관리을 위해 새로운 방법을 제공하였다.

Description

중약 조성물에서 8가지 성분을 분리하는 방법
본 발명은 중약 조성물에서 여러 가지 성분을 분리하는 방법에 관한 것이다.
중약 복방은 중의 처방의 주요 형태로 수천년의 임상적 사용을 거쳐 복방이 단일 약제보다 더 강한 치료 효과를 얻을 수 있으며, 복방 구성의 과학적 의미가 충분히 입증되었다. 본 발명의 약학 조성물은 연교, 금은화 및 말린 마황 등 13가지 생약으로 구성되며, 해열, 해독 및 폐열 방출 효능이 있으며 인플루엔자 치료에 사용된다. 임상 연구를 통해 본 발명의 약학 조성물은 인플루엔자 및 급성 상기도 감염을 치료할 경우 치료 효과가 확실하면서도 분명한 효과가 있음이 증명되었다. 복방의 약리 작용 메커니즘 및 복방 약물의 배오법칙의 과학적 내용을 밝히기 위하여서는 그 물질적 기반에 대한 체계적인 연구가 매우 필요하다. 이를 바탕으로, 본 발명의 약학 조성물의 화학 성분에 대한 심도 있는 연구를 통하여 8개의 화합물을 분리 해냈으며, 상기 8개의 화합물은 각각 10-O-(p-하이드록시 신나모일)-아독스오시딕 산(10-O-(p-hydroxycinnamoyl)-adoxosidic acid), 알로에-에모딘-8-O-β-D-글루코피라노사이드, 퀘르세틴, 마타이레시놀-4'-O-β-D-글루코시드(matairesinol-4'-O-glucoside), 리퀴리틴 아피오사이드, 에피보겔로사이드(epi-vogeloside), 보겔로사이드(vogeloside) 및 카페인산 에틸에스테르이며, 본 발명의 약학 조성물의 품질 관리를 위해 새로운 방법을 제공하였다.
본 발명은 중약 조성물에서 8가지 화합물을 분리하는 방법을 제공하였다.
해당 중약 조성물은 연교 200-300 중량부, 마황 60-100 중량부, 대황 40-60 중량부, 어성초 200-300 중량부, 금은화 200-300 중량부, 판람근 200-300 중량부, 광곽향 60-100 중량부, 관중 200-300 중량부, 홍경천 60-100 중량부, 박하뇌 5-9 중량부, 행인 60-100 중량부, 감초 60-100 중량부 및 석고 200-300 중량부의 생약들로 제조된다.
본 발명에 따른 분리 방법은 다음의 단계(1)내지 단계(7)을 포함한다.
(1) 해당 중약 조성물의 전체 추출물을 AB-8 거대다공성 수지로 흡착한 후, 물, 10%의 에탄올, 30%의 에탄올 및 50%의 에탄올을 순차적으로 사용하여 용출한 다음, 각 부분의 용출액을 각각 수집하고 농축하여 각 부위 추출물을 얻는다.
(2) 단계(1)에서 얻은 50%의 에탄올로 용출한 부위 추출물을 취하여 역상 실리카 겔 ODS-AQ-HG에 첨가하고, 혼합 시료를 자연 건조 시킨 후 시료를 로딩하고, 역상 ODS-AQ-HG 개방컬럼을 이용하여 분리하고, 부피비가 20: 80, 40: 60, 60: 40, 80:20인 메탄올-물 및 100%인 메탄올을 사용하여 순차적으로 용출하여, 분획물 A 내지 분획물E를 차례로 얻는다.
(3) 단계(2)에서 얻은 혼합 시료 분획물 A를 취하여, 역상 실리카 겔 ODS-AQ-HG에 첨가하여 혼합하고, 혼합 시료 ODS를 자연 건조 시킨 후 혼합 시료 ODS를 로딩 컬럼 내에 추가한 다음 중압 조제 액체를 분리하기 위해 로딩하고, 중압 조제 액체를 구배에 의해 분리한 후, 메탄올-물의 부피비는 25:75 내지 60:40으로 유속은 25mL/min으로하여, 동일한 부피 500mL로 분획물을 삼각 플라스크에 수득한 후 감압 농축하고, 박층 크로마토그래피 판으로 분획물을 검증 혼합한 후 다시 감압 농축하여 분획물 A-1 내지 분획물 A-7을 얻는다.
(4) 단계(3)에서 얻은 혼합 시료 분획물 A-2를 취하여 실리카 겔과 혼합하고, 실리카 겔 컬럼에 로딩하여 부피비가 8:1인 디클로로 메탄-메탄올로 등용매 용리하고, 동일한 부피 50mL로 분획물을 수득하며, 용출 부피는 800mL이고, 박층 크로마토그래피 판으로 분획물을 검증 혼합하여 분획물 A-1-1 내지 분획물 A-1-4를 얻는다.
(5)단계(4)에서 얻은 혼합 시료 분획물 A-1-2를 취해 메탄올에 용해 시키고, 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 예비 분리를 실시하며, 여기에서 이동상은 부피비가 50:50인 메탄올-물이고, 유속은 12mL/min이고, 검출 파장은 210nm이며, 유지 시간이 6 내지 8min, 9 내지 10min, 12 내지 13min인 크로마토그래피 피크를 각각 수집하고 감압하에 용매를 회수 하는 단계로써 이 단계에서 다음과 같은 분리를 각각 실시한다.
6 내지 8min의 크로마토그래피 피크를 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제하고, 이동상은 부피비가 25:75인 아세토니트릴-물이고, 유속은 12mL/min이고, 검출 파장은 210nm이며, 크로마토그래피 컬럼은 YMC-Pack R&D ODS-A, 250×20mm, S-10μm인 조건하에 유지 시간이 8 내지 9min인 크로마토그래피 피크를 수집하고, 감압하에 용매를 회수하여 화합물2:알로에-에모딘-8-O-β-D-글루코피라노사이드를 얻는다.
9 내지 10min의 크로마토그래피 피크를 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제하고, 이동상은 부피비가 45:55인 메탄올-물이고, 유속은 12mL/min이고, 검출 파장은 210nm이며, 크로마토그래피 컬럼은 YMC-Pack R&D ODS-A, 250×20mm, S-10μm인 조건하에 유지 시간이 21 내지 23min인 크로마토그래피 피크를 수집하고, 감압하에 용매를 회수하여 화합물3:퀘르세틴을 얻는다.
10 내지 12min의 크로마토그래피 피크를 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제하고, 이동상은 부피비가 25:75인 아세토니트릴-물이고, 유속은 12mL/min이고, 검출 파장은 210nm이며, 크로마토그래피 컬럼은 YMC-Pack R&D ODS-A, 250×20mm, S-10μm인 조건하에 유지 시간이 9 내지 10min인 크로마토그래피 피크를 수집하고, 감압하에 용매를 회수하여 화합물4:마타이레시놀-4’-O-β-D-글루코시드를 얻는다.
(6)단계(4)에서 얻은 혼합 시료 분획물 A-1-3을 취하여 메탄올에 용해시키고, 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 예비 분리를 실시하며, 여기에서 이동상은 부피비가 30:70인 메탄올-물이고, 유속은 12mL/min이고, 검출 파장은 210nm이며, 유지 시간이 10 내지 11min, 17 내지 19min, 21 내지 24min인 크로마토그래피 피크를 각각 수집한 후 감압하에 용매를 회수하고, 17 내지 19min은 화합물6:에피보겔로사이드고, 21 내지 24min은 화합물7：보겔로사이드며, 10-11min의 크로마토그래피 피크를 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제하고, 이동상은 부피비가 15:85인 아세토니트릴-물이고, 유속은 12mL/min이고, 검출 파장은 210nm이며, 크로마토그래피 컬럼은 YMC-Pack R&D ODS-A, 250×20mm, S-10μm인 조건하에 유지 시간이 14 내지 16min인 크로마토그래피 피크를 수집하여 감압하에 용매를 회수하여 화합물5:리퀴리틴 아피오사이드를 얻는다.
(7)단계(3)에서 얻은 혼합 시료 분획물 A-3을 취하여 메탄올에 용해시키고, 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 예비 분리를 실시하며, 여기에서 이동상은 부피비가 60:40인 메탄올-물이고, 유속은 12mL/min이고, 검출 파장은 210nm이고, 유지 시간이 14 내지 15min, 19 내지 21min인 크로마토그래피 피크를 각각 수집하고, 감압하에 용매를 회수 하며, 19 내지 21min의 크로마토그래피 피크의 수집액은 부피비가 2:1인 디클로로 메탄-메탄올 용액에서 백색 침전물이 침전 되어 화합물8을 얻고, 14 내지 15min의 크로마토그래피 피크를 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제하고, 이동상은 부피비가 30:70인 아세토니트릴-물이고, 유속은 12mL/min이고, 검출 파장은 210nm이며, 크로마토그래피 컬럼은 YMC-Pack R&D ODS-A, 250×20mm, S-10μm인 조건하에 유지 시간이 18 내지 20min인 크로마토그래피 피크를 수집하여, 감압하에 용매를 회수하여 화합물1：10-O-(p-하이드록시 신나모일)-아독스오시딕 산(10-O-(p-hydroxycinnamoyl)-adoxosidic acid)를 얻는다.
