CN104496762B - 从普通油茶叶中分离出两种联苄类化合物的方法 - Google Patents

从普通油茶叶中分离出两种联苄类化合物的方法 Download PDF

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Abstract

从普通油茶叶中分离出两种联苄类化合物的方法，包括以下步骤：（1）原料准备：将普通油茶叶洗净、除杂、风干，粉碎；（2）提取：将普通油茶叶粉用乙醇溶液加热浸提，过滤，浓缩，得浓缩液；（3）分离纯化：将浓缩液过大孔树脂，然后用蒸馏水及乙醇溶液依次洗脱，分别收集、合并洗脱液，得洗脱液混合物；（4）硅胶分离：将洗脱液混合物浓缩后进行硅胶层析，然后用二氯甲烷、甲醇和水的混合溶液进行洗脱，分别收集目标馏分段；（5）液相制备：分别将目标馏分段浓缩后溶解，用液相半制备收集，即成。经过鉴定确认了两种目标产物成分，其得率可达37mg/kg和200mg/kg，纯度＞90%；本发明方法制备工艺简便，适于工业生产。

Description

从普通油茶叶中分离出两种联苄类化合物的方法
技术领域
本发明涉及一种分离联苄类化合物的方法，具体涉及一种从普通油茶叶中分离出两种联苄类化合物的方法。
背景技术
我国生长的油茶主要有以下几种：普通油茶（CamelliaoleiferaAbel）约占总面积的98%，其次为浙江省的浙江红花油茶、云南省的腾冲红花油茶、广东省和广西的南山茶等。油茶研究大多着眼于油茶果或其种质资源，每年四五月间打叶产生的大批落叶造成了很大的资源浪费。
研究表明，油茶叶成分组成复杂，含有脂肪、还原糖、蛋白质、氨基酸、酸、灰分、叶绿素、茶皂素和黄酮类物质等成分，其活性成分具有抗氧化、抗自由基、抑菌保鲜，及抗癌、防癌等功效。近年来，油茶活性成分的研究瓶颈在于提取方法及分离纯化技术的落后，不能很好的实现油茶中活性成分的高效提取或分离。
3,5,4’-三羟基联苄又名二氢白藜芦醇，CAS#58436-28-5，分子式为C14H14O3，分子量为230，其结构式如下所示：
GakhAA（2010年）和AnisimovaNY（2011年）等研究发现二氢白藜芦醇相对于反式白藜芦醇和顺式白藜芦醇具有两相效应。AnisimovaNY（2011年）的结论是：1×10-10～1×10-7M浓度下二氢白藜芦醇对雄激素非依赖性前列腺癌细胞系PC-3和DU-145具有增殖作用，高浓度（1×10-5～1×10-3M）下二氢白藜芦醇具有明显的增殖抑制作用。
二氢白藜芦醇的在天然产物中报道非常少，二氢白藜芦醇主要作为白藜芦醇摄入后在血浆、尿和粪便中的代谢产物而开展研究，需要的实验试剂二氢白藜芦醇常常用氢化白藜芦醇的方法获得。至今为止，从天然植物中提取二氢白藜芦醇的文章不超过20篇，主要报道的有地钱、球茎石豆兰、良木坡垒木的干材、龙脑香科植物、怀槐木、杯鞘石斛等植物及部位。二氢白藜芦醇作为天然产物发现最早是1984年，El-FeralyFS.用95%乙醇提取，氯仿溶解部分再用10%的甲醇及正己烧分溶，取甲醇溶解物进行层析，以含4%乙醇的氯仿展开，得到二氢白藜芦醇；AdesanyaSA等（1989年）对感染可可球二孢的黄药子的珠芽和块茎用乙酸乙酯提取分离得到了主要的植物抗毒素二氢白藜芦醇；在葡萄酒中；是近年才检测到二氢白藜芦醇的，其原因在于其数量比反式白藜芦醇和顺式白藜芦醇数量少；2009年Király-VéghelyZ等用加压薄层分离的方法检测到了二氢白藜芦醇，ikulskiD（2010年），Rodríguez-CaboT（2014年）用固相微萃取浓缩的方法检测到了红酒中的二氢白藜芦醇。然而，加压薄层的方法分离复杂样品非常困难，主要适合用于定性分析，用于制备仍然有难度；而固相微萃取处理的样品量少，不适合工业应用。
