CN114264737B

CN114264737B - 一种苦参子中的水溶性化合物的分离方法

Info

Publication number: CN114264737B
Application number: CN202111489717.3A
Authority: CN
Inventors: 高慧敏; 王智民; 陈两绵; 田盼
Original assignee: Institute of Materia Medica of CAMS
Current assignee: Institute of Materia Medica of CAMS
Priority date: 2021-12-08
Filing date: 2021-12-08
Publication date: 2023-04-28
Anticipated expiration: 2041-12-08
Also published as: CN114264737A

Abstract

本发明公开了一种苦参子中的水溶性化合物的分离方法，该方法包括脱脂步骤、溶剂提取步骤、大孔树脂柱层析步骤、中压纯化制备步骤和高效液相色谱制备步骤，其中该水溶性化合物为γ‑L‑谷氨酰‑L‑酪氨酸和番石榴酸。该分离方法工艺简单、节能环保、重现性好、所获得的水溶性化合物纯度高，具有工业大生产的可行性。

Description

一种苦参子中的水溶性化合物的分离方法

技术领域

本发明涉及中药化学领域，具体涉及一种苦参子中的水溶性化合物的分离方法。

背景技术

苦参是豆科(Leguminosae)槐属(Sophora)植物苦参(SophoraeflavescentisAit)的干燥根，《神农本草经》列为中品。苦参喜阳，在我国分布较广，在内蒙古、河南、河北、安徽、山东、山西、贵州以及四川等地均有种植，具有很长的药用历史，“苦以味名，参以功名”是《本草纲目》对苦参的评价。苦参根中主要含有黄酮类及生物碱类成分，其它成分占比相对较少，其性寒，味苦，具有清热解毒，抗炎镇痛，抗肿瘤等多种药理活性。

苦参在各个领域的广泛应用，使得苦参需求日益增加，只将苦参根作为药用部位已难以满足人们的需求，而大量非药用部位被丢弃，亟待开发和利用，例如生物量巨大的种子，亩产量可达上百公斤，目前亟待开展对于苦参子的系列核心关键技术的研究。

近年来苦参子的研究主要集中在硬实破除、萌发和育苗方面，其化学成分及其分离方法的报道相对较少。

本发明通过柱层析的方式对苦参子中2个水溶性化合物进行了对照品的富集和制备，通过HPLC进行纯度检测，并采用质谱及核磁数据鉴定了结构，分别为γ-L-谷氨酰-L-酪氨酸和番石榴酸。其中γ-L-谷氨酰-L-酪氨酸是首次从自然界分离得到的，是苦参子特有的化学成分，为苦参子的进一步开发和利用提供了坚实的基础，目前未见本发明所涉及的从苦参的种子(即苦参子)中分离和鉴定γ-L-谷氨酰-L-酪氨酸和番石榴酸的相关报道。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种工艺简单、重现性好、所分离得到的化合物纯度高、具备工业化应用前景的化合物制备分离方法，以解决现有技术中缺少相关制备分离方法的问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种苦参子中的水溶性化合物的分离方法，该方法包括脱脂步骤、溶剂提取步骤、大孔树脂柱层析步骤、中压纯化制备步骤和高效液相色谱制备步骤，其中该水溶性化合物为γ-L-谷氨酰-L-酪氨酸和番石榴酸。

