CN103739548B

CN103739548B - 具有抗真菌活性的化合物及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN103739548B
Application number: CN201310738837.1A
Authority: CN
Inventors: 曹园; 段金廒; 吴永平; 姚毅
Original assignee: Nanjing University of Chinese Medicine
Current assignee: Nanjing University of Chinese Medicine
Priority date: 2013-12-27
Filing date: 2013-12-27
Publication date: 2015-08-05
Anticipated expiration: 2033-12-27
Also published as: CN103739548A

Abstract

本发明公开了一个具有抗真菌活性的新化合物Ⅰ。本发明通过对垫状卷柏化学成分进行系统深入研究，经过波谱和质谱数据分析表明从垫状卷柏中分离得到新化合物Ⅰ。体外抗真菌活性研究表明，本发明提供的化合物Ⅰ对多种致病真菌，包括白色念珠菌、熏烟色曲霉、红色毛癣菌、须癣毛癣菌等具有明显的抑制作用，并且毒性低，可开发成为新的抗真菌药物。

Description

具有抗真菌活性的化合物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及具有抗真菌活性的化合物，具体涉及从卷柏科卷柏属植物垫状卷柏的全草中提取的得到的具有抗真菌活性的新化合物及其在治疗真菌感染疾病中的用途，属医药技术领域。

背景技术

近年来，随着肿瘤和艾滋病患者的不断增加，器官移植、导管插管及内窥镜技术的普遍开展，高效广谱抗生素、免疫抑制剂及皮质激素的广泛应用，真菌感染率不断增高。唑类（包括咪唑类、三唑类）及多烯类抗真菌药物是临床上常用的能有效治疗深部及浅表部真菌感染的抗真菌药，如咪唑中的酮康唑、克霉唑、咪康唑、益康唑等；三唑类中的氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑等；多烯类中的两性霉素B等。但化学合成的抗真菌药物面临严峻的局面：一是现有抗真菌药物对人体均有不同程度的毒副作用；二是临床大规模的耐药现象正变得越来越严重，几乎所有的抗真菌药物都发现耐药株，耐药性已成为临床抗真菌治疗失败的主要原因。从中药及天然药物资源寻找和发现高效、低毒，结构独特、克服临床耐药的抗真菌药物是一条有效途径。

垫状卷柏，俗称九死还魂草，长生不死草，为卷柏科卷柏属植物垫状卷柏的全草。为多年生常绿草本，高5-15cm，全株成莲座状，干后内卷如拳。性平、味辛；具有活血通经的功效，用于经闭痛经，癥瘕痞块，跌扑损伤；炒炭后可化瘀止血，用于吐血、崩漏、便血、脱肛。

发明内容

发明目的：本发明的目的是为了克服现有技术的不足，对垫状卷柏化学成分进行深入研究，提供一种具有抗真菌活性的新的化合物Ⅰ，本发明另一个目的是提供该化合物Ⅰ的制备方法和抗真菌用途。

技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：

具有抗真菌活性的化合物Ⅰ，命名为Selaginelline，其结构式如下：

作为优选方案，本发明所述的具有抗真菌活性的化合物Ⅰ，将该化合物Ⅰ（Selaginelline）和药学上可接受的载体制备成片剂、胶囊剂、注射剂、粉针剂、颗粒剂、脂肪乳剂、微囊、滴丸、软膏剂或透皮控释贴剂剂型的药物。

将本发明提供的化合物Ⅰ（Selaginelline）制成片剂时，把化合物Ⅰ（Selaginelline）和乳糖或玉米淀粉，需要时加入润滑剂硬脂酸镁，混合均匀，整粒，然后压片制成片剂。

将本发明提供的化合物Ⅰ（Selaginelline）制成胶囊剂时，把化合物Ⅰ（Selaginelline）和载体乳糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，然后装胶囊制成胶囊剂。

本发明提供的化合物Ⅰ（Selaginelline）制成颗粒剂时，把化合物Ⅰ（Selaginelline）和稀释剂乳糖或玉米淀粉、混合均匀，整粒，干燥，制成颗粒剂。

本发明提供的化合物Ⅰ（Selaginelline）制成粉针剂、注射液时加入载体按药学常规方法制备得到。

本发明提供的化合物Ⅰ（Selaginelline）制成脂肪乳剂、软膏剂或透皮控释贴剂等剂型时加入载体按药学常规方法制备得到。

本发明提供的具有抗真菌活性的化合物Ⅰ的制备方法，其包括以下步骤:

(1)取干垫状卷柏、粉碎，加入5～10倍量浓度为95%乙醇回流提取2～3次，每次2～3h，合并提取液，减压浓缩至无醇味，加水稀释后依次用石油醚、醋酸乙酯、水饱和正丁醇萃取，取醋酸乙酯萃取液减压回收溶剂，得醋酸乙酯总提物；

