CN101711779B - 垫状卷柏提取物在制备抗阿尔茨海默病药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明对垫状卷柏提取物进行了深入的研究，发现垫状卷柏提取物能显著上调Klotho mRNA表达和抑制Aβ_1-42诱导的大鼠海马神经元细胞衰老，可用于制备抗阿尔茨海默病的药物。同时运用多种柱色谱分离技术和制备高效液相色谱分离方法，分离提取得到两种新的化合物垫状卷柏三酚及垫状卷柏二醇，同样可用于抗阿尔茨海默病药物的制备。本发明对于AD的防治，拓展我国AD药物在国际市场的占有率，提升我国创新药物研制水平具有极其重要的意义，同时具有巨大的经济效益。

Description

垫状卷柏提取物在制备抗阿尔茨海默病药物中的用途

技术领域

本发明涉及垫状卷柏提取物及其衍生物在制备抗阿尔茨海默病药物中的用途，还涉及了新的垫状卷柏提取物以及其提取方法。

背景技术

卷柏属植物约有700种植物，广泛分布于全世界，我国约产50余种，各地均有分布。2005年版《中国药典》收载了卷柏Selaginellatamariscina(Beauv.)Spring和垫状卷柏S.pulvinata(Hook.et Grev.)Maxim两个品种，除药典品种外，另约有20个品种的卷柏属植物在民间被作为药用。卷柏属植物的化学成分主要是双黄酮类化合物，其次是生物碱、苯丙素、甾类、多糖等。江南卷柏(S.moellendrfii hieron.)具有清热解毒，抗癌，止血之功效，用于治疗癌症，肺炎，急性扁桃炎，眼结膜炎和乳腺炎。现代药理研究表明卷柏属植物具有免疫调节及抗肿瘤、保护皮肤、抑菌抗炎、镇静镇痛等作用。垫状卷柏(Selaginella pulvinata Maxim.)为卷柏科卷柏属植物，垫状卷柏具有活血通经之功效，用于经闭痛经，跌打损伤，炒碳后可化淤止血。兰州大学Li-Ping Zhang等2007年报导了从中华卷柏中分离出一个新型碳骨架结构的炔酚类化合物--selaginellin，最近，林瑞超等从卷柏中分离得到了selaginellin A和selaginellin B。

随着社会老龄化的迅猛发展，老年性疾患已成为社会影响人类健康的突出问题，其中，阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)的患病率的快速增加。阿尔茨海默病是一种中枢神经系统的退行性疾病，其病症特点包括认知障碍，进行性记忆力丧失，日常生活能力进行性减退，并伴有各种神经精神症状和行为障碍。

众多学者对天然药物或中药中治疗AD的化学成分进行了大量的研究，发现了一些很有前途的活性成分，包括生物碱类、皂苷类、酚酮类和多糖类等。中药多糖的抗衰老和防治老年痴呆的作用，主要集中在其免疫调节、抗氧化作用和延长寿命等方面，这些结构不同的化学成分从不同的作用靶点发挥其作用。

Klotho基因具有调节生物体氧化防御功能的作用，以及与人类衰老的密切相关性，可能与其抑制体内钙离子平衡受损、钙离子依赖性蛋白酶过度活化、血管功能受损以及氧化应激有关，成为抗衰老性疾病包括AD治疗的新靶点。

世界卫生组织已将AD列入21世纪五大重点疾病之一。基于以上分析，进一步探明AD的发病机制；运用蛋白组学、生物信息科学、药物化学和计算机合理药物设计以及高通量药物筛选等先进技术，设计、合成或从天然药物中寻找、发现具有抗衰老作用的先导化合物或候选药物，对于AD防治，提升我国创新药物研制水平具有极其重要的战略意义。

发明内容

本发明发现垫状卷柏提取物能显著上调Klotho mRNA表达和抑制Aβ_{1- 42}诱导的大鼠海马神经元细胞衰老，可用于制备抗阿尔茨海默病的药物。

上述垫状卷柏提取物具有以下结构式：

其中，R₁为氢或羟基，R₂为氢、

或羟甲基。

本发明提供了一种垫状卷柏提取物垫状卷柏三酚，结构式为：

本发明提供了上述垫状卷柏三酚的提取方法，步骤包括：

1)取垫状卷柏全草，用75％乙醇回流提取两次，回收溶剂，得浑浊浓缩液，静置72h，过滤；

2)将步骤1)得到的滤液依次以石油醚、乙酸乙酯萃取，萃取后残留滤液进行聚酰胺柱层析，分别用30％、60％、95％乙醇-水梯度洗脱；

3)取步骤2)60％醇洗部分进行聚酰胺柱层析，乙醇-水梯度洗脱，再经制备液相色谱洗脱，70％甲醇为流动相，得到垫状卷柏三酚。

本发明还提供了垫状卷柏提取物垫状卷柏二醇，结构式为：

以及上述垫状卷柏三酚的提取方法，步骤包括：

1)取垫状卷柏全草，用75％乙醇回流提取两次，回收溶剂，得浑浊浓缩液，静置72h，过滤；

2)将步骤1)得到的滤液依次以石油醚、乙酸乙酯萃取，萃取后残留滤液进行聚酰胺柱层析，分别用30％、60％、95％乙醇-水梯度洗脱；

3)取步骤2)60％醇洗部分，浓缩至干粉，硅胶柱色谱分离，氯仿-甲醇梯度洗脱，所得粗品再经硅胶柱层析，氯仿-甲醇洗脱得粗晶，制备液相色谱分离，醋酸-甲醇为流动相洗脱，得垫状卷柏二醇。