1-（3’,5’-二甲氧基）苯基-2-[4’’-O-β-D-吡喃葡萄糖基（6→1）-O-α-L-吡喃鼠李糖基]苯乙烷，CAS#:1338076-61-1，分子式为C28H38O12，分子量为566，其结构式如下所示：
2011年ChenYueLong等首次在油茶叶中发现了该新物质；其制备方法是将4.5kg晒干的油茶叶用95%的乙醇回流萃取，过滤。将乙醇提取液蒸发浓缩至220g，将浓缩液用石油醚、乙酸乙酯从水中萃取。利用乙酸乙酯萃取物进行柱层析，乙醇提取液经柱层析分离出6个主馏分，冲洗液分别为CHCl3/MeOH（100:1，50:1，30:1，15:1，10:1，5:1）。CHCl3/MeOH（10:1）组分用sephadexLH-20柱，用MeOH/H2O（1:1）洗脱得到该化合物，得率为4mg/kg。该化合物为植物的次生代谢产物，是植物在逆环境下形成的抗毒素，植物多酚的含量与生长环境相关，该文献中的样品不能再现。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种提取率或分离率高，产品纯度高，制备工艺简便，适于工业生产的从普通油茶叶中分离出两种联苄类化合物的方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：一种从普通油茶叶中分离出两种联苄类化合物的方法，包括以下步骤：
（1）原料准备：将普通油茶叶洗净并去除杂质，自然风干，粉碎得普通油茶叶粉备用；
（2）提取：将普通油茶叶粉用体积分数20～80%的乙醇溶液进行加热浸提，过滤得提取液，将提取液浓缩至体积为浓缩前的30～50%，得浓缩液；
（3）分离纯化：将步骤（2）所得浓缩液的2.0～3.5BV过大孔树脂，吸附完成后，用2～6BV蒸馏水，1～8BV体积分数15～25%的乙醇溶液，0.5～6BV体积分数45～55%的乙醇溶液，0.5～6BV体积分数75～85%的乙醇溶液依次洗脱，分别收集洗脱液，将体积分数45～55%和75～85%的乙醇溶液洗脱液合并，得洗脱液混合物；
（4）硅胶分离：将步骤（3）所得洗脱液混合物浓缩后进行硅胶层析，然后选用二氯甲烷、甲醇和水中二氯甲烷含量以梯度递减的混合溶液作为洗脱剂先后进行洗脱，分段收集洗脱液，经过液相色谱检测，合并含有3,5,4’-三羟基联苄的馏分段，命名为第一顺序组分；合并含有1-(3’,5’-二甲氧基)苯基-2-[4’’-O-β-D-吡喃葡萄糖基(6→1)-O-α-L-吡喃鼠李糖基]苯乙烷的馏分段，命名为第二顺序组分；
（5）液相制备：将步骤（4）所得第一顺序组分浓缩后用氮吹仪吹干，用相当于其1～2倍量mL/g的二甲基亚砜溶解，进行液相色谱检测，采用液相半制备收集3,5,4’-三羟基联苄的馏分，干燥得3,5,4’-三羟基联苄（CAS#58436-28-5，以下简称“化合物1”）。
步骤（1）中，所述普通油茶叶采自湖南省天际岭国家森林公园，由中南林业科技大学谭晓凤教授鉴定为普通油茶（CamelliaOleiferaAbel.）。
