CN104817447B - 一种selaginellin M的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药技术领域，提供了一种从中药卷柏中制备含量在95%以上的selaginellin M的制备方法。该化合物具有如下式（I）的结构。本发明中所述的selaginellin M是采用卷柏科植物卷柏Selaginella tamariscina(Beauv．)Spring或垫状卷柏Selaginella pulvinata(Hook．et Grev．)Maxim．的干燥全草原料为起始原料，用有机溶剂和/或水进行提取并且大孔树脂吸附和Sephadex LH‑20吸附相结合的分离方法进行分离得到的。本发明具有工艺操作简单、重复性好，产率高，适合于工业化生产的优点，且本产品的纯度较高，其含量采用HPLC法检测在95%以上。

Description

一种selaginellin M的制备方法
技术领域：
本发明涉及卷柏中selaginellin M的制备方法，其含量采用HPLC法检测应在95％以上。属于中药提取分离、纯化领域。
背景技术：
中国药典2005年版中规定卷柏为卷柏科植物卷柏Selaginella tamariscina(Beauv.)Spring或垫状卷柏Selaginella pulvinata(Hook.et Grev.)Maxim.的干燥全草。全年均可采收，除去须根及泥沙，晒干。辛，平。归肝、心经。具有活血通经。用于经闭痛经，癥瘕痞块，跌扑损伤。卷柏炭化瘀止血。用于吐血，崩漏，便血，脱肛。卷柏中含有多种化学成分，如黄酮类，现已发现卷柏中含有芹菜素(apigenin)、穗花杉双黄酮(amentoflavone)、扁柏双黄酮(hinokiflavone)、异柳杉素(isocryptomerin)及阿曼托黄色(amentoflavone)等；苯丙素类、生物碱类、酚类、有机酸类等化合物。药理作用显示具有：免疫及抗肿瘤作用、对血液系统的作用、抗病毒、抑菌与抗炎作用、镇痛镇静等作用。selaginellin M为卷柏中一种有效成分，目前现有技术中未见此selaginellin M的提取方法。本发明提供了一种方便、简便、快速的制备高纯度selaginellin M的方法。
发明内容：
本发明所要解决的技术问题是提供一种从中药卷柏中提取一种含量在95％以上的selaginellin M的制备方法，目的是通过简单的工艺过程得到含量较高(含量大于95％)的selaginellin M。
本发明的技术方案是：从中药卷柏中提取一种含量在95％以上的selaginellin M的制备方法，其具体方法步骤为：
a)将卷柏科植物卷柏Selaginella tamariscina(Beauv.)Spring或垫状卷柏Selaginella pulvinata(Hook.et Grev.)Maxim.的干燥全草原料切成寸段；
b)用乙醇、甲醇、水中的一种或甲醇-水、乙醇-水按比例(1：9～9：1)混合溶剂回流提取，加入相当于药材重量的2-16倍溶剂，回流提取1-5次，每次0.5至6小时，合并提取液，滤过，得提取液；
c)将提取液回收溶剂并浓缩至相对密度为1.05－1.40(60℃)的清膏或稠膏，按比例(1：10～10：1)加入水，混悬，得混悬液。
d)将混悬液吸附于D101或各种极性、弱极性大孔吸附树脂柱，然后用乙醇-水或甲醇-水(按比例10：1～1：1)的混合溶剂洗脱，分别以每份1/100～1/20总量洗脱剂的体积量收集洗脱液流份，以三氯甲烷：甲醇(10：1～1：1)为展开剂采用TLC检查斑点，合并相同的棕褐色斑点洗脱流份。
e)将合并的相同棕褐色斑点洗脱流份回收溶剂，得棕褐色固体粉末。
f)将棕褐色固体粉末用2-100倍量的石油醚、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、三氯甲烷、乙醇、甲醇中的一种或两种(1：10～10：1)混合的混合有机溶剂溶解。
g)将棕褐色固体粉末的有机溶剂或混合有机溶剂加入以Sephadex LH-20为吸附剂的层析柱上吸附。