进一步地，该脱脂步骤包括以下步骤：

(1)称取适量的苦参子粉末，加入第一溶剂后浸泡6至10小时，超声30至60分钟，过滤后的滤渣为第一脱脂粉；以及

(2)在该第一脱脂粉中加入第一溶剂后浸泡6至10小时，超声30至60分钟，过滤后的滤渣为第二脱脂粉。

进一步地，该苦参子粉末与该第一溶剂的重量体积之比为1:3至1:10。

进一步地，该第一脱脂粉与该第一溶剂的重量体积之比为1:3至1:10。

进一步地，该苦参子粉末与该第一溶剂的重量体积之比为约1:5。

进一步地，该第一脱脂粉与该第一溶剂的重量体积之比为约1:5。

进一步地，该浸泡的时间为约8小时。

进一步地，该超声的时间为约45分钟。

进一步地，该超声的功率为200W至300W。

进一步地，该超声的频率为30KHz至60KHz。

进一步地，该超声的功率为约250W。

进一步地，该超声的频率为约40KHz。

进一步地，该第一溶剂为有机溶剂。

进一步地，该有机溶剂为有机脱脂溶剂。

进一步地，该有机脱脂溶剂选自以下中的一种或多种：丙酮、三氯乙烷、正庚烷、石油醚和正己烷。

进一步地，该溶剂提取步骤包括以下步骤：

(1)称取适量的该第二脱脂粉，加入第二溶剂后超声30至60分钟，过滤，得到第一滤液；

(2)在该第二脱脂粉中加入第三溶剂后超声30至60分钟，过滤，得到第二滤液；以及

(3)合并该第一滤液和该第二滤液，离心后取上清液，得到苦参子提取液。

进一步地，该第二脱脂粉与该第二溶剂的重量体积之比为1:8至1:15。

进一步地，该第二脱脂粉与该第三溶剂的重量体积之比为1:5至1:10。

进一步地，该第二脱脂粉与该第二溶剂的重量体积之比为约1:10。

进一步地，该第二脱脂粉与该第三溶剂的重量体积之比为约1:8。

进一步地，该第二溶剂和该第三溶剂为水。

进一步地，该第二溶剂和该第三溶剂为去离子水。

进一步地，该超声的时间为约45分钟。

进一步地，该离心的条件为在2000r/min至5000r/min条件下离心5min至15min。

进一步地，该离心的条件为在约3000r/min条件下离心约10min。

进一步地，该大孔树脂柱层析步骤包括以下步骤：

(1)将该苦参子提取液添加至大孔树脂柱中，其中上样过程中未吸附的部分为未吸附流分；

(2)添加水进行洗脱，得到水洗脱流分；以及

(3)将该未吸附流分和该水洗脱流分合并后，浓缩干燥，得到第一干燥物。

进一步地，该水为去离子水。

进一步地，该水的用量为大孔树脂柱体积的5倍。

进一步地，该大孔树脂为HPD400大孔吸附树脂、HPD600大孔吸附树脂、D201大孔吸附树脂或D301大孔吸附树脂。

进一步地，该流分的流速为15mL/min至30mL/min。

进一步地，该流分的流速为约20mL/min。

进一步地，该中压纯化制备步骤包括以下步骤：

(1)称取适量的该第一干燥物，溶于水中，制成浓度为300mg/mL至500mg/mL的第一样品溶液；以及

(2)该第一样品溶液采用中压纯化制备色谱仪，通过ODS中压制备柱层析，合并含有该水溶性化合物的流分，干燥，得到第二干燥物。

进一步地，该第一样品溶液的浓度为约400mg/mL。

进一步地，该ODS中压制备柱的规格为50mm*160mm，50μm。

进一步地，该ODS中压制备柱层析的流动相为甲醇-0.05％甲酸水溶液约15:85。

进一步地，该ODS中压制备柱层析的检测波长为约225nm。

进一步地，该ODS中压制备柱层析的流速为约20mL/min。

进一步地，该ODS中压制备柱层析的进样量为约10mL。

进一步地，该高效液相色谱制备步骤包括以下步骤：

(1)称取适量的该第二干燥物，溶于水中，制成浓度为60mg/mL至100mg/mL的第二样品溶液；以及

(2)该第二样品溶液采用制备型高效液相色谱系统，通过ODS制备色谱柱进行柱层析，分别合并含有该γ-L-谷氨酰-L-酪氨酸的流份和含有该番石榴酸的流分，干燥，得到该γ-L-谷氨酰-L-酪氨酸和该番石榴酸。

进一步地，该第二样品溶液的浓度为约80mg/mL。

进一步地，该ODS制备色谱柱的规格为30mm*250mm，10μm。

进一步地，该ODS制备柱层析的流动相为甲醇-0.1％甲酸水溶液约15:85。

进一步地，该ODS制备柱层析的流速为约30mL/min。

进一步地，该ODS制备柱层析的检测波长为约225nm。

进一步地，该ODS制备柱层析的进样量为约2mL。

进一步地，在一定的色谱检测条件下，该γ-L-谷氨酰-L-酪氨酸和该番石榴酸的纯度均大于98％。

进一步地，该色谱检测条件为色谱柱：C₁₈柱，4.6mm*250mm，5μm，流动相：甲醇-0.1％甲酸水溶液约15:85，流速：约1mL/min，检测波长：约225nm，进样量：约20μL。