进一步，将步骤（4）所得第二顺序组分浓缩后用氮吹仪吹干，用相当于其1～2倍量mL/g的二甲基亚砜溶解，进行液相色谱检测，采用液相半制备收集1-(3’,5’-二甲氧基)苯基-2-[4’’-O-β-D-吡喃葡萄糖基(6→1)-O-α-L-吡喃鼠李糖基]苯乙烷的馏分，干燥得1-(3’,5’-二甲氧基)苯基-2-[4’’-O-β-D-吡喃葡萄糖基(6→1)-O-α-L-吡喃鼠李糖基]苯乙烷（CAS#:1338076-61-1，以下简称“化合物2”）。
进一步，步骤（2）中，所述加热浸提中每克普通油茶叶粉加入1.5～6mL体积分数20～80%的乙醇溶液，浸提温度为50～80℃，浸提≥1次，每次1～3h。采用体积分数20～80%的乙醇溶液不同于工业酒精，两种提取液的极性不同，根据相似相容原理会导致提取物质的差别。
进一步，步骤（2）中，所述加热浸提中每克普通油茶叶粉加入2～3mL体积分数45～65%的乙醇溶液，浸提温度为60～70℃，浸提2～4次，每次2h。
进一步，步骤（2）中，所述浓缩为减压浓缩，浓缩的温度为40～50℃，真空度为0.08～0.09MPa；步骤（4）中，所述浓缩为减压浓缩，浓缩的温度为35～45℃，真空度为0.08～0.09MPa，浓缩后浓缩液中固含量为34～36%；步骤（5）中，所述浓缩为减压浓缩，浓缩的温度为30～40℃，真空度为0.08～0.09MPa，浓缩至溶剂完全蒸发。
进一步，步骤（3）中，用3～4BV蒸馏水，4～6BV体积分数15～25%的乙醇溶液，1～2BV体积分数45～55%的乙醇溶液、1～2BV体积分数75～85%的乙醇溶液依次洗脱。体积分数45～55%的乙醇溶液和体积分数75～85%的乙醇溶液与目标产物的极性相当，根据相似相容原理目标产物将存在该洗脱组分中。
进一步，步骤（4）中，所述二氯甲烷、甲醇和水中二氯甲烷含量以梯度递减的混合溶液中体积配比依次为7～9:1:0.1、6～8:1:0.1、4～6:1:0.1，洗脱体积分别为0.8～1.2BV、2.5～3.5BV、1.5～2.5BV。所选洗脱剂中二氯甲烷毒性小，减少了操作过程中的危险性；洗脱剂中加水后减少了拖尾现象，使得分离效果好；洗脱梯度多，提供了不同性质的化合物的分离条件，从而获得了更多的未知物质；洗脱剂二氯甲烷、甲醇和水的比例以及洗脱体积是利用薄层点样，通过比较样品在展开剂中展开后显示在薄层板上的位置来确定的。
进一步，步骤（3）、（4）中，所述洗脱的流速为0.5～1.5BV/h。
进一步，步骤（3）中，所述大孔树脂为D-101型大孔树脂。
进一步，步骤（3）中，所述大孔树脂的用量为9～11L，大孔树脂填充的径高比为1:4.5～5.5；步骤（4）中，所述硅胶的用量为0.8～1.2L，硅胶填充的径高比为1:4～5。
步骤（5）中，在进行液相色谱检测时，不断调整液相制备的流动相洗脱梯度，使得色谱中主要峰分离度大于1.5，分离效果好，保证了目标化合物的收集及纯度。
本发明方法的有益效果如下：
（1）在Scifinder和reaxys数据库查新，化合物1在山茶属植物中为首次发现，其得率为37mg/kg；化合物2在天然产物中为第2次成功提取（首次也是在普通油茶叶中发现的），其得率为200mg/kg，是首次文献报道的100倍，所得的产品中单一化合物1或2的纯度＞90%；
（2）本发明用于分离化合物1的方法中，样品采集量大，且用大孔树脂对样品进行分段，在柱层析阶段对样品进行了多阶段收集，创造尽可能多的分离制备条件，有利于获得一些微量的化合物，因此能成功分离化合物1；
（3）本发明用于分离化合物2的方法中，相较于首次报道提取的文献中采用体积分数98%的乙醇，本发明方法第一次在大孔树脂层析后采用体积分数45～55%和75～85%的乙醇溶液，再结合硅胶层析后采用二氯甲烷、乙醇和水的组合进行梯度洗脱，化合物的提取率显著提高；