本发明通过对垫状卷柏提取物进行修饰制备成含有水溶性基团的前药，如磷酸盐前药，含氨基酸或二肽的羧酸酯类前药，氨基甲酸酯类前药，O-烷基化化合物，聚乙二醇类前药等，增强了化合物的水溶性，改善了药物的吸收和代谢途径。

主要修饰有如下几种：

1.磷酸盐前药制备：

2.含氨基酸或二肽的羧酸酯类前药的制备

3.氨基甲酸酯类前药的制备

4.O-烷基化化合物及磷酸盐前药的制备

本发明还提供了垫状卷柏提取物及其衍生物的全合成方法，其合成路线为：

另外，本发明还对炔键进行了还原，对研究该类化合物的结构活性关系具有重要意义。

本发明对垫状卷柏提取物进行了深入的研究，可用于制备抗阿尔茨海默病的药物。同时运用多种柱色谱分离技术和制备高效液相色谱分离方法，分离提取得到两种新的化合物垫状卷柏三酚及垫状卷柏二醇。本发明对于AD的防治，拓展我国AD药物在国际市场的占有率，提升我国创新药物研制水平具有极其重要的意义，同时具有巨大的经济效益。

附图说明

图1是培养的海马神经元细胞呈MAP-2阳性，代表性的免疫荧光照片；

图2是Selaginellin抑制Aβ_1-42诱导的大鼠海马神经元端粒酶活性图；

图3是Selaginellin上调大鼠海马神经元Klotho mRNA表达图。

具体实施方式

实施例1

取垫状卷柏全草18.0kg，75％乙醇回流提取两次，回收溶剂，得浑浊浓缩液。静置72h，过滤，滤液依次以石油醚、乙酸乙酯萃取，萃取后残留滤液进行聚酰胺柱层析，乙醇-水梯度洗脱(30％、60％、95％)，取60％醇洗部分再进行聚酰胺柱层析，乙醇-水梯度洗脱，250ml/Fr.，Fr198-206再经Prep-HPLC分离，70％MeOH为流动相，得到垫状卷柏三酚(40mg)。

桔红色粉末(H₂O，冻干)。易溶于MeOH，不溶于H₂O.NH₃熏显紫红色，H₂SO₄-MeOH即显桃红色，FeCl₃试液显红色。

217，280，426(较弱)。

3420(OH)，2924，2854，1608，1593，1509，1467(苯环)，1160，835。

ESI-MS：m/z483.1[M+H]⁺。

垫状卷柏三酚波谱数据(DMSO，400MHz)

实施例2

取垫状卷柏全草18.0kg，75％乙醇回流提取两次，回收溶剂，得浑浊浓缩液。静置72h，过滤，滤液依次以石油醚、乙酸乙酯萃取，萃取后残留滤液进行聚酰胺柱层析，乙醇-水梯度洗脱(30％、60％、95％)，取60％醇洗部分，浓缩至干粉20.6g，硅胶柱色谱分离，氯仿-甲醇梯度洗脱，250ml/Fr.，取Fr56~80所得粗品再经硅胶柱层析，氯仿-甲醇10:1.2洗脱，Fr10-14合并得粗晶，Prep-HPLC分离，1％醋酸-甲醇(100:45)为流动相洗脱，得垫状卷柏二醇(140mg)。

棕黄色粉末。无明显熔点，252℃以后逐渐炭化。不溶于氯仿、水，溶于甲醇、丙酮，可溶于二甲基亚砜。

289，299nm。

3417，3226(OH)，2402

1634，1608，1510(苯环)，1401，1172，1086，929，523。UV、IR光谱数据分析可知，该化合物可能为pulvinataphentrol的同系列化合物。

ESIMS m/z622.9为准分子离子峰[M+Na+K+2H]⁺。

垫状卷柏二醇波谱数据(DMSO-d₆，500MHz)

实施例3

selagine1lin显著清除DPPH自由基和抑制Cu²⁺诱导的LDL氧化(表1)；selagine1lin显著上调K1otho mRNA表达和抑制Aβ_1-42诱导的大鼠海马神经元细胞衰老(图2～图4)。

表1.Selaginellin清除DPPH自由基和抑制Cu²⁺诱导的LDL氧化的半数有效浓度(EC₅₀)

Claims (2)

1.式I所示垫状卷柏提取的化合物在抗阿尔茨海默病药物制备中的用途，其中，所述的垫状卷柏提取的化合物具有以下结构式：

式I

其中，R₁为氢或羟基，R₂为氢、

或羟甲基。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的垫状卷柏提取的化合物具有以下结构式：

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