根据本发明的另一个方面，提供了一种根据上述方法在制备苦参子中的水溶性化合物、或包含该水溶性化合物的药物组合物、或包含该水溶性化合物的药物制剂的用途。

本发明的有益效果：

本发明前期研究发现苦参子总生物碱的含量与苦参根不相上下，对于其他成分研究较少。本发明通过柱层析对苦参子中2个水溶性化合物进行了对照品的富集和制备，基于波谱数据鉴定结构为γ-L-谷氨酰-L-酪氨酸和番石榴酸，其中γ-L-谷氨酰-L-酪氨酸为首次从自然界中分离得到的。另外，发现大孔树脂和阳离子交换树脂对番石榴酸几乎无吸附作用，可作为一次性分离出碱性成分和酸性成分的方法，且节能环保，具有工业大生产的可行性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图，而并不超出本发明要求保护的范围。

图1是中压纯化制备色谱图。

图2是第二干燥物的HPLC图谱。其中1代表γ-L-谷氨酰-L-酪氨酸，2代表番石榴酸。

图3是高效液相制备色谱图。其中1代表γ-L-谷氨酰-L-酪氨酸，2代表番石榴酸。

图4是化合物1和2的HPLC图谱。其中1代表γ-L-谷氨酰-L-酪氨酸，2代表番石榴酸。

图5是化合物1(γ-L-谷氨酰-L-酪氨酸)的结构式图。

图6是化合物2(番石榴酸)的结构式图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明有预期地涵盖所有的选择余地、变体和同等物，这些可能如权利要求所定义的那样包含在现有发明领域。所属领域的技术人员将识别许多类似或等同于在此所描述的方法和物质，这些可以应用于本发明的实践中去。本发明绝非限于方法和物质的描述。

本文所述的发明可以包括一个或多个数值范围(例如比例、功率、时间等)。将数值范围理解为包括所述范围内的全部值，包括限定所述范围的值，和临近所述范围且产生与限定所述范围边界的值紧邻的值相同或基本上相同结果的值。

在一定程度上，具体实施方式和/或权利要求中使用术语“包含”、“包括(including，includes)”和“具有(having，has，with)”或其变体，这些术语意在包括与术语“包含(comprising)”类似的方式。

术语“约”或“大约”是指在本领域技术人员所测定的特定值的可接收的误差范围内，该误差范围部分取决于如何测量或测定所述值，即，测量系统的限制。例如，根据本领域的实践操作，“约”可以是1或高于1的标准偏差范围内。可选地，“约”可指给定值的5％的范围。除非另有说明，在本发明中描述特定值的情况下，可假定术语“约”是指特定值的可接受的误差范围内。

正如背景技术部分所描述的，现有技术中缺少从苦参的种子(即苦参子)中分离γ-L-谷氨酰-L-酪氨酸和番石榴酸的相关制备分离方法。为了解决上述问题，本发明提供了一种苦参子中的水溶性化合物的分离方法，该方法包括脱脂步骤、溶剂提取步骤、大孔树脂柱层析步骤、中压纯化制备步骤和高效液相色谱制备步骤，其中该水溶性化合物为γ-L-谷氨酰-L-酪氨酸和番石榴酸。

在一种优选的实施方式中，该脱脂步骤包括以下步骤：

在一种优选的实施方式中，该苦参子粉末与该第一溶剂的重量体积之比为1:3至1:10。

在一种优选的实施方式中，该第一脱脂粉与该第一溶剂的重量体积之比为1:3至1:10。

在一种优选的实施方式中，该苦参子粉末与该第一溶剂的重量体积之比为约1:5。

在一种优选的实施方式中，该第一脱脂粉与该第一溶剂的重量体积之比为约1:5。

在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约1:5”包括1:5的±5％，或从1:4.75到1:5.25。

为了获得更高效的浸泡效率，在一种优选的实施方式中，该浸泡的时间为约8小时。

在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约8”包括8的±5％，或从7.6到8.4。

在一种优选的实施方式中，该超声的时间为约45分钟。

在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约45”包括45的±5％，或从42.75到47.25。