（4）本发明方法制备工艺简便，适于工业生产。
附图说明
图1是本发明实施例1硅胶柱分离后第一顺序组分的液相色谱图（图中5号峰为目标化合物1）；
图2是本发明实施例1硅胶柱分离后第二顺序组分的液相色谱图（图中4号峰为目标化合物2）；
图3是本发明实施例1化合物1的1H-NMR谱图；
图4是本发明实施例1化合物1的H-HCOSY谱图；
图5是本发明实施例1化合物1的13C-NMR谱图；
图6是本发明实施例1化合物1的DEPT-135谱图；
图7是本发明实施例1化合物1的HSQC谱图；
图8是本发明实施例1化合物1的HMBC谱图；
图9是本发明实施例1化合物2的1H-NMR谱图；
图10是本发明实施例1化合物2的H-HCOSY谱图；
图11是本发明实施例1化合物2的13C-NMR谱图；
图12是本发明实施例1化合物2的DEPT-135谱图；
图13是本发明实施例1化合物2的HSQC谱图；
图14是本发明实施例1化合物2的HMBC谱图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。
本发明实施例中所使用的各种化学试剂如无特殊说明，均通过常规商业途径获得。
本发明实施例中所涉及的仪器装置及检测条件如下：
1200型高效液相色谱仪：美国Agilent公司制造，紫外检测波长为280nm，流速1mL/min，柱温25℃；
色谱柱为unitaryC18，10μm，100A，10mm*250mm；
AVANCE500MHZ超导傅立叶变换核磁共振仪：瑞士Bruker公司制造；
1H频率为500MHz，13C频率为125MHz；
NMR实验中鉴定化合物1使用的氘代试剂为美国Sigma-Aldrich公司生产的CH3OD（氘代率≥99.8%），鉴定化合物2使用的氘代试剂为美国Sigma-Aldrich公司生产的DMSO-d6（氘代率≥99.8%）。
实施例1
普通油茶叶中化合物1的提取：
（1）原料准备：新鲜油茶叶采自湖南省天际岭国家森林公园，由中南林业科技大学谭晓凤教授鉴定为普通油茶（CamelliaOleiferaAbel.）；将普通油茶叶洗净去梗，自然风干，粉碎后得到样品20kg；
（2）提取：用60L体积分数50%的乙醇溶液，在70℃热下浸提2次，每次2h，过滤得提取液，将提取液在40℃，真空度0.08MPa下进行减压浓缩，浓缩至体积为浓缩前的30%，得浓缩液；
（3）分离纯化：将步骤（2）所得3BV的浓缩液过D-101大孔树脂，其中，大孔树脂的用量为10L，树脂填充的径高比为1:5.5；吸附完成后，用3BV蒸馏水、6BV体积分数20%的乙醇溶液、2BV体积分数50%的乙醇溶液、1.5BV体积分数80%的乙醇溶液依次洗脱，洗脱流速为1BV/h，以每BV为单位收集洗脱液，将收集到的每份洗脱液进行高效液相色谱检测，比照高效液相色谱图峰形及出峰时间来确定合并方案，具体来说，当两个色谱图的主要色谱峰个数相同及出峰时间偏离在0.5min之内即视为相同将其合并，最终确定的合并方案是将体积分数50%和80%的乙醇溶液洗脱液合并，得洗脱液混合物；
（4）硅胶分离：将步骤（3）所得洗脱液混合物在40℃，真空度0.08MPa下进行减压浓缩，浓缩至固含量为35%，然后进行硅胶层析，其中，硅胶的用量为1L，硅胶填充的径高比为1:4；然后选用不同比例的二氯甲烷、甲醇和水的混合溶液为洗脱剂，其配比依次为8:1:0.1，7:1:0.1，5:1:0.1，洗脱体积依次为1BV、3BV、2BV，洗脱流速为1BV/h，以每1/4BV为单位分段收集洗脱液，经过液相色谱检测，取第7段收集的洗脱液作为含有化合物1的馏分段，命名为第一顺序组分；合并第19～22段收集的洗脱液作为含有化合物2的馏分段，命名为第二顺序组分；