바람직하게는 본 발명에 따른 분리 방법은 다음의 단계(1)내지 단계(7)을 포함한다.
(1)해당 중약 조성물의 전체 추출물 5kg을 AB-8 거대다공성 수지로 흡착한 후, 순차적으로 물 150L, 10%의 에탄올 87.5L, 30%의 에탄올 225L, 50%의 에탄올 250L를 사용하여 용출한 후 농축하여 각 부위 추출물을 얻는다.
(2)단계(1)에서 얻은 50%의 에탄올로 용출한 부위 추출물을 200g 취하여 역상 실리카 겔 ODS-AQ-HG S-50μm를 200g 첨가하여 혼합하고, 혼합 시료 ODS를 자연 건조 시킨 후 시료를 로딩하고, 역상 ODS-AQ-HG S-50μm 개방컬럼을 이용하여 분리하며, 시료층과 블랭크층의 높이 비는 1:4이며, 감압 방식으로 순차적으로 부피비가 20:80인 메탄올-물 6L로 용출하고, 40:60인 메탄올-물 7L로 용출하고, 60:40인 메탄올-물 7L로 용출하고, 80:20인 메탄올-물 5L로 용출하고, 100% 메탄올 3L로 용출하여, 분획물 A 내지 분획물E를 차례로 얻는다.
(3)단계(2)에서 얻은 혼합 시료 분획물 A를 50.0g 취하여, 역상 실리카 겔 ODS-AQ-HG S-50μm을 50g 첨가하여 혼합하고, 혼합 시료 ODS를 자연 건조 시킨 후 혼합 시료 ODS를 로딩 컬럼 내에 추가한 다음 중압 조제 액체를 분리하기 위해 로딩하고, 분취용 컬럼 충전재로 ODS-AQ-HG S-50μm을 사용하며, 중압 조제 액체를 구배에 의해 분리한 후, 메탄올-물의 부피비는 25:75 내지 60:40으로 유속은 25mL/min으로하여, 동일한 부피 500mL로 분획물을 삼각 플라스크에 수득한 후 감압 농축하고, 박층 크로마토그래피 판으로 분획물을 검증 혼합한 후 다시 감압 농축하여 분획물 A-1 내지 분획물 A-7을 얻는다.
(4) 단계(3)에서 얻은 혼합 시료 분획물 A-2를 3.2g 취하여 6.4g의 200 내지 300메쉬의 실리카 겔과 혼합하고, 실리카 겔 컬럼에 로딩하고, 시료층과 블랭크층의 높이 비는 1:50이며, 부피비가 8:1인 디클로로 메탄-메탄올로 등용매 용리하고, 동일한 부피 50mL로 분획물을 수득하며, 용출 부피는 800mL이고, 박층 크로마토그래피 판으로 분획물을 검증 혼합하여 분획물 A-1-1 내지 분획물 A-1-4를 얻는다.
(5) 단계(4)에서 얻은 혼합 시료 분획물 A-1-2를 취해 메탄올에 용해 시키고, 용해액을 0.45μm의 미세다공성 여과막으로 여과하고, 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 예비 분리를 실시하며, 여기에서 이동상은 부피비가 50:50인 메탄올-물이고, 유속은 12mL/min이고, 검출 파장은 210nm이며, 유지 시간이 6 내지 8min, 9 내지 10min, 12 내지 13min인 크로마토그래피 피크를 각각 수집하고 감압하에 용매를 회수 하는단계로써 이 단계에서 다음과 같은 분리를 각각 실시한다.
6 내지 8min의 크로마토그래피 피크를 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제하고, 이동상은 부피비가 25:75인 아세토니트릴-물이고, 유속은 12mL/min이고, 검출 파장은 210nm이며, 크로마토그래피 컬럼은 YMC-Pack R&D ODS-A, 250×20mm, S-10μm인 조건하에 유지 시간이 8 내지 9min인 크로마토그래피 피크를 수집하고, 감압하에 용매를 회수하여 화합물2:알로에-에모딘-8-O-β-D-글루코피라노사이드를 얻는다.
9 내지 10min의 크로마토그래피 피크를 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제하고, 이동상은 부피비가 45:55인 메탄올-물이고, 유속은 12mL/min이고, 검출 파장은 210nm이며, 크로마토그래피 컬럼은 YMC-Pack R&D ODS-A, 250×20mm, S-10μm인 조건하에 유지 시간이 21 내지 23min인 크로마토그래피 피크를 수집하고, 감압하에 용매를 회수하여 화합물3:퀘르세틴을 얻는다.
10 내지 12min의 크로마토그래피 피크를 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제하고, 이동상은 25:75인 아세토니트릴-물이고, 유속은 12mL/min이고, 검출 파장은 210nm이며, 크로마토그래피 컬럼은 YMC-Pack R&D ODS-A, 250×20mm, S-10μm인 조건하에 유지 시간이 9 내지 10min인 크로마토그래피 피크를 수집하고, 감압하에 용매를 회수하여 화합물4:마타이레시놀-4’-O-β-D-글루코시드를 얻는다.
(6) 단계(4)에서 얻은 혼합 시료 분획물 A-1-3을 취하여 메탄올에 용해시키고, 용해액을 0.45μm의 미세다공성 여과막으로 여과하고, 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 예비 분리를 실시하며, 여기에서 이동상은 부피비가 30:70인 메탄올-물이고, 유속은 12mL/min이고, 검출 파장은 210nm이며, 유지 시간이 10 내지 11min, 17 내지 19min, 21 내지 24min인 크로마토그래피 피크를 각각 수집한 후 감압하에 용매를 회수하고, 17 내지 19min은 화합물6:에피보겔로사이드고, 21 내지 24min은 화합물7：보겔로사이드며, 10-11min의 크로마토그래피 피크를 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제하고, 이동상은 부피비가 15:85인 아세토니트릴-물이고, 유속은 12mL/min이고, 검출 파장은 210nm이며, 크로마토그래피 컬럼은 YMC-Pack R&D ODS-A, 250×20mm, S-10μm인 조건하에 유지 시간이 14 내지 16min인 크로마토그래피 피크를 수집하여 감압하에 용매를 회수하여 화합물5:리퀴리틴 아피오사이드를 얻는다.
(7) 단계(3)에서 얻은 혼합 시료 분획물 A-3을 취하여 메탄올에 용해시키고, 용해액을 0.45μm의 미세다공성 여과막으로 여과하고, 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 예비 분리를 실시하며, 여기에서 이동상은 부피비가 60:40인 메탄올-물이고, 유속은 12mL/min이고, 검출 파장은 210nm이고, 유지 시간이 14 내지 15min, 19 내지 21min인 크로마토그래피 피크를 각각 수집하고, 감압하에 용매를 회수 하며, 19 내지 21min의 크로마토그래피 피크의 수집액은 부피비가 2:1인 디클로로 메탄-메탄올 용액에서 백색 침전물이 침전 되어 화합물8을 얻고, 14 내지 15min의 크로마토그래피 피크를 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제하고, 이동상은 부피비가 30:70인 아세토니트릴-물이고, 유속은 12mL/min이고, 검출 파장은 210nm이며, 크로마토그래피 컬럼은 YMC-Pack R&D ODS-A, 250×20mm, S-10μm인 조건하에 유지 시간이 18 내지 20min인 크로마토그래피 피크를 수집하여, 감압하에 용매를 회수하여 화합물1：10-O-(p-하이드록시 신나모일)-아독스오시딕 산(10-O-(p-hydroxycinnamoyl)-adoxosidic acid)를 얻는다.
중약 조성물은 다음의 생약들로 제조되는 것이 바람직하다.
연교 200중량부, 금은화 300중량부, 판람근 200중량부, 대황 40중량부, 광곽향 60중량부, 관중 300중량부, 홍경천 100중량부, 박하뇌 9중량부, 마황 60중량부, 행인 100중량부, 어성초 200중량부, 감초 100중량부 및 석고 200중량부.
중약 조성물은 생약들로 제조되는 것이 바람직하다.
연교 300중량부, 금은화 200중량부, 판람근 300중량부, 대황 60중량부, 광곽향 100중량부, 관중 200중량부, 홍경천 60중량부, 박하뇌 5중량부, 마황 100중량부, 행인 60중량부, 어성초 300중량부, 감초 60중량부 및 석고 300중량부.
중약 조성물은 생약들로 제조되는 것이 바람직하다.