在一种优选的实施方式中，该超声的功率为200W至300W。

在一种优选的实施方式中，该超声的频率为30KHz至60KHz。

在一种优选的实施方式中，该超声的功率为约250W。

在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约250”包括250的±5％，或从238到262。

在一种优选的实施方式中，该超声的频率为约40KHz。

在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约40”包括40的±5％，或从38到42。

在一种优选的实施方式中，该第一溶剂为有机溶剂。

在一种优选的实施方式中，该有机溶剂为有机脱脂溶剂。

在一种优选的实施方式中，该有机脱脂溶剂选自以下中的一种或多种：丙酮、三氯乙烷、正庚烷、石油醚和正己烷。上述有机脱脂溶剂均能实现从苦参子中去除油脂的功能。

在一种优选的实施方式中，该溶剂提取步骤包括以下步骤：

在一种优选的实施方式中，该第二脱脂粉与该第二溶剂的重量体积之比为1:8至1:15。

在一种优选的实施方式中，该第二脱脂粉与该第三溶剂的重量体积之比为1:5至1:10。

在一种优选的实施方式中，该第二脱脂粉与该第二溶剂的重量体积之比为约1:10。

在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约1:10”包括1:10的±5％，或从1:9.5到1:10.5。

在一种优选的实施方式中，该第二脱脂粉与该第三溶剂的重量体积之比为约1:8。

在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约1:8”包括1:8的±5％，或从1:7.6到1:8.4。

在一种优选的实施方式中，该第二溶剂和该第三溶剂为水。

在一种优选的实施方式中，该第二溶剂和该第三溶剂为去离子水。

在一种优选的实施方式中，该超声的时间为约45分钟。

在一种优选的实施方式中，该离心的条件为在2000r/min至5000r/min条件下离心5min至15min。

在一种优选的实施方式中，该离心的条件为在约3000r/min条件下离心约10min。

在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约3000”包括3000的±5％，或从2850到3150。

在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约10”包括10的±5％，或从9.5到10.5。

在一种优选的实施方式中，该大孔树脂柱层析步骤包括以下步骤：

(2)添加水进行洗脱，得到水洗脱流分；以及

在本发明获得第一干燥物的过程中，在没有使用有机溶剂进行洗脱的情况下，就能够获得包含γ-L-谷氨酰-L-酪氨酸和番石榴酸的提取物，工艺简便，有利于节省成本以及工业化大生产。

在一种优选的实施方式中，该水为去离子水。

在一种优选的实施方式中，该水的用量为大孔树脂柱体积的约5倍。

在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约5”包括5的±5％，或从4.75到5.25。

在一种优选的实施方式中，该大孔树脂为HPD400大孔吸附树脂、HPD600大孔吸附树脂、D201大孔吸附树脂或D301大孔吸附树脂。

在一种优选的实施方式中，该流分的流速为15mL/min至30mL/min。

在一种优选的实施方式中，该流分的流速为约20mL/min。

在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约20”包括20的±5％，或从19到21。

在一种优选的实施方式中，该中压纯化制备步骤包括以下步骤：

在一种优选的实施方式中，该第一样品溶液的浓度为约400mg/mL。

在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约400”包括400的±5％，或从380到420。

在一种优选的实施方式中，该ODS中压制备柱的规格为50mm*160mm，50μm。

在一种优选的实施方式中，该ODS中压制备柱层析的流动相为甲醇-0.05％甲酸水溶液约15:85。

在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约15:85”包括15:85的±5％，或从14.25:85.75到15.75:84.25。

在一种优选的实施方式中，该ODS中压制备柱层析的检测波长为约225nm。

在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约225”包括225的±5％，或从214到236。

在一种优选的实施方式中，该ODS中压制备柱层析的流速为约20mL/min。

在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约20”包括20的±5％，或从19到20。

在一种优选的实施方式中，该ODS中压制备柱层析的进样量为约10mL。

在一种优选的实施方式中，该高效液相色谱制备步骤包括以下步骤：

在一种优选的实施方式中，该第二样品溶液的浓度为约80mg/mL。

在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约80”包括80的±5％，或从76到84。

在一种优选的实施方式中，该ODS制备色谱柱的规格为30mm*250mm，10μm。

在一种优选的实施方式中，该ODS制备柱层析的流动相为甲醇-0.1％甲酸水溶液约15:85。

在一种优选的实施方式中，该ODS制备柱层析的流速为约30mL/min。

在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约30”包括30的±5％，或从28.5到31.5。

在一种优选的实施方式中，该ODS制备柱层析的检测波长为约225nm。

在一种优选的实施方式中，该ODS制备柱层析的进样量为约2mL。

在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约2”包括2的±5％，或从1.9到2.1。

在一种优选的实施方式中，在一定的色谱检测条件下，该γ-L-谷氨酰-L-酪氨酸和该番石榴酸的纯度均大于98％。

在一种优选的实施方式中，该色谱条件为色谱柱：C₁₈柱，4.6mm*250mm，5μm，流动相：甲醇-0.1％甲酸水溶液约15:85，流速：约1mL/min，检测波长：约225nm，进样量：约20μL。