（5）液相制备：将步骤（4）所得第一顺序组分在35℃，真空度为0.08MPa下进行减压浓缩至溶剂完全蒸发，然后用氮吹仪吹干后，得0.8g粉末状固体，用1mL二甲基亚砜溶解，进行液相色谱检测（色谱图如图1），采用液相半制备收集化合物1的馏分（第3号峰），干燥得纯度为91.2%的单一化合物1，其得率为37mg/kg。色谱条件：流动相A：甲醇，B：体积分数0.2%的甲酸；洗脱梯度为：0min：30%A；5min：50%A；25min：60%A。
普通油茶叶中化合物2的提取：
将步骤（4）所得第二顺序组分在35℃，真空度为0.08MPa下进行减压浓缩至溶剂完全蒸发，然后用氮吹仪吹干后，得3g粉末状固体，用5mL二甲基亚砜溶解，进行液相色谱检测（色谱图如图2），采用液相半制备收集化合物2的馏分（第4号峰），干燥得纯度为92.3%的单一化合物2，其得率为200mg/kg，是首次公开该物质文献得率9mg/4.5kg的100倍。色谱条件：流动相A：甲醇，B：体积分数0.2%的甲酸；洗脱梯度为：0min：50%A；15min：50%A；25min：80%A。
普通油茶叶中两种联苄类化合物的结构鉴定：
综合运用1H-NMR、13C-NMR、H-HCOSY、DEPT、HSQC以及HMBC等核磁共振方法，对其结构进行了分析。
化合物1结构解析：
1H-NMR谱共给出5组峰，其中δ4.98为样品中残留的水峰。
结合H-HCOSY可得出：δ6.98[2H；m；8.5Hz]与δ6.70[2H;m;8.5Hz]形成典型的对位取代苯的AA’BB’自旋系统；δ6.16[2H;d;2.0Hz]与δ6.12[1H;t;2.0Hz]形成典型的1,2,4三取代苯AX2的自旋系统；δ2.74-2.78[4H;m]形成一组A2B2的自旋系统，即-CH2CH2-单元。因此，初步推断化合物中含有对位取代苯、1,2,4三取代苯及一组-CH2CH2-单元。
13C-NMR谱较为清晰，其中δ49.00为溶剂（CH3OD）峰，当磁环境一致时，碳信号的强弱近似正比于碳原子数量。通过DEPT谱可以很好的确定化合物中碳原子的级数，本实验选择倾倒角135°，即DEPT-135进行测试，在DEPT-135图谱中，伯、叔碳均为向上的峰，仲碳为向下的峰，季碳不出峰。
结合13C-NMR及DEPT-135图谱可以看出，δ37.93与δ39.46为仲碳（CH2），符合上文中含-CH2CH2-单元的推断，其余8组碳信号中，有4组（δ159.17,130.01,115.97,108.09）信号强度约为其他4组（δ156.24,145.62,134.11,101.11）信号强度的2倍，因此推断前4组信号其为2个对称碳信号重叠。因此该8组碳信号一共包含12个碳原子，其化学位移符合苯环碳的特征位移，且数量刚好为两个苯环的碳数量，其中δ159.17、δ156.24、δ145.62、δ134.11为季碳（C），其余4组为叔碳（CH），与上文中化合物含有对位取代苯、1,2,4三取代苯的推断相吻合，进一步佐证了上文中的推断。化合物中不再有其他含碳基团，而δ159.17、δ156.24均为季碳，其化学位移值符合羟基苯环碳特征位移，因此推断其所连取代基为羟基。