연교 278중량부, 금은화 294중량부, 판람근 285중량부, 대황 55중량부, 광곽향 95중량부, 관중 290중량부, 홍경천 87중량부, 박하뇌 8.5중량부, 마황 88중량부, 행인 80중량부, 어성초 284중량부, 감초 95중량부, 석고 277중량부.
본 발명에 따른 중약 조성물의 전체 추출물은 다음의 단계(1) 내지 단계(5)로 제조된다.
(1)생약들을 중량비 기준으로 계량하고, 깨끗이 씻어서 선별하여 적절하게 분쇄한다.
(2)광곽향을 잘게 분쇄한 후, 10배 양의 물을 첨가하여 휘발성 오일을 추출하며, 휘발성 오일의 추출 시간은 8시간이며, 휘발성 오일을 수집하여 사용을 위해 보존하고, 추출액을 여과한 후, 찌꺼기를 버리고, 여과액은 사용을 위해 보존한다.
(3)연교, 마황, 어성초 및 대황은 12배 양의 70% 에탄올로 매번 2.5시간씩 3번 추출하고, 추출액을 혼합 및 여과하여 에탄올을 회수하고, 여과액은 사용을 위해 보존한다.
(4)금은화, 석고, 판람근, 관중, 감초 및 홍경천에 12배 양의 물을 첨가하여 비등할 때까지 끓이고, 행인을 첨가하여 매번 한시간씩 2번 끓인 후, 추출액을 혼합 및 여과하여 얻은 여과액을 상기 단계(2)에서 광곽향을 추출한 후 얻은 여과액과 혼합하고, 60℃에서 측정한 상대 밀도가 1.10 내지 1.15인 투명한 추출물로 농축한 후, 이어서 에탄올을 첨가하여 알코올 농도를 70%로 조정한 후 냉각 보관 및 여과하여 알코올 냄새가 나지 않을 때까지 에탄올을 회수하여 얻은 투명한 추출물을 사용을 위해 보존한다.
(5)단계(4)에서 얻은 투명한 추출물과 단계(3)에서 얻은 알코올 추출물을 혼합하여, 60℃에서 측정한 상대 밀도가1.15-1.20인 투명한 추출물로 농축한 후, 이를 건조하여 얻은 총 추출물을 사용을 위해 보존한다.
본 발명에 의해 제공되는 분리 방법으로 8가지의 화합물을 분리하여 얻을수 있으며, 상기 화합물은 각각 10-O-(p-하이드록시 신나모일)-아독스오시딕 산(10-O-(p-hydroxycinnamoyl)-adoxosidic acid), 알로에-에모딘-8-O-β-D-글루코피라노사이드, 퀘르세틴, 마타이레시놀-4'-O-β-D-글루코시드(matairesinol-4'-O-glucoside), 리퀴리틴 아피오사이드, 에피보겔로사이드(epi-vogeloside), 보겔로사이드(vogeloside) 및 카페인산 에틸에스테르이다.
실시예1
중량비 기준으로 연교 20kg, 금은화 30kg, 판람근 20kg, 대황 4kg, 광곽향 6kg, 관중 30kg, 홍경천 10kg, 박하뇌 0.9kg, 마황 6kg, 행인 10kg, 어성초 20kg, 감초10kg, 석고 20kg을 계량하여, 다음의 프로세스로 추출한다.
(1)생약들을 중량비 기준으로 계량하고, 깨끗이 씻어서 선별하여 적절하게 분쇄한다.
(2)광곽향을 잘게 분쇄한 후, 10배 양의 물을 첨가하여 휘발성 오일을 추출하며, 휘발성 오일의 추출 시간은 8시간이며, 휘발성 오일을 수집하여 사용을 위해 보존하고, 추출액을 여과한 후, 찌꺼기를 버리고, 여과액은 사용을 위해 보존한다.
(3)연교, 마황, 어성초 및 대황은 12배 양의 70% 에탄올로 매번 2.5시간씩 3번 추출하고, 추출액을 혼합 및 여과하여 에탄올을 회수하고, 여과액은 사용을 위해 보존한다.
(4)금은화, 석고, 판람근, 관중, 감초 및 홍경천에 12배 양의 물을 첨가하여 비등할 때까지 끓이고, 행인을 첨가하여 매번 한시간씩 2번 끓인 후, 추출액을 혼합 및 여과하여 얻은 여과액을 상기 단계(2)에서 광곽향을 추출한 후 얻은 여과액과 혼합하고, 60℃에서 측정한 상대 밀도가 1.15인 투명한 추출물로 농축한 후, 이어서 에탄올을 첨가하여 알코올 농도를 70%로 조정한 후 냉각 보관 및 여과하여 알코올 냄새가 나지 않을 때까지 에탄올을 회수하여 얻은 투명한 추출물을 사용을 위해 보존한다.
(5)단계(4)에서 얻은 투명한 추출물과 단계(3)에서 얻은 알코올 추출물을 혼합하여, 60℃에서 측정한 상대 밀도가 1.20인 투명한 추출물로 농축하며, 건조하여 총 추출물을 얻어 사용을 위해 보존하는 프로세스로 추출한다.
분리 방법의 단계는 다음과 같다.
1, 기구 및 재료
Bruker Alpha 적외선 분광계(Bruker사, 스위스); Bruker AVIIIHD 600 핵 자기 공명 분광계(Bruker사, 스위스); Synapt G2-S Mass 질량 분광계(Waters사, 미국); Combi Flash Rf 중압-저압 분취용 액체 크로마토그래피(Teledvne ISCO사, 미국); NP7000 분취용 액체 크로마토그래피(강소 한방과학기술 유한회사); Milli-Q 퓨어 워터 정수기(Millipore사, 미국); AL204 분석용 전자저울(Mettler Toledo사, 미국); YMC ODS-A-HG 50μm 역상 실리카 겔(YMC사, 일본); 컬럼 크로마토그래피 용 실리카 겔 (100~200메쉬 및 200~300메쉬, 칭다오 해양 화학 공장); 박층 크로마토그래피 용 실리카 겔 플레이트GF254(칭다오 해양 화학 공장); YMC-Pack R&D ODS-A(250×20mm, S-10μm, YMC사, 일본); 본 발명의 중약 조성물의 전체 추출물 (스자좡 이링 약업(
Figure 112020051264486-pct00001
) 주식회사, 배치 번호:B1509001); 크로마토그래피 전용 아세토니트릴, 메탄올 (샹하이 아다마스 시약(上海阿達瑪斯試劑) 회사); 분석시약(베이징 화학공장).
2, 추출 및 분리
(1) 해당 중약 조성물의 전체 추출물을 5kg 취하여 AB-8 거대다공성 수지로 흡착한 후, 순차적으로 물 150L, 10%의 에탄올 87.5L, 30%의 에탄올 225L, 50%의 에탄올 250L를 사용하여 용출한 후 농축하여 각 부위 추출물을 얻는다.
(2) 단계(1)에서 얻은 50%의 에탄올로 용출한 부위 추출물을 200g 취하여 역상 실리카 겔 ODS-AQ-HG S-50μm를 200g 첨가하여 혼합하고, 혼합 시료 ODS를 자연 건조 시킨 후 시료를 로딩하고, 역상 ODS-AQ-HG S-50μm 개방컬럼을 이용하여 분리하며, 시료층과 블랭크층의 높이 비는 1:4이며, 감압 방식으로 순차적으로 부피비가 20:80인 메탄올-물 6L로 용출하고, 40:60인 메탄올-물 7L로 용출하고, 60:40인 메탄올-물 7L로 용출하고, 80:20인 메탄올-물 5L로 용출하고, 100% 메탄올 3L로 용출하여, 차례로 분획물 A 내지 분획물E를 얻는다.
(3) 단계(2)에서 얻은 혼합 시료 분획물 A를 50.0g 취하여, 역상 실리카 겔 ODS-AQ-HG S-50μm을 50g 첨가하여 혼합하고, 얻은 시료 분획물 A와 역상 실리카겔의 혼합물을 자연 건조 시킨 후 시료 분획물 A와 역상 실리카겔의 혼합물을 중압 분취용 액체 크로마토그래피의 로딩 컬럼 내에 추가한 다음 중압 분취용 액체 크로마토그래피 분리를 위해 로딩하고, 분취용 컬럼 충전재로 ODS-AQ-HG S-50μm을 사용하며, 용리제로서의 메탄올-물의 부피비가 25:75 내지 60:40이고, 유속이 25mL/min인 구배 용리를 수행하여, 동일한 부피 500mL로 분획물을 삼각 플라스크에 수득한 후 감압 농축하고, 박층 크로마토그래피 판으로 분획물을 검증하고, 성분이 동일한 분획물을 혼합하여 7개의 분획물을 얻고, 이어서, 7개의 분획물을 다시 감압 농축하여 분획물 A-1 내지 분획물 A-7을 얻는다.