在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约1”包括1的±5％，或从0.95到1.05。

实施例

1实验材料

LC-20A型高效液相色谱仪(日本岛津公司)；N-1100EYELA旋转蒸发仪(上海爱郎仪器有限公司)；赛多利斯BS-210S万分之一电子天平(Sartorius公司)；赛多利斯BP211D十万分之一天平(Sartorius公司)；粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)；MettlerToledo pH仪(瑞士梅特勒-托利多集团)；KQ3200E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Flash快速纯化制备色谱仪(瑞典Biotage公司)；Varian ProStar制备型高效液相色谱仪(美国Varian公司)；ODS反相硅胶填料(美国Grace公司，粒径50μm)；大孔树脂HPD400(沧州宝恩公司)，BrukerAvance 600MHz核磁共振波谱仪(瑞士Bruker)。

色谱纯甲醇(Fisher公司)，正己烷，甲醇，乙醇，甲酸均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)，纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)。

苦参种子样品于2018年10月采自山西省长治市五谷山。

2方法与结果

2.1提取与分离

2.1.1苦参子脱脂和水提取

方法一

苦参子粗粉1kg，加入5倍量正己烷，浸泡8h，超声处理(功率250W，频率40KHz)45min，过滤，重复两次，合并滤液，除去溶剂至恒重，得到油脂100g，滤渣即脱脂粗粉，晾干，约900g，分别用10倍量和8倍量的去离子水超声(功率250W，频率40KHz)45min，用八层纱布过滤，合并两次滤液，在3000r/min条件下离心10min，取上清液，得到苦参子水提液约14L，作为上样液。

方法二

苦参子粗粉1kg，加入10倍量正己烷，浸泡6h，超声处理(功率250W，频率40KHz)60min，过滤，重复两次，合并滤液，除去溶剂至恒重，得到油脂98g，滤渣即脱脂粗粉，晾干，约900g，分别用8倍量和10倍量的去离子水超声(功率250W，频率40KHz)30min，用八层纱布过滤，合并两次滤液，在5000r/min条件下离心5min，取上清液，得到苦参子水提液约14L，作为上样液。

方法三

苦参子粗粉1kg，加入3倍量石油醚，浸泡8h，超声处理(功率200W，频率40KHz)60min，过滤，重复两次，合并滤液，除去溶剂至恒重，得到油脂97g，滤渣即脱脂粗粉，晾干，约900g，分别用9倍量和9倍量的去离子水超声(功率200W，频率40KHz)45min，用八层纱布过滤，合并两次滤液，在2000r/min条件下离心15min，取上清液，得到苦参子水提液约14L，作为上样液。

方法四

苦参子粗粉1kg，加入10倍量石油醚，浸泡6h，超声处理(功率300W，频率30KHz)50min，过滤，重复两次，合并滤液，除去溶剂至恒重，得到油脂96g，滤渣即脱脂粗粉，晾干，约900g，分别用13倍量和5倍量的去离子水超声(功率300W，频率30KHz)40min，用八层纱布过滤，合并两次滤液，在2000r/min条件下离心10min，取上清液，得到苦参子水提液约14L，作为上样液。

2.1.2大孔吸附树脂粗分

方法一

上述约14L苦参子水提液缓慢加入处理好的HPD400大孔吸附树脂柱中(柱体积约2.7L)，流速约20mL/min，收集上样过程中的未吸附流分；再用5BV(13.5L)去离子水洗脱，收集水洗脱流分；合并未吸附流分和水洗脱流分，浓缩干燥，得第一干燥物50.14g。

方法二

上述约14L苦参子水提液缓慢加入处理好的HPD600大孔吸附树脂柱中(柱体积约2.7L)，流速约15mL/min，收集上样过程中的未吸附流分；再用5BV(13.5L)去离子水洗脱，收集水洗脱流分；合并未吸附流分和水洗脱流分，浓缩干燥，得第一干燥物49.89g。