HSQC谱图能给出C-H直接相关信号，HMBC谱图能给出跨越2-5跟化学键的异核相关信号，通过对HSQC及HMBC的解读，能有效的推导出化合物中各单元的连接方式，进而得出化合物的结构。
通过HSQC谱图可以看出：δ115.97[2C]与δ6.70[2H;d;8.5Hz]相关，δ130.01[2C]与δ6.98[2H;d;8.5Hz]相关，符合化合物中含对位取代苯推断；δ108.09[2C]与δ6.16[2H;d;2.0Hz]相关，δ101.11[1C]与δ6.12[1H;t;2.0Hz]相关，符合化合物中含1,2,4三取代苯推断；δ39.46[1C]、δ37.93[1C]与2.74-2.78[4H;m]相关，符合化合物中含-CH2CH2-推断。从HMBC图谱中可以看出，δ145.62[1C]与δ2.74-2.78[4H;m]远程相关；δ134.11[1C]与δ2.74-2.78[4H;m]远程相关，因此，最终推断化合物1的结构式为：
以上数据证明所得化合物确为目标产物3,5,4’-三羟基联苄（CAS#58436-28-5）。
化合物2结构解析：
1H-NMR谱给出复杂的多组峰，其中δ3.564为样品中羟基与水形成的HOD峰，δ3.184为样品中未除尽的甲醇峰；H-HCOSY表明，δ7.157[2H;d;8.5Hz]与δ6.939[2H;d;8.5Hz]形成典型的对位取代苯的AA’BB’自旋系统；δ6.386[2H;d;2.0Hz]与δ6.299[1H;t;2.0Hz]形成典型的1,2,4三取代苯的AX2的自旋系统；DEPT谱及HSQC谱中δ3.689[6H;S]为2个等价的OCH3，在HMBC谱中δ160.803[2C]与3.689[6H;S]相关，证实该自旋系统的单元结构为：
δ2.817-2.761[4H;m]形成一组A2B2的自旋系统，对应的单元结构为：-CH2CH2-在HMBC谱中δ144.407[1C]、δ132.79[1C]、δ129.653[2CH]、δ98.228[2CH]都与δ2.817-2.761[4H;m]远程相关，推导出该化合物的单元结构式为：
根据DEPT谱、H-HCOSY谱、HSQC谱、HMBC谱对1H-NMR谱及13C-NMR谱中各峰进行关联证实该化合物中含有下列两个单元结构：
在HMBC谱中156.110[1C]与δ4.757[1H;d;7.5Hz]相关；δ67.109[1CH]与δ4.581[1H;d;1.0Hz]相关，推断化合物2的结构式为：
以上数据证明所得化合物确为目标产物1-(3’,5’-二甲氧基)苯基-2-[4’’-O-β-D-吡喃葡萄糖基(6→1)-O-α-L-吡喃鼠李糖基]苯乙烷（CAS#:1338076-61-1）。
结合所有核磁谱图及分析，对核磁谱图中的信号进行归属，归属结果见表1。
表1普通油茶叶两种联苄类化合物的1H-NMR及13C-NMR核磁信号归属一览表
核磁谱图中的信号的归属结果进一步证明：化合物1为3,5,4’-三羟基联苄（CAS#58436-28-5）；化合物2为1-(3’,5’-二甲氧基)苯基-2-[4’’-O-β-D-吡喃葡萄糖基(6→1)-O-α-L-吡喃鼠李糖基]苯乙烷（CAS#:1338076-61-1）
实施例2
普通油茶叶中化合物1的提取：
（1）原料准备：新鲜油茶叶采自湖南省天际岭国家森林公园，由中南林业科技大学谭晓凤教授鉴定为普通油茶（CamelliaOleiferaAbel.）；将普通油茶叶洗净去梗，自然风干，粉碎后得到样品20kg；