(4) 단계(3)에서 얻은 혼합 시료 분획물 A-2를 3.2g 취하여 6.4g의 200 내지 300메쉬의 실리카 겔과 혼합하고, 실리카 겔 컬럼에 로딩하고, 시료층과 블랭크층의 높이 비는 1:50이며, 부피비가 8:1인 디클로로메탄-메탄올로 등용매 용리하는데, 용리 부피는 800mL로 하여 용리하여, 동일한 부피 50mL로 분획물을 수득하고, 박층 크로마토그래피 판으로 수득한 분획물을 검증하고, 성분이 동일한 분획물을 혼합하여 분획물 A-2-1 내지 분획물 A-2-4를 얻는다
(5) 단계(4)에서 얻은 혼합 시료 분획물 A-2-2를 취해 메탄올에 용해 시키고, 용해액을 0.45μm의 미세다공성 여과막으로 여과하고, ODS-AQ-HG가 충전된 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 예비 분리를 실시하며, 여기에서 이동상은 부피비가 50:50인 메탄올-물이고, 유속은 12mL/min이고, 검출 파장은 210nm이며, 유지 시간이 6 내지 8min, 9 내지 10min, 12 내지 13min인 크로마토그래피 피크를 각각 수집하여 감압하에 용매를 회수 하며, 이 단계에서 다음과 같은 분리를 각각 실시한다.
6 내지 8min의 크로마토그래피 피크를 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제하고, 이동상은 부피비가 25:75인 아세토니트릴-물이고, 유속은 12mL/min이고, 검출 파장은 210nm이며, 크로마토그래피 컬럼은 YMC-Pack R&D ODS-A, 250×20mm, S-10μm인 조건하에 유지 시간이 8 내지 9min인 크로마토그래피 피크를 수집하고, 감압하에 용매를 회수하여 화합물2:알로에-에모딘-8-O-β-D-글루코피라노사이드를 얻는다.
9 내지 10min의 크로마토그래피 피크를 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제하고, 이동상은 부피비가 45:55인 메탄올-물이고, 유속은 12mL/min이고, 검출 파장은 210nm이며, 크로마토그래피 컬럼은 YMC-Pack R&D ODS-A, 250×20mm, S-10μm인 조건하에 유지 시간이 21 내지 23min인 크로마토그래피 피크를 수집하고, 감압하에 용매를 회수하여 화합물3:퀘르세틴을 얻는다.
12 내지 13min의 크로마토그래피 피크를 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제하고,이동상은 25:75인 아세토니트릴-물이고, 유속은 12mL/min이고, 검출 파장은 210nm이며, 크로마토그래피 컬럼은 YMC-Pack R&D ODS-A, 250×20mm, S-10μm인 조건하에 유지 시간이 9 내지 10min인 크로마토그래피 피크를 수집하고, 감압하에 용매를 회수하여 화합물4:마타이레시놀-4'-O-β-D-글루코시드를 얻는다.
(6) 단계(4)에서 얻은 혼합 시료 분획물 A-2-3을 취하여 메탄올에 용해시키고, 용해액을 0.45μm의 미세다공성 여과막으로 여과하고, ODS-AQ-HG가 충전된 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 예비 분리를 실시하며, 여기에서 이동상은 부피비가 30:70인 메탄올-물이고, 유속은 12mL/min이고, 검출 파장은 210nm이며, 유지 시간이 10 내지 11min, 17 내지 19min, 21 내지 24min인 크로마토그래피 피크를 각각 수집한 후 감압하에 용매를 회수하고, 17 내지 19min은 화합물6:에피보겔로사이드고, 21 내지 24min은 화합물7：보겔로사이드며, 10-11min의 크로마토그래피 피크를 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제하고, 이동상은 부피비가 15:85인 아세토니트릴-물이고, 유속은 12mL/min이고, 검출 파장은 210nm이며, 크로마토그래피 컬럼은 YMC-Pack R&D ODS-A, 250×20mm, S-10μm인 조건하에 유지 시간이 14 내지 16min인 크로마토그래피 피크를 수집하여 감압하에 용매를 회수하여 화합물5:리퀴리틴 아피오사이드를 얻는다.
(7) 단계(3)에서 얻은 혼합 시료 분획물 A-3을 취하여 메탄올에 용해시키고, 용해액을 0.45μm의 미세다공성 여과막으로 여과하고, ODS-AQ-HG가 충전된 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 예비 분리를 실시하며, 여기에서 이동상은 부피비가 60:40인 메탄올-물이고, 유속은 12mL/min이고, 검출 파장은 210nm이고, 유지 시간이 14 내지 15min, 19 내지 21min인 크로마토그래피 피크를 각각 수집하고, 감압하에 용매를 회수 하며, 19 내지 21min의 크로마토그래피 피크의 수집액은 부피비가 2:1인 디클로로 메탄-메탄올 용액에서 백색 침전물이 침전 되어 화합물8을 얻고, 14 내지 15min의 크로마토그래피 피크를 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제하고, 이동상은 부피비가 30:70인 아세토니트릴-물이고, 유속은 12mL/min이고, 검출 파장은 210nm이며, 크로마토그래피 컬럼은 YMC-Pack R&D ODS-A, 250×20mm, S-10μm인 조건하에 유지 시간이 18 내지 20min인 크로마토그래피 피크를 수집하여, 감압하에 용매를 회수하여 화합물1：10-O-(p-하이드록시 신나모일)-아독스오시딕 산(10-O-(p-hydroxycinnamoyl)-adoxosidic acid)를 얻는다.
3, 구조 동정
3.1 새로운 화합물구조 동정
화합물1:담황색 분말, UV λmax(MeOH)：228, 312nm.적외선 분광 측정에서 수산기(3330cm-1), α,β-불포화 카르보닐기(1680, 1630cm-1) 및 벤젠 고리(1603, 1514cm-1)가 있음을 나타내었다. HR-ESI-MS m/z：521.1699[M-H]-(계산값：521.1659), NMR 데이터와 근거하여 해당 화합물의 분자식은 C25H30O12로 결정되었다. 불포화도는 11이다.
1H-NMR(DMSO-d6, 600MHz)스펙트럼(표1)은 해당 화합물이 한 쌍의 트랜스 이중 결합 δ7.56(1H, d, J=16.2Hz), 6.39(1H, d, J=16.2Hz) 및 AB시스템의 방향족 탄화수소 δ7.55(2H, d, J=8.4Hz), 6.79(2H, d, J=8.4Hz)를 함유하고 있음을 나타내며, 수소 스펙트럼의 화학적 이동은 4.52(1H, d, J=7.8Hz)이고, 글루코스의 말단기 수소로 추정된다.
13C-NMR(DMSO-d6, 150MHz)스펙트럼(표1)은 해당 화합물이 2개의 공액 카르보닐 탄소(δC：168.4, 167.2) 및 2개의 다른 단편을 함유하고 있음을 나타내며, δC：116.2(2C), 130.8(2C), 160.2은 p-히드록시 페닐 단편이고, δC：99.3, 77.6, 77.1, 73.6, 70.4, 61.6은 글루코실기 단편임으로 추정된다.
HMBC를 통해 이중결합δH7.56,6.39은 페닐 탄소δC125.5와 관련이 있고, 이중결합δH6.39와 -CH2-δH4.12은 모두 카르보닐기δC167.2와 관련이 있고, 상기 단편은 다른 C,H 화학적 이동과 관련이 없으므로, 해당 단편은 독립적인 단편 p-히드록시 신나모일로 추정되고, 나머지 부분에서 글루코실기 단편을 제외한 부분은 부모핵으로 추정된다. 계산 결과, 부모핵의 불포화도는 4(카르보닐기 1개 및 이중결합을 함유)이며, 해당 부모핵은 이중 고리 구조로 추정된다. HSQC 및 HMBC에 의해 할당하고 연결하면 해당 화합물은 이리도이드 화합물로 추정된다. 나아가서 참고 문헌 검색을 통해 해당 화합물의 부모핵은 아독스오시딕 산로 결정되었다.
나머지 단편은 파라히드록시 계피산이며, 부모핵 아독스오시딕 산(adoxosidic acid)의 10위에 에스테르를 형성하는 것을 알수 있다. SciFinder 및 Reaxys 데이터베이스 검색을 통해 해당 화합물이 새로운 화합물(본 실험에서 해당 화합물의 구성은 아직 확인되지 않았지만 후속 연구에서 확인 할 것)이며, 10-O-(p-하이드록시 신나모일)-아독스오시딕 산(10-O-(p-hydroxycinnamoyl)-adoxosidic acid)로 결정되었다.