h)将吸附棕褐色固体粉末的Sephadex LH-20层析柱用石油醚、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、三氯甲烷中的一种或两种(1：10～10：1)混合的混合溶剂分别与乙醇或甲醇(10：1～1：1)的混合溶剂洗脱，分别以每份1/100～1/20总量洗脱剂的体积量收集Sephadex LH-20层析柱的黄色色带，直至完全。以三氯甲烷：甲醇(10：1～1：1)为展开剂采用TLC跟踪检查斑点，合并相同的棕褐色斑点洗脱流份。
i)将合并的相同棕褐色斑点洗脱流份回收溶剂，得棕褐色固体粉末，即selaginellin M精制品，其含量采用HPLC法检测应在95％以上，转移率可达75％以上。
所述的甲醇-水、乙醇-水的浓度为30-75％；所述的大孔树脂柱优选D101。
步骤(d)中三氯甲烷：甲醇优选3：1。
步骤(h)中，三氯甲烷：甲醇＝3：1-4：1。
步骤(f)中，所述的有机溶剂为固体粉末的10-30倍量。
附：selaginellin M结构确证
selaginellin M结构解析
红色粉末，mp.171～172℃，易溶于甲醇及DMSO，不溶于水。10％硫酸显桃红色，碘熏出现棕黄色斑点。
UVλmax(MeOH)nm：300，264和257nm。
IRνmax(KBr)cm-1：3426(-OH)，2199(炔键)，1592(芳环)，1512，1383，1258，1167，834。
ESI-TOF-MS图谱中给出m/z：527.1858[M+H]+，计算值527.1853。
1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)显示26个质子信号，13C-NMR(75MHz，DMSO-d6)显示26个碳信号，其中有7个重叠碳信号，结合1H-NMR和13C-NMR推测分子式为C35H26O5。
1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)显示，δ9.92(1H,s)，δ9.42(1H,s)的两个质子信号为酚羟基上的质子，δ4.79(2H,s)为醇羟基上的质子。1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)中δ6.79(2H,d,J＝8.4Hz)，δ6.55(2H,d,J＝8.4Hz)；δ6.97(2H,d,J＝8.4Hz)，δ6.65(2H,d,J＝8.4Hz)；δ6.82(4H,d,J＝8.4Hz)显示有三个苯环对位取代时形成的AA'BB'偶合系统。根据HSQC与HMBC推测化合物1存在两个相同的结构片段A。
1H-NMR，13C-NMR由信号δ3.71(3H,s)，δ55.4推测为一个甲氧基信号，结合HSQC与HMBC推测化合物1存在一个结构片段B。
由信号δ7.68(1H,d,J＝7.9Hz)，δ7.35(1H,d,J＝7.9Hz)判断化合物1存在一个苯环上的邻四取代结构片段C。
13C-NMR显示，δ185.8为C＝O的碳信号，1H-NMR显示，δ7.44(1H,dd,J＝9.8,2.2Hz)，δ7.20(1H,dd,J＝9.8,2.2Hz)，δ6.36(1H,dd,J＝9.8,2.2Hz)，δ6.31(1H,dd,J＝9.8,2.2Hz)结合HSQC与HMBC，和文献[21]比对，推测化合物1结构中可能存在结构片段D。
另外，13C-NMR信号显示：δ83.9，δ98.8的碳信号应为C≡C的信号；HMBC显示，δ6.97(H-28)与δ98.8(C-27)有相关峰，推出C-27与C-33相连；δ4.79(-CH2OH)与δ121.1 (C-14)，δ127.2(C-16)，δ142.6(C-15)有相关，推出羟甲基连在C-15位；δ140.4(C-18)与δ6.79(H-20，H-24)相关，则C-18与C-25相连；δ7.68(H-16)与δ83.9(C-26)，δ98.8(C-27)与δ6.98(H-28，32)有相关峰，故推测化合物存在结构片段E。
综合1H-NMR，13C-NMR，HSQC和HMBC数据分析，将以上片段组合连接，确定化合物为