（2）提取：用40L体积分数60%的乙醇溶液，在60℃热下浸提3次，每次2h，过滤得提取液，将提取液在50℃，真空度0.09MPa下进行减压浓缩，浓缩至体积为浓缩前的35%，得浓缩液；
（3）分离纯化：将步骤（2）所得3BV的浓缩液过D-101大孔树脂，其中，大孔树脂的用量为9L，树脂填充的径高比为1:4.5；吸附完成后，用4BV蒸馏水、4BV体积分数20%的乙醇溶液、1BV体积分数50%的乙醇溶液、1BV体积分数80%的乙醇溶液依次洗脱，洗脱流速为0.8BV/h，以每BV为单位收集洗脱液，将收集到的每份洗脱液进行高效液相色谱检测，比照高效液相色谱图峰形及出峰时间来确定合并方案，具体来说，当两个色谱图的主要色谱峰个数相同及出峰时间偏离在0.5min之内即视为相同将其合并。最终确定的合并方案是将体积分数50%和80%的乙醇溶液洗脱液合并，得洗脱液混合物；
（4）硅胶分离：将步骤（3）所得洗脱液在45℃，真空度0.09MPa下进行减压浓缩，浓缩至固含量为34%，然后进行硅胶层析，其中，硅胶的用量为1.2L，硅胶填充的径高比为1:5；然后选用不同比例的二氯甲烷、甲醇和水为洗脱剂，其配比依次为8:1:0.1，7:1:0.1，5:1:0.1，洗脱体积依次为1BV、3BV、2BV，洗脱流速为0.8BV/h，以每1/4BV为单位分段收集洗脱液，经过液相色谱检测，取第7段收集的洗脱液作为含有化合物1的馏分段，命名为第一顺序组分；合并第19～22段收集的洗脱液作为含有化合物2的馏分段，命名为第二顺序组分；
（5）液相制备：将步骤（4）所得第一顺序组分在30℃，真空度0.09MPa下进行减压浓缩至溶剂完全蒸发，然后用氮吹仪吹干后，得1g粉末状固体，用1.2mL二甲基亚砜溶解，进行液相色谱检测，采用液相半制备收集化合物1的馏分，干燥得纯度为91.2%的单一化合物1，其得率为37mg/kg。色谱条件：流动相A：甲醇，B：体积分数0.2%的甲酸；洗脱梯度为0min：30%A；5min：50%A；25min：60%A。
普通油茶叶中化合物2的提取：
将步骤（4）所得第二顺序组分在30℃，真空度为0.09MPa条件下进行减压浓缩至溶剂完全蒸发，然后用氮吹仪吹干后，得2.8g粉末状固体，用5mL二甲基亚砜溶解，进行液相色谱检测，采用液相半制备收集化合物2的馏分，干燥得纯度为92.3%的单一化合物2，其得率为192mg/kg，是首次公开该物质文献得率9mg/4.5kg的96倍。色谱条件：流动相A：甲醇，B：体积分数0.2%的甲酸；洗脱梯度为：0min：50%A；15min：50%A；40min：100%A。

Claims (7)

1.一种从普通油茶叶中分离出两种联苄类化合物的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）原料准备：将普通油茶叶洗净并去除杂质，自然风干，粉碎得普通油茶叶粉备用；
（2）提取：将普通油茶叶粉用体积分数20～80%的乙醇溶液进行加热浸提，过滤得提取液，将提取液浓缩至体积为浓缩前的30～50%，得浓缩液；
（3）分离纯化：将步骤（2）所得浓缩液的2.0～3.5BV过大孔树脂，吸附完成后，用3～4BV蒸馏水，4～6BV体积分数15～25%的乙醇溶液，1～2BV体积分数45～55%的乙醇溶液，1～2BV体积分数75～85%的乙醇溶液依次洗脱，分别收集洗脱液，将体积分数45～55%和75～85%的乙醇溶液洗脱液合并，得洗脱液混合物；