표1 화합물1의 NMR데이터
Figure 112020051264486-pct00002
a. 화학적 이동은 호상 교환할 필요가 있을 수 있다
Figure 112020051264486-pct00003
Figure 112020051264486-pct00004
3.2 기존 화합물 구조 동정
화합물2:황색 분말, ESI-MS m/z：431[M-H]-, NMR데이터에 근거하여 해당 화합물의 분자식은 C21H20O10으로 결정되었다. 1H-NMR(DMSO-d6, 600MHz)δH：12.88(1H, s, OH), 7.89(1H, dd, J=1.2, 8.4Hz, H-5), 7.86(1H, t, J=7.8Hz, H-6), 7.72(1H, dd, J=1.2, 8.4Hz, H-7), 7.66(1H, brs, H-4), 7.28(1H, brs, H-2), 5.17(1H, d, J=7.8Hz, anomeric-H), 4.62(2H, s, CH2OH), 3.72내지3.23(Glc-H). 13C-NMR(DMSO-d6, 150MHz)δH：188.8(C-9), 182.6(C-10), 162.2(C-1), 158.7(C-8), 152.7(C-3), 136.4(C-6), 135.3(C-10a), 132.7(C-4a), 122.9(C-7), 121.2(C-2), 121.0(C-5), 116.4(C-8a, C-9a), 100.9(C-1'), 77.7(C-5'), 77.0(C-3'), 73.7(C-2'), 70.0(C-4'), 62.5(CH2OH), 61.0(C-6'). 상기 수소 스펙트럼의 특성 및 탄소 스펙트럼 데이터는 기본적으로 참고 문헌에 보고된 것과 일치하며, 해당 화합물은 알로에-에모딘-8-O-β-D-글루코피라노사이드로 동정되었다.
화합물3:황색 분말, ESI-MSm/z：447[M-H]-, NMR데이터에 근거하여 해당 화합물의 분자식은 C21H20O11로 결정되었다. 1H-NMR(DMSO-d6, 600MHz)δH：12.66(1H, s, 5-OH), 7.31(1H, d, J=2.4Hz, H-2'), 7.26(1H, d, J=2.4, 8.4Hz, H-6'), 6.87(1H, d, J=8.4Hz, H-5'), 6.39(1H, d, J=2.4Hz, H-8), 6.21(1H, d, J=2.4Hz, H-6), 5.26(1H, d, J=1.8Hz, anomeric-H), 0.82(3H, d, J=6.0Hz, CH3). 13C-NMR(DMSO-d6, 150MHz)δC：178.2(C-4), 164.6(C-7), 161.7(C-5), 157.7(C-2), 156.9(C-9), 148.9(C-4'), 145.6(C-3'), 134.7(C-3), 121.5(C-6'), 121.2(C-1'), 116.1(C-5'), 115.9(C-2'), 104.5(C-10), 102.3(C-1''), 99.1(C-6), 94.1(C-8), 71.6(C-4''), 71.0(C-3''), 70.8(C-2''), 70.5(C-5''), 17.9(C-6''). 상기 수소 스펙트럼의 특성 및 탄소 스펙트럼 데이터는 기본적으로 참고 문헌에 보고된 것과 일치하며, 해당 화합물은 퀘르세틴으로 동정되었다.
화합물4:황색 분말, ESI-MSm/z：519[M-H]-, NMR데이터에 근거하여 해당 화합물의 분자식은 C26H32O11로 결정되었다. 1H-NMR(DMSO-d6, 600MHz)δH：6.99(1H, d, J=8.4Hz, H-5), 6.78(1H, d, J=1.8Hz, H-2'), 6.67(2H, m, H-5, H-6'), 6.63(1H, s, H-2), 6.50(1H, dd, J=1.8, 8.4Hz, H-6), 4.84(1H, d, J=7.8Hz, H-1''), 4.09(1H, t, J=7.8Hz, H-9a), 3.86(1H, t, J=8.4Hz, H-9b), 3.72(6H, d, J=2.4Hz, 2ХOCH3). 13C-NMR(DMSO-d6, 150MHz)δC：178.9(C-9'), 149.1(C-3'), 147.9(C-3), 145.7(C-4'), 145.4(C-4), 132.2(C-1'), 130.0(C-1), 121.8(C-6'), 121.2(C-6), 115.9(C-5'), 115.6(C-5), 114.3(C-2'), 113.1(C-2), 100.6(C-1''), 77.4(C-5''), 77.3(C-3''), 73.7(C-2''), 71.1(C-9), 70.1(C-4''), 61.1(C-6''), 56.1(OCH3), 56.0(OCH3), 46.0(C-8'), 41.3(C-8), 37.3(C-7), 33.9(C-7'). 상기 탄소 스펙트럼 데이터는 기본적으로 참고 문헌에 보고된 것과 일치하며, 해당 화합물은 마타이레시놀-4'-O-β-D-글루코시드(matairesinol-4'-O-glucoside)로 동정되었다.
화합물5:백색 분말 , ESI-MS m/z：549[M-H]-, NMR데이터에 근거하여 해당 화합물의 분자식은 C26H30O13로 결정되었다. 1H-NMR(CD3OD, 600MHz)δH：7.70(1H, d, J=9.0Hz, H-5), 7.40(2H, d, J=8.4Hz, H-2´, 6´), 7.09(2H, d, J=9.0Hz, H-3´, 5´), 6.48(1H, dd, J=2.4, 9.0Hz, H-6), 6.34(1H, d, J=2.4Hz, H-8), 5.46(1H, d, J=1.2Hz, H-1´´´), 5.39(1H, dd, J=2.4, 13.2Hz, H-2), 4.98(1H, d, J=7.2Hz, H-1˝), 4.04(1H, d, J=9.6Hz, H-5´´´a), 3.89(1H, d, J=1.2Hz, H-2´´´), 3.88(1H, dd, J=1.2, 12.0Hz, H-6˝a), 3.79(1H, d, J=9.6Hz, H-5´´´b), 2.99(1H, m, H-3a), 2.74(1H, dd, J=2.4, 16.8Hz, H-3b). 13C-NMR(CD3OD, 150MHz)δC：193.2(C-4), 166.7(C-7), 165.3(C-8a), 159.0(C-4´), 134.3(C-1´), 129.9(C-5), 128.8(C-2´, 6´), 117.6(C-3´, 5´), 114.9(C-4a), 111.8(C-6), 110.7(C-1´´´), 103.8(C-8), 100.7(C-1˝), 80.7(C-2), 80.6(C-3´´´), 78.8(C-5˝), 78.6(C-2´´´), 78.0(C-2˝), 77.9(C-3˝), 75.4(C-4´´´), 71.4(C-4˝), 66.0(C-5´´´), 62.4(C-6˝), 44.9(C-3). 상기 수소 스펙트럼의 특성 및 탄소 스펙트럼 데이터는 기본적으로 참고 문헌에 보고된 것과 일치하며, 해당 화합물이 리퀴리틴 아피오사이드임을 동정하였다.
화합물6:백색 분말, ESI-MS m/z：387[M-H]-, NMR데이터에 근거하여 해당 화합물의 분자식은 C17H24O10로 결정되었다. 1H-NMR(CD3OD, 600MHz)δH：7.60(1H, d, J=2.4Hz, H-3), 5.55(1H, d, J=1.8Hz, H-1), 5.48(1H, m, H-8), 5.31(1H, s, H-7), 5.29(1H, m, H-10a), 5.25(1H, m, H-10b), 4.67(1H, d, J=7.8Hz, H-1'), 3.50(1H, s, 7-OCH3), 3.18(1H, m, H-5), 2.63(1H, m, H-9), 1.85(1H, dd, J=6.0, 13.2Hz, H-6a), 1.69(1H, td, J=3.0, 13.8Hz, H-6b). 13C-NMR(CD3OD, 150MHz)δC：167.4(C-11), 154.4(C-4), 133.3(C-8), 121.0(C-10), 105.3(C-4), 103.3(C-7), 100.3(C-1'), 98.5(C-1), 78.3(C-5'), 78.0(C-3'), 74.6(C-2'), 71.4(C-4'), 62.6(C-6'), 57.0(7-OCH3), 43.5(C-9), 30.2(C-6), 22.8(C-5). 상기 수소 스펙트럼의 특성 및 탄소 스펙트럼 데이터는 기본적으로 참고 문헌에 보고된 것과 일치하며, 해당 화합물은 에피보겔로사이드(epi-vogeloside)로 결정되었다.