方法三

上述约14L苦参子水提液缓慢加入处理好的D201大孔吸附树脂柱中(柱体积约2.7L)，流速约30mL/min，收集上样过程中的未吸附流分；再用5BV(13.5L)去离子水洗脱，收集水洗脱流分；合并未吸附流分和水洗脱流分，浓缩干燥，得第一干燥物52.76g。

方法四

上述约14L苦参子水提液缓慢加入处理好的D301大孔吸附树脂柱中(柱体积约2.7L)，流速约25mL/min，收集上样过程中的未吸附流分；再用5BV(13.5L)去离子水洗脱，收集水洗脱流分；合并未吸附流分和水洗脱流分，浓缩干燥，得第一干燥物51.43g。

2.1.3中压纯化制备和富集

样品溶液制备：称取上述第一干燥物40.58g，溶于一定量的水中，制成浓度为400mg/mL的样品溶液。

色谱条件：自装填ODS中压制备柱(50mm*160mm，50μm)；流动相：甲醇-0.05％甲酸水溶液15:85；检测波长225nm；流速20mL/min；进样量10mL。

采用Biotage Flash快速纯化制备色谱仪，根据上述色谱条件，对上述样品溶液进行分离、制备和富集，样品的中压纯化制备色谱图见图1。如图1所示，1～7个流分中，合并并富集流分6和7(含有该γ-L-谷氨酰-L-酪氨酸和该番石榴酸)，冷冻干燥，得第二干燥物7.04g。

称取第二干燥物适量，加水制成浓度为0.24mg/mL的溶液，在色谱条件(色谱柱Diamonsil C₁₈柱(4.6mm*250mm，5μm)；流动相：甲醇-0.1％甲酸水溶液15:85，流速1mL/min；检测波长：225nm；进样量20μL。)下检测，HPLC图见图2。

2.1.4高效液相色谱分离纯化和富集

样品溶液制备：称取上述第二干燥物7.0g，溶于一定量的水中，制成浓度为80mg/mL的样品溶液。

色谱条件：色谱柱Daisogel C₁₈柱(30mm*250mm，10μm)，流动相：甲醇-0.1％甲酸水溶液15:85，流速30mL/min；检测波长225nm；进样量2mL。

采用VarianProStar制备型高效液相色谱仪，根据上述色谱条件，对上述样品溶液进行分离纯化和富集，样品的高效液相制备色谱图见图3。如图3所示，分别富集峰1和峰2的峰尖部位流分，冷冻干燥，获得化合物1(γ-L-谷氨酰-L-酪氨酸)623mg和化合物2(番石榴酸)406mg。

2.2纯度检测

单体成分溶液的制备：分别精密称取化合物1和2适量，溶于水中，制成浓度为0.95mg/mL和1.02mg/mL的溶液。

按色谱条件(色谱柱Diamonsil C₁₈柱(4.6mm*250mm，5μm)；流动相：甲醇-0.1％甲酸水溶液15:85，流速1mL/min；检测波长：225nm；进样量20μL。)测定，化合物1和2纯度均大于98％，HPLC图见图4。

2.3结构鉴定

化合物1：白色无定型粉末，易溶于水。

HRESI-MS负离子模式下给出309.1085[M-H]^-(计算值309.1087)；正离子模式下给出311.1243[M+H]^-(计算值311.1249)确定其分子式为C₁₄H₁₈N₂O₆。

¹H NMR(600MHz,DMSO)δ:8.40(1H,s),是羟基活泼氢，7.00(2H,d,J＝7.6Hz,H-3,H-5),6.65(2H,d,J＝7.6Hz,H-2,H-6)，说明苯环是对位取代，4.26(1H,s,H-8),3.37(1H,s，H-4′),2.92(1H,d,J＝12.7Hz,H-7),2.72(1H,t,H-7),2.19(2H,m,H-2′),1.84(2H,m,H-3′)。

¹³C NMR(150MHz,DMSO)δ:174.0(C-9),172.2(C-1′),171.0(C-5′),156.4(C-1),130.4(C-3,C-5),128.3(C-4),115.5(C-2,C-6),54.9(C-8),53.7(C-4′),36.5(C-7),32.0(C-2′),27.4(C-3′)。