（4）硅胶分离：将步骤（3）所得洗脱液混合物浓缩后进行硅胶层析，然后选用二氯甲烷、甲醇和水中二氯甲烷含量以梯度递减的混合溶液作为洗脱剂先后进行洗脱，分段收集洗脱液，经过液相色谱检测，合并含有3,5,4’-三羟基联苄的馏分段，命名为第一顺序组分；合并含有1-(3’,5’-二甲氧基)苯基-2-[4’’-O-β-D-吡喃葡萄糖基(6→1)-O-α-L-吡喃鼠李糖基]苯乙烷的馏分段，命名为第二顺序组分；所述二氯甲烷、甲醇和水中二氯甲烷含量以梯度递减的混合溶液中体积配比依次为7～9:1:0.1、6～8:1:0.1、4～6:1:0.1，洗脱体积分别为0.8～1.2BV、2.5～3.5BV、1.5～2.5BV；
（5）液相制备：将步骤（4）所得第一顺序组分浓缩后用氮吹仪吹干，用相当于其1～2倍量mL/g的二甲基亚砜溶解，进行液相色谱检测，采用液相半制备收集3,5,4’-三羟基联苄的馏分，干燥得3,5,4’-三羟基联苄；
将步骤（4）所得第二顺序组分浓缩后用氮吹仪吹干，用相当于其1～2倍量mL/g的二甲基亚砜溶解，进行液相色谱检测，采用液相半制备收集1-(3’,5’-二甲氧基)苯基-2-[4’’-O-β-D-吡喃葡萄糖基(6→1)-O-α-L-吡喃鼠李糖基]苯乙烷的馏分，干燥得1-(3’,5’-二甲氧基)苯基-2-[4’’-O-β-D-吡喃葡萄糖基(6→1)-O-α-L-吡喃鼠李糖基]苯乙烷。
2.根据权利要求1所述从普通油茶叶中分离出两种联苄类化合物的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述加热浸提中每克普通油茶叶粉加入1.5～6mL体积分数20～80%的乙醇溶液，浸提温度为50～80℃，浸提≥1次，每次1～3h。
3.根据权利要求2所述从普通油茶叶中分离出两种联苄类化合物的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述加热浸提中每克普通油茶叶粉加入2～3mL体积分数45～65%的乙醇溶液，浸提温度为60～70℃，浸提2～4次，每次2h。
4.根据权利要求1或2所述从普通油茶叶中分离出两种联苄类化合物的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述浓缩为减压浓缩，浓缩的温度为40～50℃，真空度为0.08～0.09MPa；步骤（4）中，所述浓缩为减压浓缩，浓缩的温度为35～45℃，真空度为0.08～0.09MPa，浓缩后浓缩液中固含量为34～36%；步骤（5）中，所述浓缩为减压浓缩，浓缩的温度为30～40℃，真空度为0.08～0.09MPa，浓缩至溶剂完全蒸发。
5.根据权利要求1或2所述从普通油茶叶中分离出两种联苄类化合物的方法，其特征在于：步骤（3）、（4）中，所述洗脱的流速为0.5～1.5BV/h。
6.根据权利要求1或2所述从普通油茶叶中分离出两种联苄类化合物的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述大孔树脂为D-101型大孔树脂。
7.根据权利要求1或2所述从普通油茶叶中分离出两种联苄类化合物的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述大孔树脂的用量为9～11L，大孔树脂填充的径高比为1:4.5～5.5；步骤（4）中，所述硅胶的用量为0.8～1.2L，硅胶填充的径高比为1:4～5。
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