(R,S)-4-[[4'-hydroxy-4-(hydroxymethyl)-3-[2-(4-hydroxyphenyl)ethynyl][1,1'-biphenyl]-2-yl](4-me thoxyphenyl)methylene]-2,5-cyclohexadien-1-one。该化合物为未见文献报道的新化合物，命名为selaginellin M。该化合物的重要远程相关见Fig.1，1H-NMR，13C-NMR，HSQC和HMBC数据归属见(Table)。
Table NMR spectral data and HMBC Correlation of selaginellin M(300MHz，DMSO-d6)
本发明的经济效益是：
(1)工艺操作简单、重复性好，产率高，适合于工业化生产。
(2)本产品的纯度较高，其含量采用HPLC法检测在95％以上。
selaginellin M的应用：
(1)本发明的selaginellin M适合于制备临床上使用的1类新药制剂。
(2)本发明的selaginellin M也可以与其它化合物或药物联合使用，制备临床上使用的新药制剂。
(3)本发明的selaginellin M可以制成各种临床上使用的药物剂型。
(3)本发明的selaginellin M也可以做为对照品使用。
(4)本发明的selaginellin M也可以制成各种临床上使用的保健食品以及功能性化妆品。
具体实施方式：
下面结合实施例来更详细的说明本发明，但本发明并不受这些实施例的限制。
实施例1：
将干燥卷柏全草100g，切成寸段，加30％乙醇回流提取三次，每次加入11倍量，每次2小时，合并提取液，滤过，得提取液。将提取液回收乙醇并浓缩至相对密度为1.30(60℃)的清膏，加5倍量水混悬，得混悬液。将将混悬液加入以D101型大孔吸附树脂为吸附剂的层析柱上吸附。然后吸附柱用乙醇与水(10：1～1：1)的混合溶剂梯度洗脱，以每份1/40总量洗脱剂的体积量收集洗脱液流份，采用TLC检查斑点(以三氯甲烷：甲醇3：1为展开剂)，合并相同的棕褐色斑点洗脱流份。将合并的相同棕褐色斑点洗脱流份回收溶剂，得棕褐色固体粉末。将棕褐色固体粉末用30倍量的丙酮溶解后，加入以Sephadex LH-20为吸附剂的层析柱上吸附。将Sephadex LH-20层析柱用三氯甲烷与甲醇(3：1)的混合溶剂洗脱，分别以每份1/30总量洗脱剂的体积量收集Sephadex LH-20层析柱的棕褐色色带，直至完全。采用TLC跟踪检查斑点(以三氯甲烷：甲醇4：1为展开剂)，合并相同的棕褐色斑点洗脱流份。将合并的相同棕褐色斑点洗脱流份回收溶剂，得棕褐色固体粉末0.68g，即selaginellin M精制品，收率为0.68％，其含量采用HPLC法检测为98.9％上。
实施例2：
将干燥卷柏全草2kg，切成寸段，加75％乙醇回流提取三次，每次加入10倍量，每次1.5小时，合并提取液，滤过，得提取液。将提取液回收乙醇并浓缩至相对密度为1.10(60℃)的清膏，加7倍量水混悬，得混悬液。将混悬液加入以D101型大孔吸附树脂为吸附剂的层析柱上吸附。然后吸附柱用乙醇与水(10：1～1：1)的混合溶剂梯度洗脱，以每份1/30总量洗脱剂的体积量收集洗脱液流份，采用TLC检查斑点(以三氯甲烷：甲醇2：1为展开剂)，合并相同的棕褐色斑点洗脱流份。将合并的相同棕褐色斑点洗脱流份回收溶剂，得棕褐色固体粉末。将棕褐色固体粉末用15倍量的丙酮溶解后，加入以Sephadex LH-20为吸附剂的层析柱上吸附。将Sephadex LH-20层析柱用三氯甲烷与甲醇(3：1)的混合溶剂洗脱，分别以每份1/20总量洗脱剂的体积量收集Sephadex LH-20层析柱的棕褐色色带，直至完全。采用TLC跟踪检查斑点(以三氯甲烷：甲醇3：1为展开剂)，合并相同的棕褐色斑点洗脱流份。将合并的相同棕褐色斑点洗脱流份回收溶剂，得棕褐色固体粉末11.8g，即selaginellin M精制品，收率为0.59％，其含量采用HPLC法检测为97.6％。
实施例3：