以上数据可确认化合物1为酪氨酸和谷氨酸结合形成的化合物，但不能确定构型。为此，使用L－酪氨酸和L－谷氨酸进行合成得到γ-L-谷氨酰-L-酪氨酸。并对化合物1和合成的化合物进行液相检测，发现其保留时间相同。经质谱检测，γ-L-谷氨酰-L-酪氨酸的HRESI-MS负离子模式下给出309.1089[M-H]^-(计算值309.1087)；正离子模式下给出311.1047[M+H]⁺(计算值311.1043)。负离子模式下两者均产生m/z 287、269、207、146等离子碎片，正离子模式下两者均产生m/z 294、248、165、136等离子碎片，其裂解规律相似。由此鉴定此化合物为γ-L-谷氨酰-L-酪氨酸。并且以上数据与文献γ-L-谷氨酰-L-酪氨酸数据(佘维娜,周治,姚忠,等.γ-谷氨酰转肽酶法合成γ-L-谷氨酰-L-酪氨酸[J].食品与发酵工业,2009,35(11):41-45)基本一致。

化合物2：白色无定型粉末，易溶于水。

HRESI-MS负离子模式下给出255.1249[M-H]^-(计算值255.1243[M-H]^-)，正离子模式下给出279.0481[M+Na]⁺，确定其分子式为C₁₁H₁₂O₇。

¹H NMR(600MHz,D₂O)δ:7.08(2H,d,J＝8.4Hz,H-3,H-5),6.75(2H,,J＝8.4Hz,H-2,H-6),4.59(1H,s,H-8),3.01(2H,d,2H-7)。

¹³C NMR(150MHz,D₂O),δ:175.9(COOH),174.6(COOH),154.4(C-1),131.5(C-5,C-3),127.2(C-4),115.1(C-6,C-2),30.2(C-7),39.8(C-8,C-9)。以上数据与文献番石榴酸(马悦.复方苦参注射液化学成分和质量控制研究[D].中国中医科学院,2012.)数据基本一致。

上述研究结果表明，苦参子含有一个不同于苦参其他部位的成分，为γ-L-谷氨酰-L-酪氨酸，这证明了苦参子组成的特殊性，同时此物质也是首次从植物中分离得到。整个制备分离过程简单易操作，因此可将苦参子作为γ-L-谷氨酰-L-酪氨酸和番石榴酸的分离原料。

苦参子中这两个水溶性成分的发现具有一定现实意义，其应用前景可观，具有良好的社会效益和经济效益，对其加以资源化利用与产业化开发，达到资源节约、创新资源价值和保护环境的目的，将对苦参植物资源的循环利用和产业经济发展起到积极的推动作用，并能更好服务于大众。

以上对本发明实施例进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明仅用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。同时，本领域技术人员依据本发明的思想，基于本发明的具体实施方式及应用范围上做出的改变或变形之处，都属于本发明保护的范围。综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims

1.一种苦参子中的水溶性化合物的分离方法，其特征在于，所述方法包括脱脂步骤、溶剂提取步骤、大孔树脂柱层析步骤、中压纯化制备步骤和高效液相色谱制备步骤，其中所述水溶性化合物为γ-L-谷氨酰-L-酪氨酸和番石榴酸，