화합물7:백색 분말, ESI-MS m/z：387[M-H]-, NMR데이터에 근거하여 해당 화합물의 분자식은 C17H24O10로 결정되었다. 1H-NMR(CD3OD, 600MHz)δH：7.58(1H, d, J=2.4Hz, H-3), 5.55(1H, d, J=1.2Hz, H-1), 5.47(1H, m, H-8), 5.31(1H, s, H-7), 5.29(1H, m, H-10a), 5.26(1H, m, H-10b), 4.66(1H, d, J=7.8Hz, H-1'), 3.54(1H, s, 7-OCH3), 3.16(1H, m, H-5), 2.67(1H, m, H-9), 1.97(1H, m, H-6a), 1.44(1H, m, H-6b). 13C-NMR(CD3OD, 150MHz)δC：167.6(C-11), 154.1(C-4), 133.0(C-8), 121.1(C-10), 105.4(C-4), 105.1(C-7), 99.7(C-1'), 97.9(C-1), 78.4(C-5'), 77.8(C-3'), 74.7(C-2'), 71.5(C-4'), 62.6(C-6'), 57.1(7-OCH3), 43.7(C-9), 31.7(C-6), 25.3(C-5). 상기 수소 스펙트럼의 특성은 참고 문헌의 보도와 기본상 일치하며, 탄소 신호를 할당함으로써 해당 화합물은 보겔로사이드(vogeloside)로 동정되었다.
화합물8:백색 분말, ESI-MS m/z：209[M+H]+, NMR데이터에 근거하여 해당 화합물의 분자식은 C11H12O4로 결정되었다. 1H-NMR(DMSO-d6, 600MHz)δH：7.46(1H, d, J=15.9Hz, H-7), 7.04(1H, brs, H-2), 6.99(1H, d, J=8.1Hz, H-6), 6.75(1H, d, J=8.1Hz, H-5), 6.24(1H, d, J=15.9Hz, H-8), 4.15(2H, q, J=7.1Hz, H-10), 1.24(3H, t, J=7.1Hz, H-11). 13C-NMR(DMSO-d6, 150MHz)δC：166.5(C-9), 148.6(C-4), 145.0(C-7), 145.6(C-3), 121.3(C-6), 125.3(C-1), 115.7(C-5), 114.7(C-2), 113.9(C-8), 59.6(C-10), 14.3(C-11).상기 수소 스펙트럼의 특성 및 탄소 스펙트럼 데이터는 기본적으로 참고 문헌에 보고된 것과 일치하며, 해당 화합물은 카페인산 에틸에스테르로 동정되었다.
실시예2
중량비 기준으로 연교 30kg, 금은화 20kg, 판람근 30kg, 대황 6kg, 광곽향 10kg, 관중 20kg, 홍경천 6kg, 박하뇌 0.5kg, 마황 10kg, 행인 6kg, 어성초 30kg, 감초 6kg 및 석고 30kg을 계량하여 다음의 프로세스로 추출한다.
(1) 생약들을 중량비 기준으로 계량하고, 깨끗이 씻어서 선별하여 적절하게 분쇄한다.
(2) 광곽향을 잘게 분쇄한 후, 10배 양의 물을 첨가하여 휘발성 오일을 추출하며, 휘발성 오일의 추출 시간은 8시간이며, 휘발성 오일을 수집하여 사용을 위해 보존하고, 추출액을 여과한 후, 찌꺼기를 버리고, 여과액은 사용을 위해 보존한다.
(3) 연교,마황,어성초 및 대황은 12배 양의 70% 에탄올로 매번 2.5시간씩 3번 추출하고, 추출액을 혼합 및 여과하여 에탄올을 회수하고, 여과액은 사용을 위해 보존한다.
(4) 금은화,석고,판람근,관중,감초 및 홍경천에 12배 양의 물을 첨가하여 비등할 때까지 끓이고, 행인을 첨가하여 매번 한시간씩 2번 끓인 후, 추출액을 혼합 및 여과하여 얻은 여과액을 상기 단계(2)에서 광곽향을 추출한 후 얻은 여과액과 혼합하고, 60℃에서 측정한 상대 밀도가 1.10인 투명한 추출물로 농축한 후, 이어서 에탄올을 첨가하여 알코올 농도를 70%로 조정한 후 냉각 보관 및 여과하여 알코올 냄새가 나지 않을 때까지 에탄올을 회수하여 얻은 투명한 추출물을사용을 위해 보존한다.
(5) 단계(4)에서 얻은 투명한 추출물과 단계(3)에서 얻은 알코올 추출물을 혼합하여, 60℃에서 측정한 상대 밀도가 1.15인 투명한 추출물로 농축하고, 건조시켜 총 추출물을 얻어 사용을 위해 보존한다.
1, 기구 및 재료는 실시예1과 동일하다.
2, 추출 및 분리：
본 발명의 중약 조성물의 전체 추출물을 5kg 취하여, d-101거대다공성 수지로 흡착한 후, 물, 10%의 에탄올, 30%의 에탄올 및 50%의 에탄올을 사용하여 용출한 다음 , 농축하여 각 부위 추출물을 얻는 단계 이외의 단계는 실시예1과 동일하다.
3, 동정결과:
실시예1과 동일하며 , 분리하여 얻은 8가지 화합물도 실시예1에서 얻은 화합물과 완전히 동일하다.
실시예3
연교 27.8kg, 금은화 29.4kg, 판람근 28.5kg, 대황 5.5kg, 광곽향 9.5kg, 관중 29kg, 홍경천 8.7kg, 박하뇌 0.85kg, 마황 8.8kg, 행인 8kg, 어성초 28.4kg, 감초 9.5kg 및 석고 27.7kg으로 생약을 배합하여 다음의 프로세스로 추출한다.
(1) 생약들을 중량비 기준으로 계량하고, 깨끗이 씻어서 선별하여 적절하게 분쇄한다.
(2) 광곽향을 잘게 분쇄한 후, 10배 양의 물을 첨가하여 휘발성 오일을 추출하며, 휘발성 오일의 추출 시간은 8시간이며, 휘발성 오일을 수집하여 사용을 위해 보존하고, 추출액을 여과한 후, 찌꺼기를 버리고, 여과액은 사용을 위해 보존한다.
(3) 연교,마황,어성초 및 대황은 12배 양의 70% 에탄올로 매번 2.5시간씩 3번 추출하고, 추출액을 혼합 및 여과하여 에탄올을 회수하고, 여과액은 사용을 위해 보존한다.
(4) 금은화, 석고, 판람근, 관중, 감초 및 홍경천에 12배 양의 물을 첨가하여 비등할 때까지 끓이고, 행인을 첨가하여 매번 한시간씩 2번 끓인 후, 추출액을 혼합 및 여과하여 얻은 여과액을 상기 단계(2)에서 광곽향을 추출한 후 얻은 여과액과 혼합하고, 60℃에서 측정한 상대 밀도가 1.13인 투명한 추출물로 농축한 후, 이어서 에탄올을 첨가하여 알코올 농도를 70%로 조정한 후 냉각 보관 및 여과하여 알코올 냄새가 나지 않을 때까지 에탄올을 회수하여 얻은 투명한 추출물을 사용을 위해 보존한다.
(5) 단계(4)에서 얻은 투명한 추출물과 단계(3)에서 얻은 알코올 추출물을 혼합하여, 60℃에서 측정한 상대 밀도가 1.18인 투명한 추출물로 농훅한 후, 건조시켜 총 추출물을 얻어 사용을 위해 보존한다.
1, 기구 및 재료는 실시예1과 동일하다.
2, 추출 및 분리：
본 발명의 중약 조성물의 전체 추출물을 5kg 취하여, HPD-100 거대다공성 수지로 흡착한 후, 물, 10%의 에탄올, 30%의 에탄올 및 50%의 에탄올을 사용하여 용출한 다음, 농축하여 각 부위 추출물을 얻는 단계 이외의 단계는 실시예1과 동일하다.
3, 결과동정:
실시예1과 동일하며, 분리하여 얻은 8가지 화합물은 실시예1에서 얻은 화합물과 완전히 동일하다.
상기 내용은 본 발명의 바람직한 실시예에 불과할 뿐, 본 발명은 상술한 실시예에 한정되지 않는다. 본 발명의 사상 원칙에서 벗어 나지 않는 범위내에서 이루어진 모든 수정, 동등한 치환 및 개선등은 본 발명의 청구범위내에 포함되어야 함은 자명하다.