将干燥卷柏全草30kg，切成寸段，加50％乙醇回流提取三次，每次加入9倍量，每次1.5小时，合并提取液，滤过，得提取液。将提取液回收乙醇并浓缩至相对密度为1.25(60℃)的清膏，加10倍量水混悬，得混悬液。将混悬液加入以D101型大孔吸附树脂为吸附剂的层析柱上吸附。然后吸附柱用乙醇与水(10：1～1：1)的混合溶剂梯度洗脱，以每份1/20总 量洗脱剂的体积量收集洗脱液流份，采用TLC检查斑点(以三氯甲烷：甲醇3：1为展开剂)，合并相同的棕褐色斑点洗脱流份。将合并的相同棕褐色斑点洗脱流份回收溶剂，得棕褐色固体粉末。将棕褐色固体粉末用10倍量的丙酮溶解后，加入以Sephadex LH-20为吸附剂的层析柱上吸附。将Sephadex LH-20层析柱用三氯甲烷与甲醇(3：1)的混合溶剂洗脱，分别以每份1/30总量洗脱剂的体积量收集Sephadex LH-20层析柱的棕褐色色带，直至完全。采用TLC跟踪检查斑点(以三氯甲烷：甲醇3：1为展开剂)，合并相同的棕褐色斑点洗脱流份。将合并的相同棕褐色斑点洗脱流份回收溶剂，得棕褐色固体粉末156g，即selaginellin M精制品，收率为0.52％，其含量采用HPLC法检测为95.3％。

Claims (7)

1.一种式（I）所示的selaginellin M的制备方法，其特征在于：
a) 将中药卷柏的干燥全草原料切成寸段；
b) 用乙醇、甲醇、水中的一种或甲醇-水、乙醇-水按比例1：9～9：1混合溶剂回流提取；合并提取液，滤过，得提取液；
c) 将提取液回收溶剂并浓缩，按比例1：10～10：1加入水，混悬，得混悬液;
d) 将混悬液吸附于D101大孔吸附树脂柱，然后用乙醇-水或甲醇-水=10：1～1：1的混合溶剂洗脱，分别以每份1/100～1/20总量洗脱剂的体积量收集洗脱液流份，以三氯甲烷：甲醇=10：1～1：1为展开剂采用TLC检查斑点，合并相同的洗脱流份;
e) 将合并的相同洗脱流份回收溶剂，得固体粉末;
f) 将固体粉末用2-100倍量的石油醚、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、三氯甲烷、乙醇、甲醇中的一种或两种按1：10～10：1混合的混合有机溶剂溶解;
g) 将固体粉末的有机溶剂或混合有机溶剂加入以Sephadex LH-20为吸附剂的层析柱上吸附;
h) 将吸附棕褐色固体粉末的Sephadex LH-20层析柱用石油醚、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、三氯甲烷中的一种或两种按1：10～10：1混合的混合溶剂分别与乙醇或甲醇按10：1～1：1的混合溶剂洗脱，分别以每份1/100～1/20总量洗脱剂的体积量收集Sephadex LH-20层析柱的黄色色带，直至完全,以三氯甲烷：甲醇=10：1～1：1为展开剂采用TLC跟踪检查斑点，合并相同的洗脱流份;
i) 将合并的相同洗脱流份回收溶剂，得固体粉末，即selaginellin M精制品;
（I）。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（b）中加入相当于药材重量的2-16倍溶剂，回流提取1-5次，每次0.5至6小时。
3.根据权利要求1所述的selaginellinM的制备方法，其特征在于：所述的中药卷柏为：卷柏科植物卷柏Selaginella tamariscina(Beauv．) Spring或垫状卷柏Selaginellapulvinata(Hook．et Grev．) Maxim．的干燥全草原料。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤b) 中甲醇-水或乙醇-水的浓度为30-75%。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤d) 中的大孔树脂为D101。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤h）中，三氯甲烷：甲醇=3：1-4：1。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤f）中，所述的有机溶剂为固体粉末的10-30倍量。
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