(2)取步骤(1)制备得到的醋酸乙酯总提物，上硅胶柱色谱，用体积比为95:5～50:50的氯仿:甲醇，依次梯度洗脱，薄层色谱检识，合并相同斑点的流分；再分别上硅胶柱色谱，用体积比为95:5～80:20的氯仿:甲醇梯度洗脱，薄层色谱检识，合并相同斑点的流分；再经反复SephadexLH-20柱色谱，以纯甲醇、甲醇-水为洗脱剂洗脱纯化，得到具有抗真菌活性的化合物Ⅰ。

经抗真菌活性实验表明，本发明从垫状卷柏中分离得到的化合物Ⅰ具有较强的抗真菌活性，可用于制备抗真菌的药物。

本发明所示的具有抗真菌活性的化合物Ⅰ在制备抗真菌药物中的应用，具体可用于防治念珠菌属、曲霉属或毛癣菌属真菌。

作为进一步的优选方案，本发明所述的具有抗真菌活性的化合物Ⅰ，用于防治真菌为白念珠菌、熏烟色曲霉、红色毛癣菌或须癣毛癣菌。

有益效果：本发明提供的具有抗真菌活性的化合物Ⅰ和现有技术相比具有以下优点：

本发明通过对垫状卷柏化学成分进行系统深入研究，经过波谱和质谱数据分析表明从垫状卷柏中分离得到新化合物Ⅰ。体外抗真菌活性研究表明，本发明提供的化合物Ⅰ(Selaginelline)对多种致病真菌，包括白色念珠菌、熏烟色曲霉、红色毛癣菌、须癣毛癣菌等具有明显的抑制作用。可开发成为新的抗真菌药物。且可方便制备成多种药物剂型，方便临床服用。另外本发明提供的制备方法，根据垫状卷柏所含化学成分的结构性质，进行科学优化，得到最佳的制备工艺。

附图说明

图1为本发明所提供的具有抗真菌活性化合物Ⅰ的结构示意图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1

(1)取干垫状卷柏、粉碎，加入10倍量浓度为95%乙醇回流提取3次，每次2h，合并提取液，减压浓缩至无醇味，加水稀释后依次用石油醚、醋酸乙酯、水饱和正丁醇萃取，取醋酸乙酯萃取液减压回收溶剂，得醋酸乙酯总提物；

(2)取步骤(1)制备得到的醋酸乙酯提取物（108g），上硅胶柱色谱，用体积比为95:5～50:50的氯仿:甲醇，依次梯度洗脱，薄层色谱检识，合并相同斑点的流分；再分别上硅胶柱色谱，用体积比为95:5～80:20的氯仿:甲醇梯度洗脱，薄层色谱检识，合并相同斑点的流分；再经反复SephadexLH-20柱色谱，以纯甲醇、甲醇-水为洗脱剂洗脱纯化，得到具有抗真菌活性的化合物Ⅰ(11mg)。

该化合物Ⅰ的化学结构及其编号如下：

本发明化合物Ⅰ为红色无定形粉末。高分辨质谱得该化合物Ⅰ精密质量数为510.16991[M+H]⁺，推算其分子式为C34H23NO4。化合物Ⅰ的1HNMR谱结合DQF-COSY显示该化合物Ⅰ五个自旋系统：δH8.28（1H，d，J=8.4Hz，H-16），7.66（1H，d，J=8.4Hz，H-17）；7.72（2H，d，J=8.4Hz，H-28/32），6.81（2H，d，J=8.4Hz，H-29/31）；6.46（4H，d，J=8.8Hz，H-2/6，H-9/11），7.10（4H，d，J=8.1Hz，H-3/5，H-8/12）；7.02（2H，d，J=8.4Hz，H-20/24），6.64（2H，d，J=8.4Hz，H-21/23）；分别属于A、B、C、D、E环。δH7.60（1H,s）、9.44（1H,s）处的单质子单峰分别为F环26位、34位的两个氢；

13C-NMR数据信号：C-1(180.2),C-2(122.3),C-3(136.6),C-4(129.8),C-5(136.6),C-6(122.3),C-7(157.2),C-14(136.2),C-15(126.1),C-16(129.6),C-17(129.9),C-18(144.5),C-19(134.3),C-20(130.3),C-21(115.5),C-22(157.4),C-24(130.3),C-25(131.0),C-26(112.2),C-27(151.9),C-28(128.2),C-29(116.2),C-30(158.9),C-34(153.1)。

实施例2抗真菌活性实验

1、本发明对化合物Ⅰ进行体外抗真菌试验，表明其具有较明显的抑制真菌的效果。试验所用细胞株均为卫生部医学微生物菌（毒）种保藏管理中心真菌中心提供ATCC标准菌株，其中包括：