Claims (6)

  1. 연교(Fructus Forsythiae) 200-300 중량부, 마황 60-100 중량부, 대황 40-60 중량부, 어성초 200-300 중량부, 금은화 200-300 중량부, 판람근 200-300 중량부, 광곽향 60-100 중량부, 관중(rhizoma dryopteris crassirhizomae) 200-300 중량부, 홍경천 60-100 중량부, 박하뇌(menthol) 5-9 중량부, 행인(Semen Armeniacae Amarum) 60-100 중량부, 감초 60-100 중량부 및 석고 200-300 중량부의 생약들로 제조된 중약 조성물에서 8가지 성분을 분리하는 방법에 있어서,
    (1) 상기 중약 조성물의 전체 추출물을 AB-8 거대다공성 수지로 흡착한 후, 물, 10%의 에탄올, 30%의 에탄올 및 50%의 에탄올을 순차적으로 사용하여 용출한 다음, 각 부분의 용출액을 각각 수집하고, 농축하여 각 부위 추출물을 얻는 단계;
    (2) 단계(1)에서 얻은 50%의 에탄올로 용출한 부위 추출물을 취하여 역상 실리카 겔 ODS-AQ-HG에 첨가하고, 혼합 시료를 자연 건조 시킨 후 시료를 로딩하고, 역상 ODS-AQ-HG 개방컬럼을 이용하여 분리하고, 부피비가 20: 80, 40: 60, 60: 40, 80:20인 메탄올-물 및 100%인 메탄올을 사용하여 순차적으로 용출하여, 분획물 A 내지 분획물E를 차례로 얻는 단계;
    (3) 단계(2)에서 얻은 혼합 시료 분획물 A를 취하여, 역상 실리카 겔 ODS-AQ-HG에 첨가하여 혼합하고, 시료 분획물 A와 역상 실리카겔의 혼합물을 자연 건조시킨 후 시료 분획물 A와 역상 실리카겔의 혼합물을 중압 분취용 액체 크로마토그래피의 로딩 컬럼 내에 추가한 다음, 용리제로서의 메탄올-물의 부피비가 25:75 내지 60:40이고, 유속이 25mL/min인 구배 용리를 수행하여 500mL의 동일한 부피의 분획물을 삼각 플라스크에 수득한 후, 감압 농축하고, 박층 크로마토그래피(TLC) 판으로 분획물을 검증하고 성분이 동일한 분획물을 혼합한 후 7개의 분획물을 얻고, 이어서, 7개의 분획물을 다시 감압 농축하여 분획물 A-1 내지 분획물 A-7을 얻는 단계;
    (4) 단계(3)에서 얻은 혼합 시료 분획물 A-2를 취하여 실리카 겔과 혼합하고, 실리카 겔 컬럼에 로딩하여 부피비가 8:1인 디클로로 메탄-메탄올로 등용매(Isocratic) 용리하고, 50mL의 동일한 부피의 분획물을 수득하고, 수득한 분획물을 농축시키고, 그 다음, 박층 크로마토그래피(TLC) 판을 이용해 분획물을 검증하고, 성분이 동일한 분획물을 혼합하여 4개의 분획물로서 분획물 A-2-1 내지 분획물 A-2-4를 얻는 단계;
    (5) 단계(4)에서 얻은 혼합 시료 분획물 A-2-2를 취해 메탄올에 용해 시키고, ODS-AQ-HG가 충전된 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 예비 분리를 실시하며, 여기에서 이동상은 부피비가 50:50인 메탄올-물이고, 유속은 12mL/min이고, 검출 파장은 210nm이며, 유지 시간이 6 내지 8min, 9 내지 10min, 12 내지 13min인 크로마토그래피 피크를 각각 수집하고 감압하에 용매를 회수 하는 단계로, 이 단계에서
    6 내지 8min의 크로마토그래피 피크를 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제하고, 이동상은 부피비가 25:75인 아세토니트릴-물이고, 유속은 12mL/min이고, 검출 파장은 210nm이며, 크로마토그래피 컬럼은 YMC-Pack R&D ODS-A, 250×20mm, S-10μm인 조건하에 유지 시간이 8 내지 9min인 크로마토그래피 피크를 수집하고, 감압하에 용매를 회수하여 화합물2:알로에-에모딘-8-O-β-D-글루코피라노사이드를 얻는 분리,
    9 내지 10min의 크로마토그래피 피크를 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제하고, 이동상은 부피비가 45:55인 메탄올-물이고, 유속은 12mL/min이고, 검출 파장은 210nm이며, 크로마토그래피 컬럼은 YMC-Pack R&D ODS-A, 250×20mm, S-10μm인 조건하에 유지 시간이 21 내지 23min인 크로마토그래피 피크를 수집하고, 감압하에 용매를 회수하여 화합물3:퀘르세틴을 얻는 분리, 및
    12 내지 13min의 크로마토그래피 피크를 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제하고, 이동상은 부피비가 25:75인 아세토니트릴-물이고, 유속은 12mL/min이고, 검출 파장은 210nm이며, 크로마토그래피 컬럼은 YMC-Pack R&D ODS-A, 250×20mm, S-10μm인 조건하에 유지 시간이 9 내지 10min인 크로마토그래피 피크를 수집하고, 감압하에 용매를 회수하여 화합물4:마타이레시놀-4’-O-β-D-글루코시드를 얻는 분리를 각각 실시하며,
    (6) 단계(4)에서 얻은 혼합 시료 분획물 A-2-3을 취하여 메탄올에 용해시키고, ODS-AQ-HG가 충전된 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 예비 분리를 실시하며, 여기에서 이동상은 부피비가 30:70인 메탄올-물이고, 유속은 12mL/min이고, 검출 파장은 210nm이며, 유지 시간이 10 내지 11min, 17 내지 19min, 21 내지 24min인 크로마토그래피 피크를 각각 수집한 후 감압하에 용매를 회수하고, 17 내지 19min은 화합물6:에피보겔로사이드(Epivogeloside)이고, 21 내지 24min은 화합물7：보겔로사이드(vogeloside)이며, 10-11min의 크로마토그래피 피크를 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제하고, 이동상은 부피비가 15:85인 아세토니트릴-물이고, 유속은 12mL/min이고, 검출 파장은 210nm이며, 크로마토그래피 컬럼은 YMC-Pack R&D ODS-A, 250×20mm, S-10μm인 조건하에 유지 시간이 14 내지 16min인 크로마토그래피 피크를 수집하여 감압하에 용매를 회수하여 화합물5:리퀴리틴 아피오사이드를 얻는 단계; 및
    (7) 단계(3)에서 얻은 혼합 시료 분획물 A-3을 취하여 메탄올에 용해시키고, ODS-AQ-HG가 충전된 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 예비 분리를 실시하며, 여기에서 이동상은 부피비가 60:40인 메탄올-물이고, 유속은 12mL/min이고, 검출 파장은 210nm이며, 유지 시간이 14 내지 15min, 19 내지 21min인 크로마토그래피 피크를 각각 수집하고, 감압하에 용매를 회수 하며, 19 내지 21min의 크로마토그래피 피크의 수집액은 부피비가 2:1인 디클로로 메탄-메탄올 용액에서 백색 침전물이 침전되어 카페인산 에틸에스테르인 화합물 8을 얻고, 14 내지 15min의 크로마토그래피 피크를 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제하고, 이동상은 부피비가 30:70인 아세토니트릴-물이고, 유속은 12mL/min이고, 검출 파장은 210nm이며, 크로마토그래피 컬럼은 YMC-Pack R&D ODS-A, 250×20mm, S-10μm인 조건하에 유지 시간이 18 내지 20min인 크로마토그래피 피크를 수집하여, 감압하에 용매를 회수하여 화합물1:10-O-(p-하이드록시 신나모일)-아독스오시딕 산(10-O-(p-hydroxycinnamoyl)-adoxosidic acid)를 얻는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 중약 조성물에서 8가지 성분을 분리하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    (1) 상기 중약 조성물의 전체 추출물 5kg을 AB-8 거대다공성 수지로 흡착한 후, 순차적으로 물 150L, 10%의 에탄올 87.5L, 30%의 에탄올 225L, 50%의 에탄올 250L를 사용하여 용출한 후 농축하여 각 부위 추출물을 얻는 단계;
    (2) 단계(1)에서 얻은 50%의 에탄올로 용출한 부위 추출물을 200g 취하여 역상 실리카 겔 ODS-AQ-HG S-50μm를 200g 첨가하여 혼합하고, 혼합 시료 ODS를 자연 건조 시킨 후 시료를 로딩하고, 역상 ODS-AQ-HG S-50μm 개방컬럼을 이용하여 분리하며, 시료층과 블랭크층의 높이 비는 1:4이며, 감압 방식으로 순차적으로 부피비가 20:80인 메탄올-물 6L로 용출하고, 40:60인 메탄올-물 7L로 용출하고, 60:40인 메탄올-물 7L로 용출하고, 80:20인 메탄올-물 5L로 용출하고, 100% 메탄올 3L로 용출하여, 분획물 A 내지 분획물E를 차례로 얻는 단계;