其中，所述脱脂步骤包括以下步骤：

(2)在所述第一脱脂粉中加入第一溶剂后浸泡6至10小时，超声30至60分钟，过滤后的滤渣为第二脱脂粉；

其中，所述第一溶剂为石油醚和/或正己烷，

其中，所述溶剂提取步骤包括以下步骤：

(1)称取适量的所述第二脱脂粉，加入第二溶剂后超声30至60分钟，过滤，得到第一滤液；

(2)在所述第二脱脂粉中加入第三溶剂后超声30至60分钟，过滤，得到第二滤液；以及

(3)合并所述第一滤液和所述第二滤液，离心后取上清液，得到苦参子提取液；

其中，所述第二溶剂和所述第三溶剂为水；

其中，所述大孔树脂柱层析步骤包括以下步骤：

(1)将所述苦参子提取液添加至大孔树脂柱中，其中上样过程中未吸附的部分为未吸附流分；

(2)添加水进行洗脱，得到水洗脱流分；以及

(3)将所述未吸附流分和所述水洗脱流分合并后，浓缩干燥，得到第一干燥物；

其中，所述大孔树脂为HPD400大孔吸附树脂、HPD600大孔吸附树脂、D201大孔吸附树脂或D301大孔吸附树脂；

其中，所述中压纯化制备步骤包括以下步骤：

(1)称取适量的所述第一干燥物，溶于水中，制成浓度为300mg/mL至500mg/mL的第一样品溶液；以及

(2)所述第一样品溶液采用中压纯化制备色谱仪，通过ODS中压制备柱进行柱层析，合并含有所述水溶性化合物的流分，干燥，得到第二干燥物；

其中，所述ODS中压制备柱进行柱层析的流动相为甲醇-0.05％甲酸水溶液约15:85，所述ODS中压制备柱进行柱层析的检测波长为约225nm；

其中，所述高效液相色谱制备步骤包括以下步骤：

(1)称取适量的所述第二干燥物，溶于水中，制成浓度为60mg/mL至100mg/mL的第二样品溶液；以及

(2)所述第二样品溶液采用制备型高效液相色谱系统，通过ODS制备色谱柱进行柱层析，分别合并含有所述γ-L-谷氨酰-L-酪氨酸的流份和含有所述番石榴酸的流分，干燥，得到所述γ-L-谷氨酰-L-酪氨酸和所述番石榴酸；

其中，所述ODS制备色谱柱进行柱层析的流动相为甲醇-0.1％甲酸水溶液15:85，所述ODS制备色谱柱进行柱层析的检测波长为约225nm。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述苦参子粉末与所述第一溶剂的重量体积之比为1:3至1:10。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一脱脂粉与所述第一溶剂的重量体积之比为1:3至1:10。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述苦参子粉末与所述第一溶剂的重量体积之比为约1:5。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述第一脱脂粉与所述第一溶剂的重量体积之比为约1:5。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述浸泡的时间为约8小时。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述脱脂步骤中的所述超声的时间为约45分钟。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述脱脂步骤中的所述超声的功率为200W至300W。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述脱脂步骤中的所述超声的频率为30KHz至60KHz。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在所述脱脂步骤中的所述超声的功率为约250W。

11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，在所述脱脂步骤中的所述超声的频率为约40KHz。

12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二脱脂粉与所述第二溶剂的重量体积之比为1:8至1:15。

13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二脱脂粉与所述第三溶剂的重量体积之比为1:5至1:10。

14.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述第二脱脂粉与所述第二溶剂的重量体积之比为约1:10。

15.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述第二脱脂粉与所述第三溶剂的重量体积之比为约1:8。

16.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二溶剂和所述第三溶剂为去离子水。

17.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述溶剂提取步骤中的所述超声的时间为约45分钟。

18.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述离心的条件为在2000r/min至5000r/min条件下离心5min至15min。

19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述离心的条件为在约3000r/min条件下离心约10min。

20.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述大孔树脂柱层析步骤中的所述水为去离子水。

21.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述大孔树脂柱层析步骤中的所述水的用量为大孔树脂柱体积的5倍。

22.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述大孔树脂柱层析步骤中的所述流分的流速为15mL/min至30mL/min。

23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，在所述大孔树脂柱层析步骤中的所述流分的流速为约20mL/min。

24.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一样品溶液的浓度为约400mg/mL。

25.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述ODS中压制备柱的规格为50mm*160mm，50μm。

26.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述ODS中压制备柱进行柱层析的流速为约20mL/min。

27.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述ODS中压制备柱进行柱层析的进样量为约10mL。

28.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二样品溶液的浓度为约80mg/mL。

29.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述ODS制备色谱柱的规格为30mm*250mm，10μm。

30.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述ODS制备色谱柱进行柱层析的流速为约30mL/min。

31.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述ODS制备色谱柱进行柱层析的进样量为约2mL。

32.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在一定的色谱检测条件下，所述γ-L-谷氨酰-L-酪氨酸和所述番石榴酸的纯度均大于98％。

33.根据权利要求32所述的方法，其特征在于，所述色谱检测条件为色谱柱：C₁₈柱，4.6mm*250mm，5μm，流动相：甲醇-0.1％甲酸水溶液约15:85，流速：约1mL/min，检测波长：约225nm，进样量：约20μL。

34.根据权利要求1至33中任一项所述的方法在制备苦参子中的水溶性化合物、或包含所述水溶性化合物的药物组合物、或包含所述水溶性化合物的药物制剂的用途。