念珠菌属：白念珠菌（Candidaalbicans）菌号：CMCCC(F)C.1L(ATCC90028)

曲霉属：熏烟色曲霉(Aspergillusfumigatus)菌号：CMCCC(F)A1g(ATCC-MYA-3626)

毛癣菌属：红色毛癣菌(Trichophytonrubrum)菌号：CMCCC(F)T.1h（ATCC-MYA-4438）

须癣毛癣菌（Trichophytonmentagrophytes）菌号：CMCCC(F)T.5e（ATCC-MYA-4439）

共计3属4种4株常见致病真菌。

2、具体实验方法参照美国临床和实验室标准化研究所(ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute,US,CLSI)颁布的酵母菌M-27A3和丝状真菌M-38P的标准方法进行实验。

3、实验方法：

菌液制备

实验前，将实验菌活化后，酵母菌在沙堡弱琼脂培养基（SDA）上，30℃培养48小时；丝状真菌在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上，26℃培养7-10天；用无菌生理盐水配成悬液，经血球计数板计数，用倍量含2%葡萄糖RMPI-1640液体培养基稀释成白念珠菌1.0×10³cfu/mL；其他三株丝状真菌配成2.5×10⁴cfu/mL。分别取菌液0.1mL，加入含有实施例1制备得到化合物Ⅰ的培养基到各孔中，11孔为溶媒对照，12孔为培养基对照。溶媒对照孔中加入0.1mL的稀释后的溶媒，对照孔中加入0.1mL的蒸馏水。加样完毕后，放在摇板机上，转速为100r/min×10min，使药物和菌液充分接触。以不含任何抗生素的含2%葡萄糖RMPI-1640液体培养基作为基础培养基。阳性对照药为氟康唑。

4、实验结果判定方法

80%最低抑菌浓度（80%MIC）：以空白对照和溶媒对照孔菌已生长为参照，药基孔中菌仅生长80%表示有抑菌作用，菌已生长表示无抑菌作用。具体实验结果如表1所示：

表1化合物Ⅰ对3属4种4株常见致病真菌80%MIC测定结果（单位是μg/mL）

由以上实验结果表明，本发明提供方法制备得到的新化合物Ⅰ具有很好的抗真菌效果。

实施例3实施例1所得化合物Ⅰ的急性毒性实验

按Bliss法计算小鼠半数致死量LD₅₀值，LD₅₀值为1.38mg/kg，实验结果表明本发明提供的化合物Ⅰ的急性毒性低。

实施例4片剂的制备

取上述实施例1制备得到的化合物Ⅰ加药用辅料淀粉、硬脂酸镁等适量，充分混匀后，压片，制成片剂口服使用。

实施例5胶囊剂的制备

取上述实施例1制备得到的化合物Ⅰ加药用辅料淀粉适量，充分混匀后，装入胶囊，制成胶囊剂口服使用。

以上实施方式只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人了解本发明内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所做的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims

1.具有抗真菌活性的化合物Ⅰ，其特征在于，其结构式如下：

2.具有抗真菌活性的化合物Ⅰ的制备方法，其特征在于包括以下步骤:

(1)取干垫状卷柏、粉碎，加入5～10倍量浓度为95％乙醇回流提取2～3次，每次2～3h，合并提取液，减压浓缩至无醇味，加水稀释后依次用石油醚、醋酸乙酯、水饱和正丁醇萃取，取醋酸乙酯萃取液减压回收溶剂，得醋酸乙酯总提物；

(2)取步骤(1)制备得到的醋酸乙酯总提物，上硅胶柱色谱，用体积比为95:5～50:50的氯仿:甲醇，依次梯度洗脱，薄层色谱检识，合并相同斑点的流分；再分别上硅胶柱色谱，用体积比为95:5～80:20的氯仿:甲醇梯度洗脱，薄层色谱检识，合并相同斑点的流分；再经反复Sephadex LH-20柱色谱，以纯甲醇、甲醇-水为洗脱剂洗脱纯化，得到具有抗真菌活性的化合物Ⅰ；

其结构式如下：

3.权利要求1所述的具有抗真菌活性的化合物Ⅰ在制备抗真菌药物中的应用。

4.根据权利要求3所示的具有抗真菌活性的化合物Ⅰ在制备抗真菌药物中的应用，其特征在于，所述的真菌为念珠菌属、曲霉属或毛癣菌属真菌。

5.根据权利要求3所示的具有抗真菌活性的化合物Ⅰ在制备抗真菌药物中的应用，其特征在于，所述的真菌为白念珠菌、熏烟色曲霉、红色毛癣菌或须癣毛癣菌。