    (3) 단계(2)에서 얻은 혼합 시료 분획물 A를 50.0g 취하여, 역상 실리카 겔 ODS-AQ-HG S-50μm을 50g 첨가하여 혼합하고, 혼합 시료 ODS를 자연 건조 시킨 후 혼합 시료 ODS를 로딩 컬럼 내에 추가한 다음 중압 조제 액체를 분리하기 위해 로딩하고, 분취용 컬럼 충전재로 ODS-AQ-HG S-50μm을 사용하며, 중압 조제 액체를 구배에 의해 분리한 후, 메탄올-물의 부피비는 25:75 내지 60:40으로 유속은 25mL/min으로하여, 동일한 부피 500mL로 분획물을 삼각 플라스크에 수득한 후 감압 농축하고, 박층 크로마토그래피 판으로 분획물을 검증 혼합한 후 다시 감압 농축하여 분획물 A-1 내지 분획물 A-7을 얻는 단계;
    (4) 단계(3)에서 얻은 혼합 시료 분획물 A-2를 3.2g 취하여 6.4g의 200 내지 300메쉬의 실리카 겔과 혼합하고, 실리카 겔 컬럼에 로딩하고, 시료층과 블랭크층의 높이 비는 1:50이며, 부피비가 8:1인 디클로로 메탄-메탄올로 등용매 용리하고, 동일한 부피 50mL로 분획물을 수득하며, 용출 부피는 800mL이고, 박층 크로마토그래피 판으로 분획물을 검증 혼합하여 분획물 A-1-1 내지 분획물 A-1-4를 얻는 단계;
    (5) 단계(4)에서 얻은 혼합 시료 분획물 A-1-2를 취해 메탄올에 용해 시키고, 용해액을 0.45μm의 미세다공성 여과막으로 여과하고, 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 예비 분리를 실시하며, 여기에서 이동상은 부피비가 50:50인 메탄올-물이고, 유속은 12mL/min이고, 검출 파장은 210nm이며, 유지 시간이 6 내지 8min, 9 내지 10min, 12 내지 13min인 크로마토그래피 피크를 각각 수집하고 감압하에 용매를 회수 하는 단계로, 이 단계에서
    6 내지 8min의 크로마토그래피 피크를 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제하고, 이동상은 부피비가 25:75인 아세토니트릴-물이고, 유속은 12mL/min이고, 검출 파장은 210nm이며, 크로마토그래피 컬럼은 YMC-Pack R&D ODS-A, 250×20mm, S-10μm인 조건하에 유지 시간이 8 내지 9min인 크로마토그래피 피크를 수집하고, 감압하에 용매를 회수하여 화합물2:알로에-에모딘-8-O-β-D-글루코피라노사이드를 얻는 분리,
    9 내지 10min의 크로마토그래피 피크를 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제하고, 이동상은 부피비가 45:55인 메탄올-물이고, 유속은 12mL/min이고, 검출 파장은 210nm이며, 크로마토그래피 컬럼은 YMC-Pack R&D ODS-A, 250×20mm, S-10μm인 조건하에 유지 시간이 21 내지 23min인 크로마토그래피 피크를 수집하고, 감압하에 용매를 회수하여 화합물3:퀘르세틴을 얻는 분리, 및
    10 내지 12min의 크로마토그래피 피크를 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제하고, 이동상은 부피비가 25:75인 아세토니트릴-물이고, 유속은 12mL/min이고, 검출 파장은 210nm이며, 크로마토그래피 컬럼은 YMC-Pack R&D ODS-A, 250×20mm, S-10μm인 조건하에 유지 시간이 9 내지 10min인 크로마토그래피 피크를 수집하고, 감압하에 용매를 회수하여 화합물4:마타이레시놀-4’-O-β-D-글루코시드를 얻는 분리를 각각 실시하며,
    (6) 단계(4)에서 얻은 혼합 시료 분획물 A-1-3을 취하여 메탄올에 용해시키고, 용해액을 0.45μm의 미세다공성 여과막으로 여과하고, 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 예비 분리를 실시하며, 여기에서 이동상은 부피비가 30:70인 메탄올-물이고, 유속은 12mL/min이고, 검출 파장은 210nm이며, 유지 시간이 10 내지 11min, 17 내지 19min, 21 내지 24min인 크로마토그래피 피크를 각각 수집한 후 감압하에 용매를 회수하고, 17 내지 19min은 화합물6:에피보겔로사이드고, 21 내지 24min은 화합물7：보겔로사이드며, 10-11min의 크로마토그래피 피크를 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제하고, 이동상은 부피비가 15:85인 아세토니트릴-물이고, 유속은 12mL/min이고, 검출 파장은 210nm이며, 크로마토그래피 컬럼은 YMC-Pack R&D ODS-A, 250×20mm, S-10μm인 조건하에 유지 시간이 14 내지 16min인 크로마토그래피 피크를 수집하여 감압하에 용매를 회수하여 화합물5:리퀴리틴 아피오사이드를 얻는 단계; 및,
    (7) 단계(3)에서 얻은 혼합 시료 분획물 A-3을 취하여 메탄올에 용해시키고, 용해액을 0.45μm의 미세다공성 여과막으로 여과하고, 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 예비 분리를 실시하며, 여기에서 이동상은 부피비가 60:40인 메탄올-물이고, 유속은 12mL/min이고, 검출 파장은 210nm이고, 유지 시간이 14 내지 15min, 19 내지 21min인 크로마토그래피 피크를 각각 수집하고, 감압하에 용매를 회수 하며, 19 내지 21min의 크로마토그래피 피크의 수집액은 부피비가 2:1인 디클로로 메탄-메탄올 용액에서 백색 침전물이 침전 되어 화합물8을 얻고, 14 내지 15min의 크로마토그래피 피크를 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 추가 정제하고, 이동상은 부피비가 30:70인 아세토니트릴-물이고, 유속은 12mL/min이고, 검출 파장은 210nm이며, 크로마토그래피 컬럼은 YMC-Pack R&D ODS-A, 250×20mm, S-10μm인 조건하에 유지 시간이 18 내지 20min인 크로마토그래피 피크를 수집하여, 감압하에 용매를 회수하여 화합물1：10-O-(p-하이드록시 신나모일)-아독스오시딕 산(10-O-(p-hydroxycinnamoyl)-adoxosidic acid)를 얻는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 8가지 성분을 분리하는 방법.
  3. 삭제
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 중약 조성물은 연교 300중량부, 금은화 200중량부, 판람근 300중량부, 대황 60중량부, 광곽향 100중량부, 관중 200중량부, 홍경천 60중량부, 박하뇌 5중량부, 마황 100중량부, 행인 60중량부, 어성초 300중량부, 감초 60중량부 및 석고 300중량부의 생약들로 제조되는 것을 특징으로 하는 8가지 성분을 분리하는 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 중약 조성물은 연교 278중량부, 금은화 294중량부, 판람근 285중량부, 대황 55중량부, 광곽향 95중량부, 관중 290중량부, 홍경천 87중량부, 박하뇌 8.5중량부, 마황 88중량부, 행인 80중량부, 어성초 284중량부, 감초 95중량부 및 석고 277중량부의 생약들로 제조되는 것을 특징으로 하는 8가지 성분을 분리하는 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 중약 조성물의 전체 추출물은
    (1) 생약들을 중량비 기준으로 계량하고, 깨끗이 씻어서 선별하여 적절하게 분쇄하는 단계,
    (2) 광곽향을 잘게 분쇄한 후, 10배 양의 물을 첨가하여 휘발성 오일을 추출하며, 휘발성 오일의 추출 시간은 8시간이며, 휘발성 오일을 수집하여 사용을 위해 보존하고, 추출액을 여과한 후, 찌꺼기를 버리고, 여과액은 사용을 위해 보존해 두는 단계,
    (3) 연교, 마황, 어성초 및 대황은 12배 양의 70% 에탄올로 매번 2.5시간씩 3번 추출하고, 추출액을 혼합 및 여과하여 에탄올을 회수하고, 여과액은 사용을 위해 보존해 두는 단계,
    (4) 금은화, 석고, 판람근, 관중, 감초 및 홍경천에 12배 양의 물을 첨가하여 비등할 때까지 끓이고, 행인을 첨가하여 매번 한시간씩 2번 끓인 후, 추출액을 혼합 및 여과하여 얻은 여과액을 상기 단계(2)에서 광곽향을 추출한 후 얻은 여과액과 혼합하고, 60℃에서 측정한 상대 밀도가 1.10 내지 1.15인 투명한 추출물로 농축한 후, 이어서 에탄올을 첨가하여 알코올 농도를 70%로 조정한 후 냉각 보관 및 여과하여 알코올 냄새가 나지 않을 때까지 에탄올을 회수하여 얻은 투명한 추출물을 사용을 위해 보존해 두는 단계; 및
    (5) 단계(4)에서 얻은 투명한 추출물과 단계(3)에서 얻은 알코올 추출물을 혼합하여, 60℃에서 측정한 상대 밀도가1.15-1.20인 투명한 추출물로 농축한 후, 이를 건조하여 얻은 총 추출물을 사용을 위해 보존해 두는 단계로 제조되는 것을 특징으로 하는 8가지 성분을 분리하는 방법.
KR1020207014571A 2017-11-10 2018-10-25 중약 조성물에서 8가지 성분을 분리하는 방법 KR102532345B1 (ko)

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